鼻咽癌同期放化療抵抗細(xì)胞株與母細(xì)胞株lncRNA 的差異表達(dá)譜分析

劉秋燕，熊偉，李程

（1）云南省腫瘤醫(yī)院/昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院放射治療中心，云南 昆明 650118;2）攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，四川 攀枝花 617000）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）起源于鼻咽粘膜上皮，是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。鼻咽癌發(fā)病具有明顯的地域聚集性，75%以上的病例集中在東亞及東南亞，尤其是我國的華南地區(qū)[1]。我國鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)化年齡發(fā)病率約3/100 000，約占全球鼻咽癌發(fā)病總?cè)藬?shù)的39%，明顯高于世界平均水平[2-3]。同期放化療是Ⅱ～ⅣA 期鼻咽癌最重要的根治性治療手段，由于腫瘤細(xì)胞本身及治療過程中獲得的抗性，部分患者出現(xiàn)治療失敗，最終導(dǎo)致死亡[4]。lncRNA 作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物，有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]、腫瘤干細(xì)胞樣特性[6-8]、DNA損傷修復(fù)[9]等方面調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，改變鼻咽癌細(xì)胞對治療的敏感性。然而，lncRNA 在鼻咽癌同期放化療抵抗中的表達(dá)譜及作用機(jī)制仍不清楚。本研究通過誘導(dǎo)鼻咽癌同期放化療抵抗細(xì)胞模型，利用高通量測序篩選同期放化療抵抗細(xì)胞株與親本細(xì)胞株間lncRNA 的差異表達(dá)譜，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步了解其在鼻咽癌同期放化療抵抗中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究材料

高分化細(xì)胞CNE1 和低分化細(xì)胞CNE2，及經(jīng)同步放化療處理后得到的抵抗細(xì)胞株CNE1CRR和CNE2CRR，RPMI-1640 培養(yǎng)基，順鉑（購自Sigma 公司），Hisq Xten 高通量測序儀（Illumina美國），CBOT簇生成儀（Illumina 美國），Qubit（Invitrogen 美國），核糖體試劑盒Ribo-ZeroTM rRNA Removal Kit（illumina 美國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo），PCR 引物及瓊脂糖（生工）。

1.2 研究方法

1.2.1 構(gòu)建同期放化療抵抗模型鼻咽癌CNE1和CNE2 細(xì)胞均暴露于濃度為0.05 μg/mL 的順鉑完全培養(yǎng)基中，并予6 Gy 的6 Mv X-ray 照射，細(xì)胞接觸順鉑至24 h 后予更換新鮮培養(yǎng)基，待殘余細(xì)胞恢復(fù)生長后重復(fù)上述處理，共10次，得到鼻咽癌同期放化療抵抗細(xì)胞株CNE1CRR 和CNE2CRR。利用克隆形成法驗(yàn)證細(xì)胞對同期放化療的抗性，以單擊多靶模y=1 -[1 -exp（-k*x）]^N 擬合細(xì)胞生存曲線[10]，計算D0、Dq 值。

1.2.2 構(gòu)建lncRNA 和mRNA 差異表達(dá)譜本研究lncRNA 和mRNA 差異表達(dá)譜的構(gòu)建，由上海英拜生物有限公司完成。采用Trizol 法提取總RNA，使用試劑盒Ribo-ZeroTMrRNA Removal Kit 去除rRNA；加入RNA 片段化反應(yīng)緩沖液經(jīng)高溫加熱使RNA 片段化；以片段RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成一鏈cDNA，然后加入二鏈反應(yīng)體系（dUTP 代替dTTP），以一鏈cDNA 為模板鏈合成二鏈cDNA，3＇端加上polyA，兩端連接測序接頭；AmpureBeads 對文庫進(jìn)行純化和篩選，PCR對一鏈cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增構(gòu)建文庫；濃度（Quibit）及片段大?。ō傊悄z電泳）質(zhì)檢合格后，應(yīng)用Illumina Xten 進(jìn)行高通量測序；原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后，與參考基因庫（人GRCh38 基因組）進(jìn)行比對，F(xiàn)PKM 法對基因量化及歸一化處理，以 Log2FC＞1 或＜-1，F(xiàn)DR＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)譜。

1.2.3 差異lncRNA 靶基因預(yù)測根據(jù)lncRNA功能與鄰近的編碼蛋白基因具有相關(guān)性的原理預(yù)測順式作用靶基因（cis-gene），篩選位于lncRNA上下游10 K-100 K 以內(nèi)的蛋白編碼基因作為該lncRNA 順式作用的靶基因。

1.2.4 差異lncRNA 靶基因功能分析對差異表達(dá)的lncRNA 進(jìn)行Cluster 分析并展示，行基因本體論（GO）、KEGG 通路富集分析。以P-value＜0.05 為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 qRT-PCR 驗(yàn)證lncRNAs 差異表達(dá)譜隨機(jī)選取4 個同時差異表達(dá)的lncRNAs 進(jìn)行定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reversse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）驗(yàn)證。按照說明書操作，先將每種RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，以GAPDH 為內(nèi)參。用2-ΔΔCt法計算lncRNA 的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS25.0 進(jìn)行結(jié)果分析，組間資料用t檢驗(yàn)，計量資料用（）表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 同期放化療細(xì)胞的抗性驗(yàn)證

同一放射劑量下，CNE1 和CNE2 克隆團(tuán)數(shù)量明顯少于相對應(yīng)的放化療抵抗細(xì)胞株CNE1CRR和CNE2CRR 的克隆團(tuán)數(shù)量（P＜0.05），單擊多靶模型擬合生存曲線見圖1；CNE1CRR、CNE2CRR的放射生物學(xué)參數(shù)SF2、Dq、D0 高于相對應(yīng)的CNE1、CNE2，見表1。

表1 CNE1 和CNE2 放化療抵抗細(xì)胞鑒別的放射生物學(xué)參數(shù)Tab.1 Radiobiological parameters to identify the chemoradioresistance of CNE1 andCNE2

圖1 生存曲線圖Fig.1 Figures of survival curves

2.2 lncRNA 與mRNA 差異表達(dá)分析

CNE1CRR與CNE1比較，差異表達(dá)lncRNAs共有2746個（其中358個顯著上調(diào)，2063個顯著下調(diào)），同時檢測出差異表達(dá)mRNA7749個（其中顯著上調(diào)2 332個，顯著下調(diào)5 417個）；CNE2CRR 與CNE2 比較，差異表達(dá)lncRNAs 共有3 475個，（其中顯著上調(diào)265個，顯著下調(diào)520個），同時檢測出差異表達(dá)mRNA1878 個（其中顯著上調(diào)661個，顯著下調(diào)1 217個）；49 個lncRNAs 在CNE1CRR 和CNE2CRR 中共同上調(diào)，387 個lncRNAs 在CNE1CRR 和CNE2CRR共同下調(diào)。對2 組細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNAs 繪制火山圖，見圖2；聚類熱圖見圖3；韋恩圖見圖4。并列舉抵抗細(xì)胞株中上調(diào)或下調(diào)前10 位lncRNAs，見表2。

表2 CNE1CRR 及CNE2CRR 中上調(diào)或下調(diào)前10 位的lncRNAsTab.2 Top 10 lncRNAs up-regulated and down-regulated in CNE1CRR and CNE2CRR

圖2 母細(xì)胞株和放化療抵抗細(xì)胞株差異表達(dá)lncRNAs 的火山圖Fig.2 Volcano plot of differentially expressed lncRNAs in parental and chemoradioresistant cell lines

圖3 母細(xì)胞株和放化療抵抗細(xì)胞株差異表達(dá)lncRNAs 的聚類熱圖Fig.3 Clustering heat mapof differentially expressed lncRNAs in parental and chemoradioresistant cell lines

圖4 CNE1CRR 與CNE1，CNE2CRR 與CNE2 中差異表達(dá)lncRNA 韋恩圖Fig.4 Venn diagram of differentially expressed lncRNAs in group CNE1CRR and CNE1，CNE2CRR and CNE2

2.2.1 lncRNA 靶基因預(yù)測本研究僅進(jìn)行了順式靶基因預(yù)測。在CNE1 這組細(xì)胞中，295 個lncRNA 有416 個順式靶基因，在CNE2 這組細(xì)胞中，961 個lncRNA 有1 335 個順式靶基因。

2.2.2 靶基因GO 及KEGG 分析對靶基因進(jìn)GO 和KEGG 功能富集分析，CNE1 組中差異表達(dá)lncRNA 的靶基因主要富集的生物過程（biological process，BP）有DNA 為模板轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)泛素化、血管生成等；分子功能（molecular function，MF）有DNA 結(jié)合、核酸結(jié)合、金屬離子結(jié)合等；細(xì)胞成分（cellular component，CC）有核質(zhì)、核仁、細(xì)胞質(zhì)等生命活動，見圖5A。CNE2 組中差異表達(dá)lncRNA 的靶基因主要富集的生物過程（Venn diagram of differentially expressed lncRNAs between CNE1CRR and CNE1，CNE2CRR and CNE2BP）有DNA 為模板轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核糖磷酸代謝過程、葉醌分解代謝過程等；分子功能（MF）有金屬離子結(jié)合、核酸結(jié)合、葡萄糖基神經(jīng)酰胺酶活性等；細(xì)胞成分（CC）有核、高爾基膜、免疫性突觸、腫瘤壞死因子受體等生命活動，見圖5B。

圖5 GO 功能富集分析柱狀圖Fig.5 Histogram of GO functional enrichment analysis

分別選取2 組細(xì)胞中差異表達(dá)lncRNA 靶基因富集前10 位的通路制作表格，不足10 位的展示全部，見表3。結(jié)果顯示，在CNE1 組中，靶基因主要富集的信號通路包括細(xì)胞凋亡、病毒致癌、代謝途徑、腫瘤壞死因子TNF 信號通路、EB 病毒感染等。CNE2 組中，靶基因主要富集的信號通路包括代謝途徑（硫辛酸、磷酸戊糖、花生四烯酸、醚脂質(zhì)）、T 細(xì)胞受體信號通路、核苷酸切除修復(fù)等。

表3 CNE1 和CNE2 組差異lncRNAs 靶基因通路富集Tab.3 Pathway enrichment of differentially expressed lncRNAs target genes in CNE1 and CNE2 groups

2.3 qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果

將檢測lncRNAs 的Ct 值進(jìn) 行2-ΔΔCT轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示四個lncRNAs 的qRTPCR 與測序得到的表達(dá)趨勢一致，其中AC002116.7、LOC102724699、LOC102724872 三個lncRNAs 在CNE1CRR 和CNE2CRR中表達(dá)同時上調(diào)，lncRNA HNRNPU-AS1 在CNE1CRR 和CNE2CRR 中同時表達(dá)下調(diào)，但CNE1 和CNE1CRR中差異表達(dá)的HNRNPU-AS1，CNE2 和CNE2CRR中的差異表達(dá)的AC002116.7，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 熒光定量qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果Fig.6 Validation result of Fluorescence quantitative qRTPCR

3 討論

lncRNA 是一種長度大于200 個核苷酸，且不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA[11]。在過去的很長一段時間里，lncRNA 被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄組的“垃圾”，隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，大量lncRNA 被發(fā)現(xiàn)，它們的神秘面紗也被逐漸被揭曉。越來越多的研究表明，lncRNA 在腫瘤組織中表達(dá)差異，并且表達(dá)水平與腫瘤分期及預(yù)后息息相關(guān)[12-13]。這表明lncRNA 參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，不僅如此，lncRNA 還參與了腫瘤的放療抵抗或化療耐藥[14-15]。因此，lncRNA 成為了腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，治療敏感性是腫瘤領(lǐng)域中的重要板塊，故lncRNA 在治療抵抗中的重要性不言而喻。目前l(fā)ncRNA 在治療抵抗中作用的具體機(jī)制尚不清楚，探討其在治療抵抗中的作用具有現(xiàn)實(shí)意義。

鼻咽癌惡性程度高，容易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及顱底骨質(zhì)破壞，同期放化療是鼻咽癌最主要的治療方式，和單純放療相比，同期放化療能讓患者獲得更高的局控率，并從總體生存期（overall survial，OS）中獲益[16]。同時，同期放化療抵抗的問題也日趨明顯，但目前絕大多數(shù)研究僅從化療耐藥或放療抵抗單方面來探究腫瘤細(xì)胞的抵抗機(jī)制。當(dāng)放療和化療聯(lián)合應(yīng)用時，化療有放療增敏的作用，因此，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生放化療抵抗的原因必然有別于單獨(dú)放/化療，因此，本研究將放療和化療相結(jié)合來探討腫瘤治療抵抗的機(jī)制。Guo等[17]通過逐漸增加放射劑量建立CNE2 放療抵抗細(xì)胞株，然后應(yīng)用高通量測序方法建立放化療抵抗細(xì)胞株和母細(xì)胞株lncRNAs 的差異表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)781 個已知的lncRNAs 與輻射抗性相關(guān)，其中表達(dá)上調(diào)310個，表達(dá)下調(diào)471 個。在本研究中，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)lncRNAs 共有3 475個，其中顯著上調(diào)265個，顯著下調(diào)520 個。2 個研究中的差異表達(dá)譜區(qū)別明顯，這可能是誘導(dǎo)方法不同所致，且本研究的誘導(dǎo)方法更貼近臨床治療模式。為了解lncRNA 在鼻咽癌同期放化療中的作用，筆者還對差異表達(dá)lncRNA 順式作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測，并進(jìn)行GO 及KEGG 通路分析。結(jié)果顯示lncRNA 通過多方面來調(diào)控細(xì)胞對放化療的抗性。此外，筆者隨機(jī)選取了4 個在2 組細(xì)胞中同時差異表達(dá)的lncRNAs，應(yīng)用qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)對本次測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明lncRNAs 的變化趨勢與測序結(jié)果基本一致。Niu等[18]研究發(fā)現(xiàn)HNRNPU-AS1 在宮頸癌患者及細(xì)胞中表達(dá)缺失，且預(yù)示不良預(yù)后；它通過miR-205-5p/AXIN2 軸調(diào)控Wnt/β-catenin 通路，抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)HNRNPU-AS1 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)降低，具有抑制增殖、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)自噬作用。在放化療抵抗的鼻咽癌細(xì)胞中HNRNPU-AS1 表達(dá)降低，但其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。除此之外，筆者通過二代基因測序構(gòu)建了治療抵抗和原始腫瘤細(xì)胞的lncRNA 差異譜，這些差異表達(dá)的lncRNA 可能參與了治療抵抗的關(guān)鍵作用。

本研究從細(xì)胞層面上探討了鼻咽癌同期放化療抵抗時lncRNA 表達(dá)譜的變化情況，為進(jìn)一步研究lncRNA 在放化療抵抗中的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，為今后尋找合理的干預(yù)措施減少鼻咽癌放化療抵抗，進(jìn)一步提高鼻咽癌放化療療效打下了基礎(chǔ)。