2018—2020年豫南地區(qū)豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析

曲哲會，張喜文，董建國，劉 濤，趙云煥，2，3，郭曉秋*，李 穎，許琬雪，李盼盼,李卓燕

(1.信陽農(nóng)林學院 牧醫(yī)工程學院，河南 信陽 464000；2.河南省大別山區(qū)生態(tài)畜禽健康生產(chǎn)工程研究中心，河南 信陽 464000；3.信陽市畜禽養(yǎng)殖與環(huán)境控制重點實驗室，河南 信陽 464000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，以嘔吐、水樣腹瀉及脫水為主要臨床表現(xiàn)[1]。各種年齡豬群均可以被PEDV感染，新生仔豬發(fā)病尤為嚴重，死亡率可達50%～100%。該病1976年被首次報道[2]，經(jīng)典疫苗毒株CV777的廣泛使用，該病得到有效控制[3]。但是，2010年我國多個省市地區(qū)發(fā)生嚴重的PEDV疫情，尤其是免疫CV777疫苗毒株的豬群也同樣發(fā)生，給養(yǎng)殖場造成了巨大的經(jīng)濟損失[4-6]。同期，美國、韓國、日本等多個國家也同樣發(fā)生該病的流行[7-9]。

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬的冠狀病毒Ⅰ群成員。PEDV的基因組為RNA，約28 kb，共編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，即S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白；非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3和pp1ab(可裂解為16種非結(jié)構(gòu)蛋白)[2]。S蛋白是PEDV的表面糖蛋白，在PEDV入侵宿主細胞及誘導機體產(chǎn)生中和抗體方面發(fā)揮重要作用[10]。S蛋白可分為S1蛋白(1～789 aa)和S2蛋白(790～1 383 aa)，其中S1蛋白包括了主要中和抗原表位及受體結(jié)合區(qū)域。S蛋白在外界環(huán)境與條件壓力下極易發(fā)生基因突變、插入與缺失，因此，對PEDV的S基因進行遺傳變異分析對于掌握PEDV流行株的分子遺傳特征具有十分重要的意義[11]。ORF3蛋白是PEDV的唯一輔助性蛋白，其基因極其不穩(wěn)定，容易發(fā)生變異而導致基因多態(tài)性，已發(fā)現(xiàn)弱毒株常發(fā)生連續(xù)17 aa的缺失，也成為區(qū)別弱毒株和強毒株的重要標記。此外，ORF3蛋白可促進PEDV在感染細胞中增殖[12-13]。N蛋白是一種由大部分堿性氨基酸組成的磷酸化核衣殼蛋白，基因核苷酸序列相對穩(wěn)定，對病毒的組裝與復制起著重要作用[14]。

為掌握2018—2020年豫南地區(qū)流行的PEDV的分子遺傳特征，本研究從18個規(guī)?；i場采集PEDV感染仔豬組織擴增出S1基因部分片段、ORF3基因和N基因，并進行核苷酸序列測定，通過與已發(fā)表參考序列進行氨基酸進化樹構(gòu)建、相似性及變異分析，可為該地區(qū)PEDV的防控提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 病料PEDV感染的仔豬腸道、內(nèi)容物和腸系膜淋巴結(jié)，采自2018—2020年間豫南地區(qū)18個規(guī)模豬場，由本實驗室保存。

1.2 試劑病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；2×Taq Master Mix購自上?；萘枭锛夹g(shù)有限公司；DL2000 DNA Marker、50×TAE核酸電泳液購自生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂糖購自廣州賽國生物科技有限公司；氯化鈉、氯仿、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計與合成參照文獻[15]，直接合成可用于擴增PEDV的S1基因部分片段(編碼S氨基酸464～792片段)和包含ORF3基因的引物。根據(jù)PEDV YZ株(MK841495.1)的核苷酸序列作為參考序列，利用軟件Primmer 5.0設(shè)計N基因擴增引物，具體引物序列見表1。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR擴增引物序列

1.4 病料的處理將從18個豬場采集的仔豬小腸、內(nèi)容物和腸系膜淋巴結(jié)剪碎后研磨，用無菌生理鹽水按照1∶5稀釋，反復凍融3次后， 4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。

1.5 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄利用DNA/RNA提取試劑盒從處理后的樣品中提取基因組RNA，具體過程按照說明書進行。以提取的RNA為模板，利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系(20 μL)：RI 1 μL，RT 1 μL，Re Buffer 4 μL，dNTP 2 μL，OligodT181 μL，RNA 11 μL。反轉(zhuǎn)錄程序:42℃ 60 min，70℃ 5 min，冰浴5 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PEDV的S、ORF3和N基因擴增與測序以合成cDNA為模板，分別擴增PEDV的S1基因部分片段、包含有ORF3基因片段和N基因。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×Taq MasterMix 25.0 μL，引物S1-S(或ORF3-S、N-S) 1.0 μL，引物S1-A(或ORF3-A、N-A) 1.0 μL，cDNA 4.0 μL，ddH2O 19.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預變性5 min；95℃變性 30 s,52℃退火 30 s,72℃延伸1 min 30 s,共35個循環(huán);72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行核苷酸序列測定。

1.7 PEDV的S、ORF3和N基因序列分析利用生物學軟件MegAlign進行PEDV流行株 S1、ORF3和N基因推到氨基酸序列與15株參考序列的相似性分析。利用軟件Mega 7.0的Boot-strapped Neighbor-Joining算法構(gòu)建進化樹及氨基酸變異分析。

2 結(jié)果

2.1 PEDV的S、ORF3和N基因PCR擴增結(jié)果利用RT-PCR方法對18個豬場PEDV感染仔豬組織中擴增S、ORF3和N基因。結(jié)果表明,來自18個豬場樣品中均獲得與預期相符的PCR產(chǎn)物，其中引物S1/S2的PCR產(chǎn)物約990 bp，引物ORF3-S/ORF3-A的PCR產(chǎn)物約為930 bp，引物N-S/N-A的PCR產(chǎn)物約為1 400 bp。經(jīng)核苷酸序列測定結(jié)果證實，18個豬場流行的PEDV主要有5株，分別命名為HNHB、HNNY、HNZY、HNHC和HNXC。

2.2 PEDV的S1基因部分序列遺傳變異分析PEDV的S1基因部分序列構(gòu)建進化樹如圖1所示，5株P(guān)EDV流行株和15株參考序列構(gòu)建進化樹分成2個群，即G1和G2。5株P(guān)EDV流行株均屬于G2a分支，相似性為96.4%～100%；與同分支參考序列相似性為96.4%～98.5%；與G2b分支參考序列相似性為95.1%～97.0%；與G1分支參考序列相似性為93.0%～96.7%。如表2所示，與G1群中經(jīng)典毒株CV777相比較，5株P(guān)EDV流行株S氨基酸序列在10個位置發(fā)生相同氨基酸置換，分別為A517S、S523G、V527I、G549S、A605E、I635V、N707D、N724S、Y766S；此外，流行株HNHB、HNNY和HNZY在6個位置發(fā)生相同氨基酸置換，即G520D、L521H、Q574H、K621T、I667F、A704V；流行毒株HNHC存在7個位置發(fā)生氨基酸置換，即I496S、S522N、K563N、L612F、M641I、N719S、Q765H；流行毒株HNXC存在5個位置發(fā)生氨基酸置換，即L521R、F536L、L612F、N719S、Q765H發(fā)生氨基酸突變。

圖1 PEDV S1部分基因推導氨基酸進化樹分析

2.3 PEDV的ORF3基因推導氨基酸序列遺傳變異分析PEDV的ORF3基因推導氨基酸序列構(gòu)建進化樹如圖2所示，5株P(guān)EDV流行株與參考毒株序列可分成2個群，即G1和G2群。HNXC株和HNHC株屬于G2a群，與G1群參考序列相似性均為92.4%；與G2b群參考序列相似性為94.7%～96.4%；與G2c群流行毒株序列相似性為95.6%～96.4%。HNHB株、HNNY株和HNZY株都屬于G2c群，相似性為99.6%～100%；與G1群參考序列相似性為88.0%～89.1%；與G2a群序列相似性為92.4%～94.8%；與G2b群序列相似性為94.7～96.9%。G1群PEDV毒株均為弱毒株，ORF3均不同程度出現(xiàn)氨基酸序列片段的缺失，與其相比較，5株P(guān)EDV流行株均為編碼224個氨基酸的完整序列，不存在氨基酸的缺失，具有強毒株的分子遺傳特征。如表3所示，與經(jīng)典毒株CV777相比較，5株P(guān)EDV流行株在5個位置發(fā)生了相同氨基酸的置換，分別為V21A、V54I、V79I、A101T和N166S；PEDV流行株HNNY、HNZY和HNHB在7個位置發(fā)生相同氨基酸的置換，分別為L25S、S63A、I70V、L81I、L92F、C107F和D168N；HNXC和HNHC在2個位置發(fā)生相同氨基酸的置換，分別為F80V和H182Q；此外HNZY在41位發(fā)生氨基酸置換(A41T)，HNXC和HNHC均在92位氨基酸發(fā)生置換，分別為L92F和L92I。

表2 PEDV S1部分基因推導氨基酸與經(jīng)典毒株CV777比較發(fā)生氨基酸置換

圖2 PEDV ORF3氨基酸進化樹分析

表3 PEDV ORF3基因推導氨基酸與經(jīng)典毒株CV777比較發(fā)生氨基酸置換

2.4 PEDV N基因推導氨基酸序列遺傳變異分析PEDV的N基因推導氨基酸序列構(gòu)建進化樹如圖3所示，5株P(guān)EDV流行株和參考序列共形成2個群，2010年之前流行株(包括經(jīng)典疫苗毒株CV777)和SD-M株、DR13株組成G1群；5株流行株與2010年以后的流行株組成G2群，其中HNZY、HNHB與參考株屬于G2a亞群，HNXC株、HNHC株和HNNY株屬于G2b亞群。流行株HNZY和HNHB與G1群毒株相似性為95.7%～96.8%；與G2b亞群相似性為97.1%～98.9%；與G2a亞群其他毒株相似性為98.4%～99.3%。流行株HNXC、HNHC和HNNY與G1群毒株相似性為95.0%～96.8%；與G1亞群內(nèi)毒株相似性為97.1%～98.9%。如表4所示，與經(jīng)典毒株CV777的N氨基酸序列相比較，5株P(guān)EDV流行株在10個位置發(fā)生了相同氨基酸的置換，即G84A、K123N、A142T、N205K、H242L、L381P、L395Q、Q397L、H398N、E400D；HNHB、HNZY、HNHC和HNNY株在4個位置發(fā)生相同氨基酸置換，即R241K、K252R、A408L和V412S，而HNXC僅在408位置氨基酸發(fā)生置換(A408V)；HNXC、HNHC和HNNY株在4個位置發(fā)生相同氨基酸置換，即F309I、V910C、E311R、G313S；此外，HNHB株在2個位置發(fā)生氨基酸置換(N255I和N258Y)，HNZY株在3個位置發(fā)生氨基酸置換(D240E、N255S和P285L)，HNXC株在1個位置發(fā)生氨基酸置換(N416Y)，HNHC株在2個位置發(fā)生氨基酸置換(N255S和P409S)，HNNY存在2個位置氨基酸發(fā)生置換(D240E和N255S)。

圖3 PEDV N氨基酸進化樹分析

表4 PEDV N基因推導氨基酸與經(jīng)典毒株CV777比較發(fā)生氨基酸置換

3 討論

自從2010年開始，我國大部分地區(qū)暴發(fā)PEDV疫情，許多豬場的新生仔豬的病死率接近100%，造成了嚴重的經(jīng)濟損失[6]。經(jīng)過許多研究結(jié)果證實，與經(jīng)典疫苗毒株CV777相比， 2010年后國內(nèi)流行的PEDV株出現(xiàn)氨基酸突變、插入及缺失等形式變異，從而導致疫苗免疫豬仍然可以被感染。雖然PEDV僅有一個血清型，但在疫苗免疫、環(huán)境和藥物作用等壓力因素下，PEDV在流行過程中極有可能發(fā)生變異。因此，及時掌握豬群中流行的PEDV的遺傳變異情況對于該病的防控具有重要的指導意義。本研究擴增5株豫南地區(qū)的PEDV流行株S1部分基因、ORF3基因和N基因，并進行核苷酸序列測定，通過對其推到氨基酸序列的分子遺傳變異分析，可為該地區(qū)制定科學的PEDV綜合防控措施提供指導。

PEDV的S蛋白是由1 383個氨基酸(aa)組成，能促進病毒與宿主細胞的融合，刺激宿主細胞產(chǎn)生中和抗體等。已有研究證實，S蛋白具有4個中和表位，分別為COE(499～638 aa)、SS2(748～755 aa)、SS6(764～771 aa)和2C10(1 368～1 374 aa)[16]，其中S1部分包含有3個中和表位(COE、SS2和SS6)，S2部分有1個中和表位(2C10)。已有研究證實，PEDV變異毒株S蛋白氨基酸序列存在氨基酸片段的插入、缺失及突變等變異方式，是導致疫苗免疫失敗的重要原因[17-21]。本研究中，根據(jù)S1部分氨基酸序列進化樹分析，5個PEDV流行株分布在G2a群，與CV777為代表的2010年前流行毒株組成的G1群親緣關(guān)系較遠。氨基酸變異方面，與CV777毒株相比較，5個流行株在COE區(qū)域存在7個相同氨基酸的置換，在SS6區(qū)域存在1個相同氨基酸的置換，此外，每個PEDV流行株在不同位置氨基酸發(fā)生置換，表現(xiàn)出不同毒株變異的多樣性。上述結(jié)果表明，本地區(qū)流行的PEDV毒株均為變異毒株，且與疫苗毒株CV777存在抗原位點氨基酸變異，推測其實導致疫苗免疫效果不佳的一個重要原因。

ORF3是PEDV重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，對PEDV適應(yīng)體外培養(yǎng)宿主細胞發(fā)揮重要作用。已有報道證實，ORF3是否發(fā)生17個氨基酸缺失是區(qū)別野生型和弱毒株的關(guān)鍵分子特征，其與病毒的毒力與致病性有密切關(guān)系。本研究中，基于ORF3氨基酸序列進化樹分析結(jié)果表明，5株P(guān)EDV流行株與CV777均為屬于G2群，但分布在不同亞群，編碼224個氨基酸，與3個ORF3氨基酸缺失株組成G1群(JQ023162、JX560761和KC210146)親緣關(guān)系較遠。與疫苗毒株CV777相比，5株流行株存在5個相同氨基酸置換位點，與周兵強等[22]報道結(jié)果相一致。此外，還存在不同程度的單個氨基酸突變位點。上述分析結(jié)果表明，5株P(guān)EDV流行株具有野生型毒株的分子遺傳特征，并表現(xiàn)出多樣性變異的特點，與國內(nèi)報道相一致[23-25]。

相比較其他蛋白，PEDV N蛋白相對比較保守，其在病毒基因組RNA復制、誘導機體特異性免疫反應(yīng)及協(xié)助病毒逃避免疫反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。董波等[26]報道，8株閩西地區(qū)PEDV流行株與CV777親緣關(guān)系較遠，N蛋白氨基酸序列存在14個位點相同氨基酸置換。本研究中，5株流行株與2010年后流行參考毒株組成G2群，與疫苗毒株CV777所在G1群親緣關(guān)系較遠，結(jié)果與上述報道相一致。5株流行株存在10個相同氨基酸置換位點，其中有9個位置氨基酸變異與董波等[26]報道相一致，有1個位點不相同(H398N)。此外，閩西地區(qū)PEDV流行株還存在5個氨基酸位點的變異，而在豫南地區(qū)流行株中未發(fā)生相應(yīng)位置氨基酸變異，但在其他位置發(fā)生多個位點不同氨基酸位點的突變，呈現(xiàn)出分子遺傳多樣性特征。