從吉林省發(fā)生先天性關節(jié)彎曲-腦積水綜合征新生犢牛分離鑒定出阿卡班病毒

章 凡,古麗巴哈爾·圖爾蓀，常曉冉，王浴光，楊 麗，曹利利,郭昌明,郭 利，王新平*

(1.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062；2.吉林大學 教育部人獸共患病研究重點實驗室，吉林 長春 130062；3.人與動物共患傳染病國家重點實驗室，吉林 長春；4.吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院，吉林 長春 130062； 5.吉林農業(yè)科技學院 動物科技學院，吉林 吉林市 132109)

赤羽病,又名阿卡班病,是由阿卡班病毒(Akabane virus,AKAV)引起的一種新生犢牛臨床上四肢關節(jié)蜷縮彎曲,無法站立與最后死亡為特征傳染病，也是國內從國外進口牛、羊必須檢疫的7種疫病之一[1]。引起本病的病原體為布尼亞病毒科中的AKAV。懷孕牛、綿羊、山羊對該病毒易感,感染后能導致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)及先天性關節(jié)彎曲和腦積水征[2-4]。AKAV于1959年首次分離于日本群馬縣赤羽村的蚊子體內并命名[5],之后澳大利亞、韓國、肯尼亞、南非和以色列等國也相繼分離到AKAV[6]。據(jù)報道，臺灣地區(qū)于1997年從牛群中分離到AKAV[7]。國內于2010年從湖南省的蚊蟲體中分離得到了AKAV[8]，之后于2012年進行的流行病學調查顯示，新疆地區(qū)的牛羊群中普遍存在AKAV抗體[9]。2016年國內首次從山羊中分離出AKAV[10],但目前尚未見有從東北三省地區(qū)分離到牛源AKAV的報道。

2021年9月以來,吉林省許多地區(qū)發(fā)生了新生犢牛臨床上以先天性關節(jié)彎曲和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常為特征的疾病。本研究通過流行病學、病理學、病毒分離與電鏡觀察及分子生物學方法,確定出引起該疫病的病原體為AKAV。

1 材料與方法

1.1 流行病學調查與樣品采集針對吉林省今年9月份以來多地發(fā)生的不明病因的疫病,進行了現(xiàn)場流行病學調查，并從長春、延邊等地采集了發(fā)病犢牛的組織器官，同時現(xiàn)場觀察、記錄發(fā)病牛的臨床癥狀。

1.2 樣品處理將采集的組織以常規(guī)方法進行組織勻漿后，以12 000 r/min,4℃離心10 min。上清液以0.45 μm濾器過濾后，用于病毒的分離。

1.3 病原分離將處理的組織上清液接種單層MDBK,置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)感作2 h,棄去接種物,以Hanks緩沖液洗滌后,加入含有2%FBS的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。同時，以未接毒MDBK細胞作為陰性對照。 接毒后，定時觀察與記錄細胞變化,待細胞病變達到70%以上時，將細胞置于-20℃反復凍融3次,12 000 r/min離心5 min,收集上清液,盲傳5代后,置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒粒子的電鏡觀察將分離獲得的病毒以2%磷鎢酸負染后，進行電鏡觀察。

1.5 病料組織及細胞分離物中病原體的檢測以常規(guī)方法提取流產(chǎn)犢牛組織及接毒細胞的RNA,合成cDNA后,分別以AKAV、Schmallenberg病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛皰疹1型病毒等病原體的特異性引物進行病原基因片段擴增。PCR擴增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。

1.6 PCR擴增片段的及序列測定與分析PCR擴增出的基因片段直接進行序列測定或克隆到T-載體后進行序列測定。測定出的序列與GenBank序列進行比對分析。

2 結果

2.1 流行病學調查與臨床及病理學檢查結果對吉林省延吉某地的調查結果顯示，該地共計飼養(yǎng)有牛只約12 000頭,其中經(jīng)產(chǎn)母牛約7 000頭,品種多為西門達爾牛，占比90%左右。發(fā)病牛只多見于散在飼養(yǎng)農戶。飼養(yǎng)方式和場地多種多樣,包括山上和林場自由放牧、牛棚飼養(yǎng)等。配種多采取冷凍精液人工配種,種牛精液多來源于同一種牛,該種牛由國外引進。該地于今年9月發(fā)現(xiàn)首例病例,臨床表現(xiàn)為初生牛犢部分四肢關節(jié)呈蜷縮狀,無法伸直,母牛無明顯癥狀,截至目前累計發(fā)生28例。同一母牛產(chǎn)出的同一批次犢牛發(fā)病情況不同。一起病例中，同生雙胎犢牛1頭無明顯癥狀，1頭癥狀明顯；病例二中，母牛同時生產(chǎn)出1頭四肢關節(jié)均呈現(xiàn)彎曲和1頭僅1個關節(jié)發(fā)病的犢牛。該地以往養(yǎng)牛只無重大疾病史,沒有發(fā)生大規(guī)模牛傳染病的流行記錄,同地羊和鹿未見有類似癥狀。

病理剖檢可見內臟器官尤其心臟表面有多量出現(xiàn)斑點，腦部皮下見有明顯出血斑、點，腦內有多量積液、出血，腸黏膜可見有點狀出血。依據(jù)流行病學情況、臨床癥狀與病理剖檢的結果，初步確定新生犢牛發(fā)生的疫病為先天性畸形與腦水腫。

A,B.新生犢牛關節(jié)腫脹、彎曲，無法站立；C.病死犢牛病理剖檢可見心臟表面有多量出現(xiàn)點;D.腦部皮下有出血斑、點，腦內有大量積液、出血

2.2 病原的分離與初步鑒定將處理后的組織樣品接種MDBK細胞,結果從農安與延吉采集流產(chǎn)犢牛的組織接種細胞后均可產(chǎn)生規(guī)律性的細胞病變(圖2)。分離獲得的毒株分別命名為JL-AKA-CC21-1株、JL-AKA-CC21-2株和JL-AKA-YJ21株。

A.正常細胞對照; B～D.毒株引起的病變,可以觀察到細胞聚集,后期脫落死亡(40×)

2.3 電鏡觀察結果將病毒分離物處理后取上清液進行負染電鏡觀察，結果觀察到大量大小為70～130 nm的疑似為布尼亞病毒粒子 (圖3)。觀察到的細胞分離毒與從病死動物組織中觀察的病毒一致。

圖3 電子顯微鏡負染觀察分離獲得的病毒粒子(比例尺為100 nm)

2.4 PCR擴增出病毒的基因片段應用AKAV的特異性引物序列及梯度PCR擴增分離病毒株的基因組序列，結果獲得預期大小的基因片段(圖4)。而應用PCR對采集的流產(chǎn)犢牛組織樣品及病毒分離株進行了Schmallenberg病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛皰疹1型病毒檢測,結果未檢出Schmallenberg病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛皰疹1型病毒的基因片段 (PCR結果略)。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照;2～5.部分樣品的擴增結果

2.5 病毒序列的測定及分析將上述擴增出基因片段進行序列測定并與GenBank中的序列進行比對分析，結果顯示分離毒株為AKAV。

3 討論

A.AV屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)正布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)辛波(Simbu)病毒血清群中的一個亞群,是引起牛、山羊和綿羊臨床上以流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎及新生牛羊積水性無腦癥和先天性關節(jié)彎曲為特征的蟲媒病毒性傳染病的病原體。動物妊娠早期感染會導致大腦和脊髓的中度至重度發(fā)育不良，妊娠后期的感染會導致腦脊髓炎。成年動物感染呈亞臨床類型。

本研究針對吉林省多地區(qū)發(fā)生的臨床上以先天性關節(jié)炎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常為特征的疾病,通過流行病學調查、病毒分離與電鏡觀察及分子生物學檢測,確定出引起此次疫病的病原為AKAV。為了排除其他引起新生犢牛先天性畸形的病原體，我們應用PCR同時檢測Schmallenberg病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛皰疹1型病毒，結果病死動物組織和病毒分離物中均未檢測出相應病毒的基因片段，進一步確定了AKAV是引起吉林省新生犢牛先天性畸形與腦積液綜合征的病原體。

病毒分離的成功與否直接決定了該病后期診斷方法的建立與疫苗的研發(fā)。本研究應用MDBK細胞成功分離出AKAV，接毒細胞產(chǎn)生規(guī)律的細胞病變，同時應用Vero和BHK細胞也進行了病毒的分離，結果接毒細胞呈現(xiàn)類似的細胞病變，該結果將為后期病毒的大規(guī)模培養(yǎng)與疫苗的研發(fā)提供了前提。

阿卡班病廣泛分布于亞洲和非洲的熱帶和溫帶地區(qū)，在國內屬于新發(fā)傳染病。本課題組進行的流行病學調查中發(fā)現(xiàn),延吉等地雨水降水量較高,有利于蚊蟲繁殖與該病的傳播,與布尼亞病毒疫情增多情況可能有關。此外，吉林省多地發(fā)生的疫情多始于今年9月份至秋冬季,有別于常規(guī)的蟲媒傳播疾病的傳播季節(jié),一方面可能是蟲媒在夏季活躍季節(jié)感染懷孕母牛，導致9～12月出現(xiàn)發(fā)??；另一方面，多個地方母牛配種采取冷凍精液人工配種,且種牛精液均來源于由國外引進同一種牛,這也可能造成本病的傳播。疫情是否可以通過人工授精進行傳播，需要對相關人工授精站的精液進行檢測和進一步的流行病學跟蹤調查。

本研究從吉林省多地發(fā)生的新生犢牛先天性關節(jié)彎曲-腦積水征病例中檢測出AKAV，確定出該病毒是新生犢牛先天性關節(jié)畸形和中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形的潛在病原體,為吉林省預防和控制該疾病提供了依據(jù)。