華南虎外周淋巴血細(xì)胞培養(yǎng)及染色體鋪展分析

潘天樂，劉鳳霞,2，毛毅斌，劉建勛，鄒健強(qiáng)，黃海軍，林盈,4，楊仙玉，張先福

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院、動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311304；2.貴州韓偉蛋業(yè)有限公司，貴州 六盤水 553521；3.杭州野生動(dòng)物世界有限公司，浙江 杭州 311422；4.杭州博盛科技有限公司，浙江 杭州 310012）

虎Panthera tigris有很多亞種，其中華南虎P.tigris amoyensis是我國(guó)所獨(dú)有的。相關(guān)研究基本確定野生華南虎已在自然界滅絕[1]。截至2019 年2 月，全國(guó)圈養(yǎng)華南虎僅有178 只，均為近親交配的后代。近年來，華南虎在繁殖過程中的死胎、弱胎、畸形胎等異?，F(xiàn)象愈發(fā)頻繁，在種群擴(kuò)大及個(gè)體健康方面均面臨日益增大的壓力。1991—1993 年，張錫然等對(duì)華南虎和東北虎P.tigris altaica的染色體核型進(jìn)行了分析[2-4]，結(jié)果表明華南虎和東北虎的染色體數(shù)目相同，G-顯帶帶型沒有明顯差異[5]。2008 年，鄭維平等對(duì)東北虎的染色體核型進(jìn)行了分析[6]，研究結(jié)果與張錫然等的結(jié)果一致。研究華南虎長(zhǎng)期近交過程中染色體的核型變化情況，可為圈養(yǎng)華南虎繁殖和疾病診斷提供依據(jù)，將有利于其種群數(shù)量的擴(kuò)大和后代的健康。染色體核型分析不僅可以識(shí)別染色體的各種不同特征，還有利于對(duì)基因的定位研究[7]。它是遺傳學(xué)中使用的基礎(chǔ)技術(shù)，也是動(dòng)物分類、動(dòng)物育種工作不可或缺的手段[8]。

本文使用人Homo sapiens外周淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基成功培養(yǎng)了華南虎外周血的淋巴細(xì)胞，并進(jìn)行了染色體鋪展和G-顯帶，然后對(duì)其核型進(jìn)行了分析，以期為華南虎的遺傳性疾病診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液 華南虎血液（采集自雄性華南虎尾靜脈）由杭州野生動(dòng)物世界提供，并保存于4 ℃冰箱。

1.1.2 試劑和主要儀器 人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基、秋水仙素、胰酶、吉姆薩染色液等均購(gòu)自杭州博盛科技有限公司，甲醇和冰醋酸（分析純）購(gòu)自杭州大方化學(xué)試劑廠。主要設(shè)備有移液槍、超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、離心機(jī)、烘箱和顯微鏡等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外周淋巴細(xì)胞的培養(yǎng) 將保存于4 ℃冰箱的華南虎血液取出，輕輕顛倒混勻，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，使用1.0 mL 一次性注射器取0.1 mL 接種至5 mL 人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，在37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h（每隔4～ 8 h輕輕搖勻培養(yǎng)液）。然后在培養(yǎng)基中加入10 μg·mL-1的秋水仙素50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，最后將培養(yǎng)液移入15 mL離心管，1 500 r·min-1離心10 min（后續(xù)離心條件與此相同），管內(nèi)保留上清液與沉淀約0.5 mL。

1.2.2 低滲處理 在每個(gè)離心管內(nèi)各加入3 mL 于37 ℃預(yù)熱的0.075 mol·L-1KCl 溶液，用巴氏管充分吹打混勻細(xì)胞懸浮液，然后于37 ℃水浴30 min。

1.2.3 固定 遵循杭州博盛科技有限公司人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基的產(chǎn)品說明，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，固定液為甲醇與冰醋酸3∶1（體積比）的混合物，共分3 個(gè)步驟：第一步為初固定，即向每個(gè)離心管內(nèi)加入0.25 mL 固定液，輕輕吹打混勻，室溫放置5 min 后離心，保留上清與沉淀共1 mL；第二步為第一次固定，即向初固定的樣品中加入固定液3 mL，吹打混勻，室溫放置5 min 后離心，保留上清液與沉淀共1 mL；第三步為第二次固定，與第一次固定基本相同，不同的是離心后去掉全部上清液，在沉淀中加入0.5 mL 新鮮固定液。

1.2.4 染色體鋪展與吉姆薩染色 將于冰柜中預(yù)冷的載玻片沿瓷盤邊緣傾斜放置，然后用巴氏管吸取適量固定好的細(xì)胞懸浮液，從40～ 50 cm 高度滴到玻片上，然后連同瓷盤小心放入80 ℃烘箱（開啟風(fēng)機(jī)）。待玻片干透后（3～ 5 min）取出瓷盤，將玻片用自來水迅速?zèng)_洗，甩干，然后將吉姆薩染液（原液∶蒸餾水∶磷酸鹽緩沖液=1∶8∶1，體積比）覆蓋整個(gè)玻片，染色3 min 后，甩掉玻片上的染色液，用流水沖洗，甩干后鏡檢（或存放于玻片盒內(nèi)）。

1.2.5 染色體G-顯帶（1）準(zhǔn)備：取3 個(gè)染色缸，分別標(biāo)記為1、2、3 號(hào)。1 號(hào)缸加入胰酶工作液（45 mL 生理鹽水+5 mL 胰酶液+150 μL 5%碳酸氫鈉），2 號(hào)缸加入30 mL 生理鹽水，兩者均于37 ℃水浴保溫，3 號(hào)缸加入50 mL 吉姆薩染液置于室溫。（2）染色：將從烘箱中取出的玻片冷卻至室溫，浸入1 號(hào)缸處理10 s，取出后快速浸入2 號(hào)缸，然后將玻片取出并輕輕甩一下，再插入3 號(hào)缸染色3～ 5 min，最后取出玻片用自來水徹底沖凈并快速烘干，鏡檢（或存放于玻片盒內(nèi)）。

1.2.6 染色體核型分析 采用Photoshop（Adobe Photoshop cc 2015.5）進(jìn)行染色體核型分析[9]：（1）對(duì)染色體圖片進(jìn)行濾鏡處理、裁剪和同源染色體配對(duì)并編號(hào)；（2）新建Photoshop 空白頁(yè)，拖入同源染色體并垂直放置；（3）測(cè)量染色體長(zhǎng)臂和短臂的長(zhǎng)度并記錄數(shù)據(jù)；（4）根據(jù)Levan 等（1964）的計(jì)算公式，計(jì)算染色體相關(guān)參數(shù)值[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，染色體鋪展良好（圖1），2n=38。

圖1 華南虎染色體數(shù)目Figure 1 Chromosome number of P.tigris amoyensis

2.2 染色體核型

選擇6 個(gè)鋪展良好的華南虎淋巴細(xì)胞染色體進(jìn)行切割和染色體長(zhǎng)臂、短臂的準(zhǔn)確測(cè)量，根據(jù)Levan 等的染色體標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算公式[3]得到華南虎染色體相關(guān)參數(shù)值（表1）。染色體核型見圖2。通過分析觀察發(fā)現(xiàn)華南虎染色體核型公式為：6（m）+6（sm）+3（st）+2（t），X,Y（m,m），其中第12 對(duì)為隨體染色體。

圖2 華南虎染色體核型Figure 2 Chromosome karyotype of P.tigris amoyensis

表1 華南虎染色體相關(guān)參數(shù)值Table 1 Chromosome traits of P. tigris amoyensis

2.3 G-顯帶

依據(jù)1997 年Cho 等提出的染色體G-顯帶分類方式[10]，對(duì)華南G-顯帶染色體進(jìn)行排版分析和配對(duì)，發(fā)現(xiàn)華南虎染色體G-顯帶帶形特征分為6 型（圖3），其中A 型（大近中央著絲粒染色體）6 條、B 型（大近端著絲粒染色體）8 條、C 型（大中央著絲粒染色體）4 條、D 型（小近中央著絲粒染色體）8 條、E 型（小中央著絲粒染色體）6 條、F 型（端著絲粒染色體）4 條和性染色體X、Y。

圖3 華南虎G-顯帶Figure 3 G-banding of P.tigris amoyensis

G-顯帶結(jié)果表明，華南虎D3 染色體長(zhǎng)臂缺少一條深染帶、C1 和F2染色體發(fā)生了單體異態(tài)現(xiàn)象，表明染色體的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，華南虎染色體鋪展良好（圖1），可清晰地觀察到38 條染色體。該方法使華南虎的淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)良好，降低了工作強(qiáng)度，減少了試驗(yàn)時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。本試驗(yàn)華南虎外周血細(xì)胞染色體的鋪展結(jié)果與張錫然等[2]的結(jié)果相同，與東北虎等貓科Felidae 動(dòng)物的染色體數(shù)目[5]一致。與張錫然等[2]得到的結(jié)果相比，本試驗(yàn)得到的華南虎D3 染色體長(zhǎng)臂缺少一條深染帶、C1 和F2 染色體發(fā)生了單體異態(tài)現(xiàn)象，可能是華南虎的染色體發(fā)生了變化。

3.2 討論

有關(guān)染色體的研究顯示，染色體疾病一般涉及多系統(tǒng)、器官、組織，目前臨床對(duì)其治療并無有效方法；染色體疾病表現(xiàn)多樣，輕微畸變者能夠出生，但多發(fā)畸形或形成癌癥三倍體[11]。部分染色體微缺失者表型無異常，但傳遞給后代時(shí)配子不平衡，發(fā)生不育[12]。嚴(yán)重畸變者宮內(nèi)死亡或自然流產(chǎn)[13]。本研究得到的華南虎染色體核型為6（m）+6（sm）+3（st）+2（t），X,Y（m,m），與張錫然等的研究結(jié)果相同[2]。但G-顯帶結(jié)果表明，華南虎D3 染色體長(zhǎng)臂缺少一條深染帶，C1 和F2 染色體發(fā)生了單體異態(tài)現(xiàn)象，表明染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。染色體結(jié)構(gòu)異?？蓪?dǎo)致新生個(gè)體出生后發(fā)生異常，比如人的21 三體綜合征。該疾病是由于染色體21q22 區(qū)域的重復(fù)，使這一區(qū)域呈現(xiàn)三體，從而在臨床上導(dǎo)致新生兒肌肉張力不足、寰樞不穩(wěn)、神經(jīng)元密度降低、小腦發(fā)育不全、智力殘疾，甚至伴有先天性心臟病[13-14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的華南虎染色體變化可能是長(zhǎng)期近親交配的后果。異常的染色體結(jié)構(gòu)常導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降或受精卵形成后胚胎發(fā)育異常，最終導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎以及出生缺陷等情況的發(fā)生[15]，因此本試驗(yàn)結(jié)果表明，華南虎D3 染色體長(zhǎng)臂的缺少可能是導(dǎo)致華南虎經(jīng)常性流產(chǎn)、死胎以及繁殖力降低的重要原因。

以上研究結(jié)果為華南虎配種親本的選擇及后期種群的擴(kuò)繁提供了重要依據(jù)，對(duì)我國(guó)華南虎繁殖實(shí)踐具有指導(dǎo)意義。