去泛素化酶UL36的抑制劑LDN57444抑制馬立克氏病病毒的增殖

王文婧，范青松，劉宇航，王 婷，鄧國輝，謝知航，王夢涵，呂 巖，許家翠，艾永興

(吉林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130062)

馬立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)血清Ⅰ型致病性強(qiáng)毒株(virulent)可引起雞發(fā)生馬立克氏病(Marek's disease,MD)，感染雞主要表現(xiàn)為多臟器的多發(fā)性腫瘤及病毒侵害神經(jīng)系統(tǒng)引起的神經(jīng)麻痹[1]。MDV常通過粉塵經(jīng)呼吸道進(jìn)入雞機(jī)體，感染B淋巴細(xì)胞引起感染性裂解，且易感T淋巴細(xì)胞，在T淋巴細(xì)胞中增殖，并浸潤傳播致全身，引起多臟器的腫瘤，侵害神經(jīng)細(xì)胞，入侵羽毛囊細(xì)胞經(jīng)包裝釋放具有傳染性的完整病毒顆粒。此外，MDV在感染過程中也造成雞免疫系統(tǒng)受損，并常誘發(fā)其他病原體的合并感染，進(jìn)而加重病情引起死亡[1]。MDV血清Ⅱ型和血清Ⅲ型毒株SB-1和HVT最早被開發(fā)成MD疫苗，可成功地預(yù)防MD的發(fā)生[2-3]。而血清Ⅰ型毒株如CVI988/Rispens株與814株被開發(fā)成疫苗使防御MD更加有效[2-3]。不過這些疫苗只能防止MD癥狀的出現(xiàn)，卻不能阻止MDV對雞的感染以及MDV在雞細(xì)胞內(nèi)的增殖、變異、成熟和釋放，從而使疫苗免疫雞成為新的傳染源。同時，經(jīng)過這種免疫壓力和不斷的循環(huán)淘汰，目前也已出現(xiàn)了毒力更強(qiáng)的超強(qiáng)(very virulent，vv)和超超強(qiáng)(very virulent plus，vv+)MDV毒株[2-5]。這些vv和vv+型毒株可引發(fā)感染雞在腫瘤癥狀還未出現(xiàn)就發(fā)生急性死亡[2-3,6]，而經(jīng)典的SB-1和HVT兩種MD疫苗的單用或合用均已無法抵御這些強(qiáng)毒，最有效的CVI988/Rispens疫苗免疫雞群也常有再次暴發(fā)MD的報道[6-7]。另外，已有多例報道，MDV還可與其他禽類的病毒發(fā)生重組形成新型毒株，這些情況使得MD的防御更加困難[8-10]。因此，增強(qiáng)MD的防御效果除了加強(qiáng)新型疫苗的研發(fā)，研制可直接抗MDV的藥物以彌補(bǔ)MD疫苗的短板與加強(qiáng)MD疫苗防御效果，是養(yǎng)禽業(yè)防御MD的重要任務(wù)。

根據(jù)MD疫苗防御機(jī)制以及MDV感染與致病機(jī)制，可推斷，抑制MDV的感染或阻斷MDV在細(xì)胞內(nèi)的生命進(jìn)程，如在MDV感染早期或在T細(xì)胞內(nèi)的潛伏期即扼制MDV的增殖，不但可以減少或防止MDV引起的B細(xì)胞增殖性裂解，也可阻止經(jīng)T細(xì)胞浸潤在各組織臟器間的傳播。由于疫苗接種需要經(jīng)數(shù)日“窗口期(interval)”方可產(chǎn)生免疫效果，因而這段時間對于MDV的早期感染增殖具有重要意義[11]，而使用化學(xué)藥物彌補(bǔ)疫苗接種 “窗口期”以及扼制細(xì)胞內(nèi)病毒的增殖是最迅速、最直接的手段。近年來，也有使用化學(xué)藥物防御MD的研究[12-14]。隨著MDV致病機(jī)制的逐漸闡明，可利用的靶點(diǎn)也不斷被發(fā)現(xiàn)，其中，MDV編碼的病毒型去泛素化酶UL36與MDV的增殖、成熟、致病等過程密切相關(guān)[15-16]。通過突變破壞其去泛素化酶活性可以降低MD的發(fā)生率，減少M(fèi)DV水平傳播[16]。研究發(fā)現(xiàn)，UL36的N端去泛素化酶片段(包含催化結(jié)構(gòu)域和核定位信號的480個氨基酸片段，UL36-480)具有去泛素化酶活性[17]，且UL36-480片段在所有致病型MDV株中完全一致，與非致病血清Ⅱ型和Ⅲ型毒株則完全不同，與宿主雞的所有去泛素化酶的氨基酸序列也完全不同[17]，這些發(fā)現(xiàn)為將UL36-480作為靶點(diǎn)用于抗MDV研究提供了可靠的依據(jù)。為提高中靶幾率，本研究選擇蛋白酶抑制劑庫為初篩庫，經(jīng)高通量篩選出對UL36-480活性具有抑制作用的化合物L(fēng)DN57444，并在細(xì)胞和動物水平確定出LDN57444對MDV增殖的抑制作用，該發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研制抗MD藥物提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、細(xì)胞和毒株9～10日齡SPF雞胚與1日齡SPF雛雞購于北京Boehringer Ingelheim生物技術(shù)有限公司；MDV-J1株購于北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，液氮保存。

1.2 主要試劑與儀器蛋白酶抑制劑初選庫購于MCE(中國)皓元生物公司；Ub-Rhodamine110底物為R&D公司產(chǎn)品；UL36-480去泛素化酶和去泛素化酶切反應(yīng)緩沖液10×Reaction Buffer(500 mmol/L HEPES，1 g/L BSA，5 mmol/L EDTA，10 mol/L DTT)由本實(shí)驗(yàn)室制備[17]；常用分析純化學(xué)試劑均購于鼎國公司和Sigma-Aldrich公司； CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒為Abace生物公司產(chǎn)品；DMEM、SYBR GreenERTMqPCR SuperMix Universal試劑盒、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)26610、Gibco胎牛血清(FBS)和DNA聚合酶等為Thermofisher公司產(chǎn)品；E.Z.N.A.Viral DNA Kit為OMEGA公司產(chǎn)品；雞淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笕A科生物公司產(chǎn)品；6,96和384孔板為Corning公司產(chǎn)品；多功能微孔板酶標(biāo)儀-Infinite 200 PRO由TECON公司生產(chǎn)。

1.3 載體和引物用于MDV 基因組定量分析的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為前期研究構(gòu)建[17]，包含有UL36的N端去泛素化酶480個氨基酸片段(UL36-480)的質(zhì)粒pFAST-Bac1-UL36-500。用于定量PCR分析用引物由Genewiz公司合成(UL36 F：5′-AGTCCTGCGTCTTCAGTT-3′和UL36 R：5′-CAGAAG-TCGCTATTGTCC-3′)。

1.4 對UL36-480具有抑制作用化合物的篩選以UL36-480酶解Ub-Rhodamine110底物反應(yīng)體系為基礎(chǔ)[17]，以化合物濃度低于114 μmol/L對UL36-480的去泛素化酶水解反應(yīng)具有抑制作用，視為有效抑制作用[18]；反應(yīng)程序?yàn)?，?84微孔反應(yīng)板上，先將每孔加入不同化合物≤114 μmol/L、3.5 nmol/L UL36-480、2 μL 10×Reaction Buffer，加超純水至18 μL，在4℃孵育1 h， 然后每孔同時補(bǔ)加2 μL 終濃度為0.6 μmol/L的Ub-Rhodamine110振蕩混均，再置于多功能微孔板酶標(biāo)儀上檢測熒光。篩選出對UL36-480酶反應(yīng)有抑制作用的化合物，再對篩選出的化合物進(jìn)行梯度稀釋，以確定可抑制UL36-480活性化合物的最低有效濃度。

1.5 LDN57444對UL36-480的酶抑制動力學(xué)分析根據(jù)上述高通篩選，本研究確定使用4 μmol/L濃度的LDN57444，此條件下對UL36-480的活性具有顯著的抑制作用。抑制動力學(xué)分析反應(yīng)體系，應(yīng)用不同濃度(0.1,0.2,0.4,0.6,0.7，0.8 μmol/L)熒光底物Ub-Rhodamine110，UL36-480終濃度為3.5 nmol/L，再加入上述10×Reaction Buffer，補(bǔ)滅菌超純H2O至100 μL。反應(yīng)條件：先將不含Ub-Rhodamine110但包括LDN57444與UL36-480等所有反應(yīng)成分的體系在4℃孵育1 h，然后37℃孵育2 min恢復(fù)反應(yīng)所需溫度，每孔加入等體積但不同濃度的Ub-Rhodamine110后快速混均，將反應(yīng)孔板置于讀板儀上檢測熒光值。檢測數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件計算各動力學(xué)參數(shù)并擬合相應(yīng)曲線，根據(jù)抑制前后的Vmax和Km值分析LDN57444對UL36-480的抑制方式。對于非競爭性抑制按公式Ki=[I]/(Vmax/Vmaxinh-1)計算Ki值，其中Vmaxinh為含有抑制劑時UL36-480的最大反應(yīng)速度，Vmax為無抑制劑情況下的最大反應(yīng)速度，[I]抑制劑濃度，Ki為抑制常數(shù)[19]。應(yīng)用Cheng-Prusoff方程和Ki值換算出IC50(50%酶活性被抑制時化合物濃度)[20-21]，對于非競爭性抑制使用公式IC50=Ki(1+Km/[S])，其中[S]為底物濃度，Km為米氏常數(shù)。

1.6 LDN5744與UL36-480互作分析首先應(yīng)用Modeller(v10.2)(https://salilab.org/modeller)對UL36-480進(jìn)行建模，然后將產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)文件進(jìn)行去除水分子、加氫、修飾氨基酸、優(yōu)化能量和調(diào)整力場參數(shù)等常規(guī)處理，導(dǎo)出PDB文件。從Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取LDN57444化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)文件，并應(yīng)用Discovery Studio 2019轉(zhuǎn)換成mol2格式文件。應(yīng)用AutoDock Vina (v.1.2.0) ( https://vina.scripps.edu)對這兩個文件進(jìn)行分子對接，分析互作位點(diǎn)、互作力以及最低結(jié)合能。分析結(jié)果導(dǎo)出成PDB文件，應(yīng)用Discovery Studio 2019進(jìn)行結(jié)合面、互作力分析以及可視化展示，并制圖。

1.7 LDN57444對CEF細(xì)胞安全濃度確定CEF細(xì)胞根據(jù)常規(guī)方法從9～10日齡的SPF雞胚分離制備[22]。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔鋪入3×104個CEF細(xì)胞，用培養(yǎng)基將LDN57444稀釋成濃度梯度(1～100 μmol/L)，待細(xì)胞貼壁后更換含有梯度濃度LDN57444的培養(yǎng)基，終體積為至100 μL，37℃培養(yǎng)3 d。用顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，并參照CCK8使用說明，每個處理孔分別加10 μL的 CCK8檢測液，于37℃孵育2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測450 nm的吸光值，計算細(xì)胞活力，應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。根據(jù)通用標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞活力>90%視為無顯著影響[23]，用于判斷LDN57444對CEF細(xì)胞的毒性。

1.8 LDN57444對MDV的CPE的影響取新鮮制備的CEF細(xì)胞按106個/孔濃度鋪入6孔板，過夜培養(yǎng)至貼壁形成單層后，將給藥組培養(yǎng)基分別更換為含有不同濃度LDN57444的培養(yǎng)基，對照組更換為含等體積的DMSO但無LDN57444培養(yǎng)基，以20 PFU/每孔接MDV-J1毒株，3 d后在顯微鏡下觀測MDV的CPE數(shù)量和面積等參數(shù)。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析作圖，每個處理3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.9 細(xì)胞水平LDN57444對MDV增殖的影響首先將質(zhì)粒pFAST-Bac1-UL36-500濃度換算成拷貝數(shù)濃度，換算公式如下：拷貝數(shù)濃度(copy/μL)=質(zhì)粒質(zhì)量濃度(g/μL)÷質(zhì)粒相對分子質(zhì)量×NA(阿伏伽德羅常數(shù))，再以梯度拷貝數(shù)(103,104,105,106,107,108，109)質(zhì)粒作為模板進(jìn)行Q-PCR。以拷貝數(shù)的log值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程，每個處理進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。具體反應(yīng)條件參考Q-PCR試劑盒說明。細(xì)胞中MDV基因組DNA的提取方法參照試劑盒明書進(jìn)行，每個孔細(xì)胞的全程處理?xiàng)l件保持一致。對每孔所提取的基因組DNA取等體積(0.5 μL)作為模板，應(yīng)用上述定量引物進(jìn)行Q-PCR，應(yīng)用擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程將所檢測的各組Ct值換算成拷貝數(shù)，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.10 LDN57444對雞體內(nèi)MDV增殖的影響取1日齡SPF雛雞隨機(jī)分為3組，每組5只，隔離飼養(yǎng)，均在1日齡按100 PFU/只經(jīng)腹腔接種MDV-J1毒。根據(jù)前期藥物安全劑量預(yù)試驗(yàn)結(jié)果并參考相關(guān)文獻(xiàn)[24-25]，其中兩組分別每日腹腔給藥0.1 mg/kg和0.5 mg/kg的LDN57444的雞為試驗(yàn)組，無藥物處理只腹腔注射等量滅菌生理鹽水(含等量DMSO)為對照組，給藥至第14天。雞均在第21天采集雞外周抗凝血，按照雞淋巴細(xì)胞分離液說明書分離T淋巴細(xì)胞，每組取104個T淋巴細(xì)胞提取基因組，參照1.9步驟進(jìn)行Q-PCR檢測分析。

2 結(jié)果

2.1 LDN57444抑制UL36-480的去泛素化酶活性從3 000多個蛋白酶抑制中篩選出LDN5744可在遠(yuǎn)低于114 μmol/L濃度條件下抑制UL36-480的去泛素化酶活性。應(yīng)用終濃度4 μmol/L的LDN57444作為酶抑制反應(yīng)動力學(xué)分析抑制劑嘗試，分析對3.5 nmol/L的UL36-480酶活性的抑制作用(如圖1)，在無抑制劑條件下，UL36-480的Vmax為4.022 nmol·L-1·s-1，Km為0.691 μmol/L；在應(yīng)用4 μmol/L的LDN57444處理后，UL36-480的Vmaxinh為2.515 nmol·L-1·s-1，Km為0.685 μmol/L，據(jù)此判定LDN57444對UL36-480的抑制屬于非競爭性抑制。經(jīng)公式計算，LDN57444對UL36-480的抑制常數(shù)Ki值為6.68 μmol/L，IC50為3.10 μmol/L。

左圖.米氏方程曲線；右圖.雙倒數(shù)擬合曲線。V.初始反應(yīng)速度；[S].底物濃度；UL36-480.無抑制劑處理組；LDN57444.LDN57444處理組

2.2 LDN57444與UL36-480分子互作經(jīng)對UL36-480同源建模，再與LDN57444進(jìn)行分子對接，篩選出對接的結(jié)合能最低為-28.9 kJ/mol，蛋白質(zhì)在模擬過程中的構(gòu)象與初始構(gòu)象之間的位置變化均方根誤差(RMSD)=0。根據(jù)互作分析可見，LDN57444與UL36-480的互作位置位于UL36-480的C端一側(cè)的結(jié)構(gòu)域，并不與UL36-480的N端催化活性中心直接互作，這一發(fā)現(xiàn)與上述抑制動力學(xué)分析所得的非競爭性抑制結(jié)果相吻合(圖2A)。根據(jù)互作面分析可見，LDN57444位于UL36-480的C末端由ILE301、PRO329、ARG330、LYS333、THR404、HIS405、VAL449、ARG464、ASN465、AYR466形成的口袋中(圖2B)。進(jìn)一步的分子作用力揭示，LDN57444主要與UL36-480的ARG-464和HIS-405形成氫鍵(hydrogen band)作用，與VAL-449形成Pi-Sigma作用，與TYR-466形成Pi-Pi堆積作用，與ILE-301形成Pi-Alkyl作用進(jìn)而抑制UL36-480的活性(圖2C，D)。

2.3 LDN57444抑制MDV在CEF細(xì)胞中的復(fù)制應(yīng)用CEF細(xì)胞確定了LDN57444對細(xì)胞的安全濃度，CCK8法分析發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中含小于30 μmol/L LDN57444的條件下，細(xì)胞活力大于90%(如圖3)，因此，后續(xù)LDN57444的細(xì)胞水平試驗(yàn)使用低于30 μmol/L 的藥物濃度。應(yīng)用5 μmol/L和20 μmol/L 的LDN57444處理MDV致CEF的CPE，鏡下可見CPE數(shù)量減少，面積減小(圖4)。對每個處理孔中所有CPE的總面積進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與無藥物處理組(對照組)相比，LDN57444顯著抑制CPE的形成(P<0.01)，對照組CPE平均122個，而LDN57444處理組的CPE個數(shù)和CPE平均面積都顯著低于對照組(表1，P<0.01)。應(yīng)用含有UL36基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行拷貝數(shù)梯度稀釋，進(jìn)行定量PCR，并與Ct之間建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=43.131-1.702ln(x)，其中y為Ct值，x為拷貝數(shù)[26]。應(yīng)用各處理組細(xì)胞的基因組作為模板，并進(jìn)行定量PCR，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算各處理孔中MDV的拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5,20 μmol/L的LDN57444處理的MDV拷貝數(shù)顯著低于對照組(P<0.01)，分別下降39倍和2 679倍(表2)。說明在CEF細(xì)胞中MDV的增殖受LDN57444的顯著抑制。

圖3 不同濃度LDN57444條件下CEF細(xì)胞活力分析

A.無LDN57444處理的對照組；B.5 μmol/L LDN57444處理組；C.20 μmol/L LDN57444處理組

表1 LDN57444對MDV致CEF細(xì)胞CPE形成的影響

表2 LDN57444對CEF細(xì)胞中MDV增殖的影響

2.4 LDN57444抑制MDV在雞體內(nèi)的復(fù)制如果如表3所示,與對照組相比，LDN57444處理組的T細(xì)胞中MDV基因組拷貝數(shù)顯著降低(P<0.01)，0.1 mg/kg LDN57444給藥組降低了29倍，0.5 mg/kg LDN57444給藥組降了1 315倍，表明應(yīng)用LDN57444藥物處理可顯著抑制 MDV 在雞體內(nèi)的增殖。

表3 LDN57444對MDV在T淋巴細(xì)胞中復(fù)制的影響

3 討論

泛素化修飾及其調(diào)控機(jī)制涉及細(xì)胞幾乎所有的生命進(jìn)程和活動，包括染色質(zhì)重塑與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫與炎癥調(diào)節(jié)、各種病原感染與致病、細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控等等[27]。而泛素化修飾與去修飾過程是由泛素化修飾3種酶與去泛素化酶調(diào)節(jié)反應(yīng)的平衡，任何因素打破這種平衡都可能會引起疾病。而許多病原體也可以通過掌控宿主細(xì)胞的這種調(diào)控機(jī)制為自身的生命進(jìn)程服務(wù)，如感染、增殖、成熟、釋放等過程[27]。很多病原體本身也編碼泛素化相關(guān)酶和去泛素化酶，但這些病原體的酶類與宿主細(xì)胞并無序列和結(jié)構(gòu)上的同源性，從而使這些病原體更易逃避宿主的免疫識別與清除，而當(dāng)許多研究揭示這些病原體的致病機(jī)制時，這些酶也便成為了可用于研發(fā)藥物的靶點(diǎn)[17,19,28-33]。因此，多年來，隨著泛素化修飾與去修飾研究的進(jìn)展，相應(yīng)的藥物研發(fā)也同步進(jìn)行，以期盡早獲得更有效的靶向藥物。

在抗病毒研究方面，研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV 編碼的PLpro是一種病毒型的去泛素化酶，6MP和6TG可以通過抑制PLpro的去泛素化酶活性進(jìn)而用作抗SARS-CoV 的藥物[34]。而在SARS-CoV-2冠狀病毒編碼的3Clpro酶同樣也可作為抗病毒抑制劑篩選的臨床研究[35]。HIV-1酶也是作為抗HIV藥物的篩選靶點(diǎn)，利用該靶點(diǎn)篩選出的特異性藥物saquinavir已經(jīng)用于臨床，同時還篩選出了具備抗腫瘤和抗HIV的抑制劑ritonavir[36]。而化合物PR-619可抑制血吸蟲編碼的去泛素化酶SmUSP9x的表達(dá)以及蟲源泛素E3連接酶SmSmad2的活性，從而抑制寄生蟲的產(chǎn)卵，導(dǎo)致線粒體變化，自噬體形成，因此，靶向蟲源的去泛素化酶可為從全新角度開發(fā)抗血吸蟲病新藥拓展了思路[37]。

M.V編碼的UL36是MDV結(jié)構(gòu)中一種分子量較大的被膜蛋白，由MDV的MDV049基因編碼，該蛋白包含3 000多個氨基酸，但感染宿主細(xì)胞后卻以N端約70 kDa的長度存在，其機(jī)制目前還不清楚[38]。此片段包含去泛素化酶活性中心(UL36-USP)，而其N-端480個氨基酸片段同時還包含一個核定位信號序列[38]，這種催化活性結(jié)構(gòu)域在大部分皰疹病毒中均存在，不過在MDV的致病毒株與非致病毒株之間，氨基酸序列卻不相同，UL36-USP的催化活性對病毒的感染、復(fù)制和成熟等過程具有重要作用[39-40]。MDV編碼的UL36的C98是其催化活性中心位點(diǎn)，附近的Q85、L106、D232和H234這4個位點(diǎn)對UL36的去泛素化酶活性也至關(guān)重要，這些位點(diǎn)的突變均可破壞MDV的致瘤作用，阻止MDV在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖，病毒顆粒成熟受阻，傳播能力下降[41]。由于UL36去泛素化酶活性片段在所有血清Ⅰ型的致病毒株中完全保守[42]，因此，UL36的N端去泛素化酶片段(UL36-480)可作為抗MDV藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。

根據(jù)上述研究策略，本研究與公司合作初步應(yīng)用蛋白酶抑制劑庫建立初篩庫，并由公司合成，使用384孔板的微量特點(diǎn)結(jié)合靈敏的特異熒光底物反應(yīng)，快速篩選出LDN57444對UL36-480具有顯著的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)LDN57444是泛素C端水解酶UCH-L1和UCH-L3抑制劑，LDN57444可通過抑制UCH-L1調(diào)節(jié)自噬途徑進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞中α突觸核蛋白(alpha-synuclein)，因此，被認(rèn)為在帕金森病(Parkinson's disease，PD)發(fā)生發(fā)展過程起到調(diào)節(jié)作用，可以作為PD的靶向藥物[43-45]。LDN57444還對肺癌H1299細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用[46]。LDN-57444 也可以通過抑制 UCHL1減弱小鼠房顫[25]，通過調(diào)節(jié)HIF-1α信號通路保護(hù)缺血性心臟損傷[47]。LDN57444 還可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和線粒體功能以及降低 ERK1/2 表達(dá)來阻礙小鼠卵母細(xì)胞成熟[48]。LDN57444通過抑制UCH-L1和UCH-L3活性調(diào)節(jié)抗凝血酶蛋白表達(dá)量進(jìn)而用于血友病一類凝血疾病的治療[49]。目前有關(guān)LDN57444的報道主要集中于通過抑制UCH-L1活性進(jìn)行調(diào)節(jié)與自噬、抗氧化等相關(guān)通路的作用，還未見任何有關(guān)抗病毒的研究報道。而本研究從數(shù)千個化合物中篩選到LDN57444可抑制MDV編碼的UL36的去泛素化酶活性，也是本研究領(lǐng)域首次發(fā)現(xiàn)，為LDN57444作為抗病毒靶向藥物研究開辟了新思路。同時為揭示這些病毒編碼的蛋白活性特點(diǎn)，闡明其對宿主細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，對于理解病毒致病機(jī)制，研發(fā)靶向藥物提供了重要依據(jù)。

雞細(xì)胞內(nèi)含有數(shù)百種去泛素化酶，目前已報道LDN57444可抑制人的UCH-L1活性進(jìn)而影響相關(guān)的調(diào)節(jié)通路，有研究發(fā)現(xiàn)UCH-L1屬于癌基因有助于細(xì)胞惡性增殖，并且在KSHV 和EBV等病毒感染時會表達(dá)量升高[50]。雞與人的UCH-L1在氨基酸序列上只有75%保守性，目前還不清楚LDN57444是否也可抑制雞的UCH-L1活性，并參與了抑制MDV在雞細(xì)胞內(nèi)增殖及致病的作用。除了抑制MDV的UL36，是否還通過抑制細(xì)胞內(nèi)其他去泛素化酶或其他類型的酶進(jìn)而抑制MDV在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖，還需要進(jìn)一步的研究予以揭示。在MD雞模型水平的研究發(fā)現(xiàn)，使用LDN57444可顯著抑制MDV在雞T細(xì)胞內(nèi)的增殖，雞內(nèi)臟并未出現(xiàn)MD的病變，但可見肝臟、腎臟及腸道有少量出血，因?yàn)樵趯φ战M并未見這種現(xiàn)象，因此，這種病變可能與LDN57444毒性有關(guān)。因此，進(jìn)一步研究分析此病變的原因以及LDN57444在動物水平的毒理學(xué)，可為LDN57444在未來的臨床使用提供重要依據(jù)。

LDN57444除了可抑制人的UCH-L1和UCH-L3以及本研究中MDV編碼的UL36，是否也能抑制其他動物病毒的去泛素化酶，目前還未見報道，因此，本研究提供的研究方法及研究結(jié)果也可為其他動物病毒病的靶向藥物研究提供參考。