折耳根提取液對番茄灰霉病菌的抑菌活性分析

胡永靜，葉欣悅，須 文

（貴州大學農(nóng)學院園藝系，貴州 貴陽 550025）

番茄是主要的設(shè)施栽培蔬菜作物之一，果實中含有大量的礦質(zhì)元素、維生素C、番茄紅素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗衰老、防止動脈硬化、減少癌癥的發(fā)生等作用[1]。灰霉病由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）所致，是露地、保護地蔬菜作物上常見且比較難防治的一種真菌性病害，屬于低溫高濕型病害，其病原菌適宜的生長溫度為25 ℃左右，濕度持續(xù)90%以上時為病害的高發(fā)期[2]。同時也是一種典型的氣傳病害，可隨著空氣、水流以及農(nóng)事作業(yè)傳播，且傳播的速度比較快?；颐共≡诜延酌缙诤统芍昶诰砂l(fā)生，表現(xiàn)在葉、花、果實、莖等部位，花期是其發(fā)生的高峰期，同時也是防治的最佳時期。近幾年來，灰霉病成為保護地栽培較重的病害之一。番茄在低溫高濕條件下極易患灰霉病，不管在苗期還是成株期均可發(fā)病，在成株期主要為害番茄果實，發(fā)生時間早，持續(xù)時間長，易造成爛果[3]；苗期主要為害番茄植株的葉片、莖、葉柄等，易造成葉片和莖的腐爛。因此，番茄灰霉病是造成保護地番茄減產(chǎn)的主要原因之一[4]，一般導(dǎo)致番茄減產(chǎn)20%～30%，嚴重時減產(chǎn)50%以上[5]。目前生產(chǎn)上番茄灰霉病主要以農(nóng)藥防治為主，但存在著農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染的問題。在防治上多采用速克靈等化學藥劑噴霧，在連續(xù)使用的情況下，病菌逐漸產(chǎn)生了抗藥性，防效逐年下降，成本增加。因此，近年來國內(nèi)大量學者在番茄品種選育、栽培技術(shù)管理、化學防治、生物防治等領(lǐng)域進行大量研究，但因為缺乏抗病品種和病原菌抗藥性增強等原因，導(dǎo)致番茄灰霉病的防治還是沒有得到更好的解決。因此，開展生物防治相關(guān)研究將成為灰霉病防治的趨勢和方向。

折耳根（蕺菜）是一種重要的藥食兼用蔬菜，在貴州各地均有種植。折耳根提取液中的多種活性成分具有較強的抗菌特性[6]。折耳根提取液中抑菌物質(zhì)主要為折耳根素及月桂醛等揮發(fā)油成分， 醫(yī)學研究表明，折耳根素對卡他球菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、肺炎球菌、流感桿菌等具有明顯的抑制作用，對傷寒桿菌、鉤端螺旋體也有較強的抑制作用[7-8]，折耳根素與甲氧芐胺嘧啶（TMP ）配伍還有協(xié)同作用，抑菌效果顯著增強[9]。

目前鮮少有文獻報道折耳根提取液對番茄灰霉病的應(yīng)用及防治情況。本試驗以番茄幼苗為活體接種試材，通過噴施折耳根提取液及接種灰霉病菌，觀察幼苗表型和測定番茄葉片的灰霉生長量等指標，為進一步分析折耳根提取物對番茄灰霉病的抑制作用及提高番茄產(chǎn)量和品質(zhì)提供科學依據(jù)，也為進一步研究折耳根的有效利用和增強生產(chǎn)上番茄對灰霉病的抗性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為番茄（Solanum lycopersicum L. cv.浙雜809），種子購于浙江浙農(nóng)種業(yè)有限公司。供試番茄灰霉菌菌種由浙江大學蔬菜研究所師愷教授惠贈。

1.2 試驗設(shè)計

試驗在貴州大學農(nóng)學院園藝專業(yè)基礎(chǔ)實驗室進行。試驗分為2部分：第一部分是在番茄植株上進行抑菌活性鑒定試驗，即當番茄長到4葉1心時在番茄幼苗上進行抑菌活性鑒定試驗，設(shè)4個處理，每處理20株番茄幼苗，各處理詳見表1。第二部分是體外抑菌試驗，即采用培養(yǎng)基平板接種方法，設(shè)2個處理，每處理9個培養(yǎng)皿，試驗設(shè)計如表2所示。各部分試驗每個處理重復(fù)3次。

表1 番茄植株抑菌活性鑒定試驗設(shè)計

表2 折耳根提取液的體外抑菌試驗設(shè)計

1.3 試驗方法

1.3.1 折耳根提取液配制方法

折耳根提取液配制方法：選取新鮮折耳根的地下莖，先用自來水洗凈，再用蒸餾水沖洗3次，然后用吸水紙吸干莖段外面附著的水分。準確稱取折耳根地下莖10.0 g，置于研缽中研磨，研磨時可加入少量的石英砂，有助于研磨，隨后加入濃度為70%的乙醇200 mL，倒入250 mL的燒瓶中，于80 ℃水浴鍋中回流浸提6 h，然后于4 000 r/min條件下離心20 min，取上清液置于250 mL燒瓶中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙醇全部蒸發(fā)掉，最后剩下10 mL提取液用蒸餾水稀釋定容至300 mL并置于4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 番茄灰霉病菌培養(yǎng)及病菌懸浮液配制

番茄灰霉病菌的培養(yǎng)采用V8培養(yǎng)基（含體積比為36% V8蔬菜汁、2%瓊脂、0.2% CaCO3）在20～25 ℃避光條件下培養(yǎng)。待灰霉孢子長滿培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基后約10 d，將培養(yǎng)基上的菌絲塊用組培刀刮下后放入懸浮液（Tpeptonel 2%，Maltose 4%）中并劇烈渦旋以釋放孢子，再用4層紗布過濾，取含有灰霉菌孢子的濾液用血球計數(shù)板在光學顯微鏡下進行計數(shù)，并用懸浮液調(diào)節(jié)孢子濃度到2×105spores/mL。

1.3.3 在番茄植株上進行抑菌活性鑒定試驗

用稀釋500倍的折耳根提取液，于植株葉面均勻噴施，每處理20株番茄。24 h后，用濃度為2×105spores/mL的番茄灰霉病菌孢子懸浮液均勻噴施葉面，即接種于番茄植株上。

1.3.4 番茄灰霉病菌的體外抑菌活性鑒定方法

首先在超凈工作臺上配制培養(yǎng)基，采用V8培養(yǎng)基在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中倒板，待培養(yǎng)基冷卻后在一半培養(yǎng)基的正中位置放入1片直徑1 cm的無菌濾紙片，然后在濾紙片上按照試驗設(shè)計分別滴加10 μL的蒸餾水和折耳根提取液（未用濾膜器過濾），然后在培養(yǎng)基的另一半正中位置放入1片直徑1 cm的無菌濾紙片，無菌濾紙片的下表面預(yù)先輕輕蘸取灰霉菌的菌絲體，保證下表面被均勻覆蓋1層薄薄的灰霉菌孢子，而且下表面朝上置于培養(yǎng)基的另一半正中位置。將培養(yǎng)基在20～25 ℃避光條件下培養(yǎng)5 d后觀察體外抑菌試驗效果。

1.4 調(diào)查項目及方法

1.4.1 灰霉病發(fā)病率和病情指數(shù)分析

番茄植株接種灰霉病菌3 d后，觀察不同處理的番茄葉片灰霉病的發(fā)病情況，記錄發(fā)病葉片數(shù)和發(fā)病癥狀。發(fā)病癥狀按嚴重程度由輕到重依次記為0、I、II、III、IV 5個等級，分級標準為：0級，葉片正常；I級，葉片主葉尖處可見少數(shù)病斑；II級，葉片葉尖及主葉脈處分布病斑；III級，葉片葉尖有皺縮，葉片多部位分布病斑；IV級，葉片葉尖等部分有明顯皺縮，葉片全片葉可見病斑分布。每個處理至少統(tǒng)計50片番茄小葉，計算發(fā)病率和病情指數(shù)，計算方法：發(fā)病率＝（染病葉片數(shù)/調(diào)查總?cè)~片數(shù)）×100%；病情指數(shù)＝∑（各級葉片數(shù)×該級指數(shù)）/（總?cè)~片數(shù)×最高級別數(shù)）；相對防治效果＝（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

1.4.2 番茄葉片中灰霉生長量測定

PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min預(yù)變性；95 ℃變性10 s，58 ℃退火45 s，40個循環(huán)。在PCR循環(huán)反應(yīng)完成之后，熔解曲線表明生成的P C R產(chǎn)物均為單一物質(zhì)。以灰霉菌（B.cinerea）的Actin基因表達水平為指標，采用qRT-PCR測定接種后番茄葉片中灰霉生長量的變化情況。B. cinerea的Actin基因前引物序列為：ACTCATATGTTGGAGATGAAGCGCAA，后引物序列為：AATGTTACCATACAAATCCTTACGGACA。以番茄Actin基因表達水平作為內(nèi)參。內(nèi)參基因Actin的熒光值作為計算時的內(nèi)標，相對基因表達水平的計算參照Livak[10]的方法計算。

1.4.3 葉片葉綠素含量測定

番茄植株接種灰霉病菌3 d后剪取葉片樣品測定葉綠素含量，參照Arnon等[11]的方法測定。用直徑為1 cm的打孔器取0.3 g葉圓片加10 mL 80%丙酮遮光浸泡提取，直至肉眼觀察葉片完全變白為止。浸提液4 000 g離心10 min，取上清液1 mL，再加入2 mL 80%丙酮稀釋后，用島津紫外可見分光光度儀（SHIMADZU UV-2401PC）分別于663、645 nm和445.5 nm處測定吸光值，且吸光值為0.2～0.8時測定值有效。

1.4.4 脂氧合酶LOX活性測定

脂氧合酶（LOX）活性的測定參照陳昆松等[12]和姚先鋒等[13]的方法進行。

1.4.5 灰霉病菌體外抑菌試驗中菌絲生長情況測定

從番茄灰霉菌在培養(yǎng)基中的長勢及擴散半徑大小來判斷菌絲生長情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010、DPS和Origin軟件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、整理、分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄葉片表型

在番茄植株上進行的抑菌試驗中，接種病害3 d后，葉片表型顯示：番茄植株接種灰霉菌后葉片尖端有部分萎蔫的表現(xiàn)，葉背面可見分散的病斑，但較少。折耳根提取液預(yù)處理的葉片發(fā)病比蒸餾水預(yù)處理的對照葉片發(fā)病病狀輕一些。

2.2 灰霉病發(fā)病率和病情指數(shù)

如圖1A所示，在接種灰霉病菌3 d后，折耳根提取液預(yù)處理并接種灰霉菌處理組（H.houttuyniae+B. cinerea）的葉片灰霉病發(fā)病率為81.5%，顯著低于蒸餾水預(yù)處理并接種灰霉菌處理組（H2O+B. cinerea），表明折耳根提取液對番茄灰霉病的發(fā)生具有一定的防效。病情指數(shù)如圖1B所示，折耳根提取液預(yù)處理并接種灰霉菌處理組（H. houttuyniae+B. cinerea）的病情指數(shù)為3.0，顯著低于蒸餾水預(yù)處理并接種灰霉菌處理組（H2O+B. cinerea）的4.2病情指數(shù)，相對防治效果達到28.6%。

圖1 灰霉菌接種處理第3天的番茄發(fā)病情況

2.3 葉片灰霉病菌生長量

灰霉Actin的相對表達量可以準確迅速地反映出番茄葉片中灰霉病菌相對含量的多少，可作為番茄發(fā)病輕重的標志。如圖2所示，在接種病菌3 d后，“H. houttuyniae+B. cinerea”處理組的番茄葉片與“H2O+B. cinerea”間的灰霉生長量差異顯著，當“H2O+B. cinerea”處理組葉片灰霉Actin的相對表達量為1.000時，“H. houttuyniae+B. cinerea”處理組的降為0.575左右，顯著低于“H2O+B. cinerea”處理組，即灰霉生長量比對照幾乎減少了一半。由此表明，折耳根提取液對番茄灰霉病菌的生長有抑制作用、葉片發(fā)病程度減輕。

圖2 折耳根提取液預(yù)處理后番茄灰霉菌接種處理第3天的番茄葉片灰霉生長量的變化

2.4 葉片葉綠素含量

灰霉病菌侵染后葉片細胞逐漸發(fā)病乃至死亡，在此過程中伴隨著葉綠素的降解。如圖3所示，在接種灰霉病菌3 d 后，“H. houttuyniae+B. cinerea”處理組與“H2O+B. cinerea”處理組間的番茄葉片葉綠素a含量分別為4.96、 3.97 mg/L（圖3A），葉綠素b的含量分別為2.23、1.71 mg/L（圖3B），葉綠素a含量均顯著低于沒有接種病原菌的對照組“H2O+Mock”和“H. houttuyniae+Mock”，而葉綠素b含量顯著低于對照組“H2O+Mock”。說明灰霉病菌侵染會導(dǎo)致葉片的葉綠素降解、含量下降，折耳根提取液的應(yīng)用有利于緩解發(fā)病番茄葉片的葉綠素降解。

圖3 番茄灰霉菌接種處理第3天的番茄葉片葉綠素含量的變化

2.5 脂氧合酶LOX活性

脂氧合酶LOX為茉莉酸（JA）抗性信號路徑中的一個關(guān)鍵酶，可表征JA信號路徑抗性因子的活性。如圖4所示，不管是番茄葉片接種還是不接種灰霉病菌，折耳根提取液處理均導(dǎo)致葉片LOX酶活力顯著上升?！癏. houttuyniae+B. cinerea”處理組的葉片LOX活性為13.52 OD/g（FW），顯著高于“H2O+B. cinerea”處理組的10.92 OD/g（FW），表明折耳根提取液處理有助于激活JA抗性信號路徑，從而增強番茄對灰霉病的抗性。

圖4 番茄接種灰霉病原菌后葉片LOX活性變化

2.6 折耳根提取液對番茄灰霉病菌的體外抑菌活性的影響

如圖5所示，接種了同樣大小灰霉菌菌絲體的培養(yǎng)基上灰霉菌都有所生長，從番茄灰霉菌的長勢及擴散程度來看，在接種灰霉病菌的培養(yǎng)基中滴加折耳根提取液后灰霉病菌菌絲生長范圍小于滴加蒸餾水的對照，表明折耳根提取液對體外培養(yǎng)的番茄灰霉病菌生長有抑制作用。

圖5 折耳根提取液對番茄灰霉菌的體外抑菌活性鑒定

3 結(jié)論與討論

本文探討了折耳根提取液預(yù)處理對番茄葉片灰霉菌的生長和體外培養(yǎng)的灰霉菌生長的影響。在接種病害3 d后，折耳根提取液處理的葉片發(fā)病比蒸餾水處理的葉片輕，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為81.5%和3.0左右，相對防治效果達到28.6%；而且番茄葉片中的灰霉Actin相對表達量僅為0.575；折耳根提取液處理的葉片葉綠素a、b含量分別為4.96、2.23 mg/L，分別為蒸餾水處理的1.25倍和1.30倍；接種灰霉菌后，折耳根提取液處理的葉片LOX活性為13.52 OD/g（FW），而蒸餾水處理的僅為10.92 OD/g（FW）；體外抑菌圈試驗表明，折耳根提取液處理后灰霉菌的長勢及擴散程度小于蒸餾水對照的處理，表明折耳根提取液對體外培養(yǎng)的灰霉病菌也有抑制作用。但是，折耳根提取液對番茄灰霉菌的抑菌作用機制是什么，番茄對灰霉病的基礎(chǔ)抗性的提高是否與JA抗性路徑的增強有關(guān)。本試驗結(jié)果有待進一步驗證，相關(guān)研究有待進一步開展。