利妥昔單抗治療兒童原發(fā)性腎病綜合征機(jī)制的研究進(jìn)展

姚超 段培鋒

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒童消化與腎病科，濱州 256600

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是兒童常見的腎臟疾病，以大量蛋白尿、低蛋白血癥和/或水腫為臨床特征［1-2］，16歲以下兒童發(fā)病率為（1～3）/10萬［3］。其主要病理表現(xiàn)為微小病變型腎?。∕CGN）和局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）。90%的PNS對糖皮質(zhì)激素敏感，使用潑尼松2 mg/kg治療4周后，尿蛋白即可轉(zhuǎn)陰，稱為激素敏感型腎病綜合征（SSNS）。10%的PNS對糖皮質(zhì)激素治療無效，稱為激素抵抗型腎病綜合征（SRNS），同時50%～60%的SSNS表現(xiàn)為激素依賴或頻繁復(fù)發(fā)，稱為激素依賴型腎病綜合征（SDNS）或頻復(fù)發(fā)型腎病綜合征（FRNS）。為避免長期使用糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松、肥胖、垂體抑制等不良反應(yīng)［4］。RNS患兒常用環(huán)磷酰胺、霉酚酸酯、他克莫司/環(huán)孢素等免疫抑制劑進(jìn)行治療。然而即使糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑，仍有20%左右NS表現(xiàn)為復(fù)發(fā)或者依賴，且長期使用免疫抑制劑具有嚴(yán)重的腎臟毒性［4］，因此，迫切需要一種新的更加安全有效的藥物。

利妥昔單抗（rituximab，RTX）是一種針對CD20的單克隆抗體，最早用于治療成人復(fù)發(fā)的CD20陽性低級別淋巴瘤，近十年來，因其在治療兒童復(fù)雜腎病綜合征上的良好效果而備受關(guān)注［5］。近年關(guān)于其有效性和安全性的研究表明，相較于免疫抑制劑，RTX能顯著降低NS患者的蛋白尿水平，有效延長持續(xù)緩解時間，降低復(fù)發(fā)率［6］，且不良反應(yīng)相對較輕，亦不具有腎臟毒性［7］，因此，在NS治療領(lǐng)域，RTX是一種極具潛力的新型藥物。但目前對RTX治療PNS的研究多集中在其有效性和安全性上，對其緩解蛋白尿的具體機(jī)制研究較少?，F(xiàn)對近年來RTX緩解蛋白尿的機(jī)制研究進(jìn)行總結(jié)，以期為RTX治療PNS的臨床實(shí)踐及研究提供參考。

RTX通過與鞘磷脂磷酸二酯酶類酸3b（SMPDL-3b）結(jié)合阻止足細(xì)胞損傷

研究表明足細(xì)胞的損傷是導(dǎo)致蛋白尿的重要原因，而足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性對維持腎小球?yàn)V過屏障有著重要的作用［8］。足細(xì)胞復(fù)雜的三維形態(tài)依靠肌動蛋白相關(guān)的細(xì)胞骨架維持，細(xì)胞骨架的崩解是造成足細(xì)胞損傷的重要原因［9］。Palladin是一種與肌動蛋白有關(guān)的蛋白，在維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定性上起著重要作用［10］。Artelt等［10］研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，特異性敲除足細(xì)胞palladin的小鼠出現(xiàn)了腎小球形態(tài)紊亂，足細(xì)胞間隙增大，輕度凋亡。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病和FSGS患者的腎活檢標(biāo)本也顯示足細(xì)胞中Palladin的下調(diào)。這些研究表明，正常的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)對維持足細(xì)胞的功能有著重要作用。

SMPDL-3b是一種將鞘磷脂轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)修飾酶，在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和足細(xì)胞上顯著表達(dá)［11］。SMPDL-3b通過負(fù)性調(diào)節(jié)toll樣受體參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、足細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)及固有免疫的負(fù)性調(diào)節(jié)［12］。SMPDL-3b已被報(bào)道參與足細(xì)胞細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)。Ahmad等［13］發(fā)現(xiàn)輻射能誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架重塑，但高表達(dá)SMPDL-3b的足細(xì)胞能在輻射下保持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定，同時SMPDL-3b的下調(diào)使足細(xì)胞更容易發(fā)生肌動蛋白的重塑。

Fornoni等［14］對12例未復(fù)發(fā)的FSGS患者和8例復(fù)發(fā)的FSGS患者進(jìn)行腎臟活檢分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)型FSGS患者SMPDL-3b+足細(xì)胞的數(shù)量低于非復(fù)發(fā)型FSGS。同時用正常人的血清和反復(fù)復(fù)發(fā)的FSGS患者血清分別體外培養(yǎng)足細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與正常人血清培養(yǎng)的足細(xì)胞相比，反復(fù)復(fù)發(fā)的FSGS患者血清培養(yǎng)的足細(xì)胞其SMPDL-3b mRNA明顯下調(diào)。這表明SMPDL-3b在反復(fù)復(fù)發(fā)的FSGS患者中表達(dá)下降。但RTX可以阻止足細(xì)胞中SMPDL-3b的下調(diào)。Takahashi等［15］分別用RTX（10 mg/kg）和提純的人免疫球蛋白（Ig）G治療阿奇霉素誘導(dǎo)的腎病大鼠，每周1次，分別于第1、5、7、14、28天采集尿液標(biāo)本，用免疫熒光染色和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測蛋白尿、SMPDL-3b和足細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)。免疫熒光顯示，在第28天時，用RTX治療的大鼠其SMPDL-3b及SMPDL-3 bmRNA的表達(dá)明顯高于人IgG處理組（P＜0.001），高于正常組（P＜0.01）。此外，用RTX處理正常大鼠，注射RTX 24 h后，SMPDL-3b mRNA的表達(dá)明顯增高（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，RTX能通過與SMPDL-3b的結(jié)合，阻止SMPDL-3b在足細(xì)胞內(nèi)的下調(diào)，從而穩(wěn)定足細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架，避免足細(xì)胞損傷，緩解蛋白尿。

但部分學(xué)者對于RTX是否與SMPDL-3b特異性結(jié)合仍有質(zhì)疑。Kim等［16］用RTX和抗透明質(zhì)酸（HA）標(biāo)記抗體孵育非固定細(xì)胞，在表達(dá)HA-SMPDL-3b的293T細(xì)胞中，可用HA抗體進(jìn)行染色，但不能用RTX進(jìn)行染色。并且當(dāng)細(xì)胞在抗體染色前用多聚甲醛固定時，Kim等［16］觀察到RTX與細(xì)胞的結(jié)合與SMPDL-3b的表達(dá)無關(guān)。在過表達(dá)HA-SMPDL-3b的HeLa細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，RTX在體內(nèi)可能不與SMPDL-3b結(jié)合，RTX對腎病的療效可能并不是通過與SMPDL-3b結(jié)合直接調(diào)節(jié)足細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。

RTX通過耗竭B細(xì)胞參與蛋白尿的緩解

B細(xì)胞作為一種免疫細(xì)胞參與NS的發(fā)病。Dossier等［17］發(fā)現(xiàn)特發(fā)性腎病綜合征（INS）患者外周血總B細(xì)胞計(jì)數(shù)在緩解期明顯減少。Colucci等［18］對INS患兒在使用糖皮質(zhì)激素治療前進(jìn)行采血，發(fā)現(xiàn)較對照組而言，INS患兒的B細(xì)胞明顯增多。Kidoguchi等［19］也曾報(bào)道過1例由彌漫性大B細(xì)胞瘤繼發(fā)膜性腎病的病例。這些證據(jù)表明，B細(xì)胞可能在NS的發(fā)展中起著重要作用。

CD20抗原是一種高表達(dá)于前期至晚期B淋巴細(xì)胞上的磷酸化蛋白，在B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞后消失。CD20通過調(diào)節(jié)跨膜鈣離子流，對B細(xì)胞的增殖和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用［20］。RTX作為一種人鼠嵌合單克隆抗體，其鼠源區(qū)Fab段能特異性和CD20結(jié)合，通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用以及啟動Caspase-3介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制清除B細(xì)胞［21］。

1、RTX減少炎癥因子的分泌

B細(xì)胞源性細(xì)胞因子是NS發(fā)病的重要原因。B細(xì)胞激活后會分泌各種細(xì)胞因子，包括干擾素-γ、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-10、IL-13等［22］，這些細(xì)胞因子介導(dǎo)足細(xì)胞的免疫損傷。Kim等［16］在小鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)IL-4、IL-13通過激活酪氨酸激酶JAK1和JAK3，啟動轉(zhuǎn)錄因子STAT6，促進(jìn)肌動蛋白骨架的形成，誘導(dǎo)足細(xì)胞褶皺、足突消失。McDonald等［23］研究發(fā)現(xiàn)RTX可以降低特異性濕疹患者血清中IL-13的水平。Ma等［24］將野生型雄性C57BL/6J小鼠采用腹橫主動脈縮窄法進(jìn)行壓力負(fù)載，然后靜脈注射RTX 4周，用實(shí)時熒光定量PCR分析心臟組織中IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA水平（6例）。免疫印跡顯示，與對照組相比，RTX顯著降低促炎細(xì)胞因子mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，同時細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、STAT3、轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子β（TGFβ）/Smad2/3和IKKα/β/核 轉(zhuǎn) 錄 因子-κB（NF-κb）等多種信號通路顯著減少。這表明RTX阻斷了CD20介導(dǎo)的B細(xì)胞激活，從而抑制IKK/NF-κb信號通路介導(dǎo)的促炎因子的釋放，阻止炎癥因子對足細(xì)胞的損傷。

2、RTX抑制抗體的分泌

B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞后分泌的抗體也參與NS的發(fā)病，RTX能間接抑制抗體的分泌。在部分腎病患兒體內(nèi)觀察到Ig水平出現(xiàn)明顯改變，表現(xiàn)為急性期IgG明顯降低及IgE明顯升高。Jamin等［25］亦觀察到部分INS患者外周血抗泛素羧基末端水解酶-1（UCHL-1）抗體明顯升高，而健康對照組則未曾檢測到此抗體。正常小鼠注入U(xiǎn)CHL-1抗體可以誘導(dǎo)足突廣泛融合并產(chǎn)生大量蛋白尿，提示該抗體可能參與了部分INS患者的發(fā)病。Ma等［24］用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法分析腹橫主動脈縮窄誘發(fā)心肌重構(gòu)患者體內(nèi)的Ig水平，發(fā)現(xiàn)RTX處理組的IgG水平較對照組明顯下降，提示RTX可能降低B細(xì)胞分泌抗體的水平。分泌抗體的漿細(xì)胞表面并不表達(dá)CD20，故RTX并不直接抑制漿細(xì)胞抗體分泌。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-10等能刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，而RTX能阻斷CD20介導(dǎo)的B細(xì)胞活化，從而減少Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，間接導(dǎo)致抗體水平的降低［24］。

RTX通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群緩解蛋白尿

一直以來，T細(xì)胞就被認(rèn)為是造成足細(xì)胞損傷的主要免疫細(xì)胞。早在40多年前，Shalhoub［26］認(rèn)為MCGN是由功能失調(diào)T細(xì)胞產(chǎn)生的循環(huán)因子誘導(dǎo)的。近年來研究表明，T細(xì)胞是足突消失和誘發(fā)蛋白尿的主要效應(yīng)細(xì)胞。T細(xì)胞亞群失衡及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）數(shù)量和功能的下降在蛋白尿的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用［27］。

Th1/Th2的平衡對維持機(jī)體正常的免疫功能至關(guān)重要，Th1/Th2失衡與自身免疫性疾病、過敏性疾病、腫瘤和移植排斥反應(yīng)等的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系［28］。Kanai等［29］用配對樣本來測量SSNS患者中Th1/Th2比率和Th1和Th2分泌的細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)在SSNS活動期Th1細(xì)胞明顯降低，Th2細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-5明顯升高，Th1/Th2比值下降，而在緩解期，Th1和Th2的水平趨于正常。這提示INS的發(fā)病與Th1/Th2比例失衡造成的T細(xì)胞免疫功能紊亂存在著密切關(guān)系。近些年有研究表明RTX可以重塑Th1和Th2的亞群比例。Bhatia等［28］進(jìn)行一項(xiàng)前瞻性研究，他們采集了18例SDNS患者在RTX治療前、1個月、1年后及首次復(fù)發(fā)時的血液和尿液樣本，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測樣本中T淋巴細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和比例，發(fā)現(xiàn)在RTX治療后Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)下降（P=0.004 1），而Th1計(jì)數(shù)無顯著差異；在復(fù)發(fā)患者中，Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)增加（P=0.007 8）。與對照組相比，患者的Th1/Th2比值更低［患者基線：7.7（3.2～13.2）比對照組15.9（10.5～20.4）；P=0.001 8］，RTX治療1個月后，這一比例增至14.0（6.6～24.5）（P=0.010 2），但在復(fù)發(fā)期，Th1/Th2比值又明顯下降。這些結(jié)果表明RTX可以降低Th2細(xì)胞的絕對數(shù)量，從而上調(diào)Th1/Th2的細(xì)胞亞群比例，改善T細(xì)胞亞群失衡引起的免疫紊亂狀態(tài)。

Treg功能紊亂及輔助性T細(xì)胞17（Th17）/Treg比例失衡是INS發(fā)生發(fā)展的另一個重要原因。Chan等［30］發(fā)現(xiàn)INS患兒Treg增多時，蛋白尿明顯減少。Li等［31］發(fā)現(xiàn)INS兒童外周血單核細(xì)胞中Th17細(xì)胞增多，Treg數(shù)目減少。Th17能促進(jìn)足細(xì)胞發(fā)生凋亡［32］，但其導(dǎo)致蛋白尿的機(jī)制尚不十分清楚，Wang等［32］認(rèn)為可能和Th17誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架蛋白穩(wěn)定性下降有關(guān)，而Treg可以阻止這一過程。最近的研究表明，RTX可以增加Treg數(shù)量并恢復(fù)其調(diào)節(jié)功能。Garin等［33］曾用流式細(xì)胞術(shù)檢測接受RTX治療的慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）患者的Treg，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，ITP患者的Treg數(shù)量減少，抑制能力缺陷，但在使用RTX治療后，Treg的數(shù)量及調(diào)節(jié)功能均明顯恢復(fù)。也有報(bào)道指出，活動性膜性腎病患者在使用RTX獲得臨床緩解后，Treg比基線增加了10倍［34］。Bhatia等［28］的前瞻性試驗(yàn)顯示，與對照組相比，SDNS患者在RTX治療1月后，Th17細(xì)胞的中位數(shù)比例由1.3降至0.7（P=0.025），Th17的絕對值計(jì)數(shù)也隨之下降，患者的Treg比值隨之上升（P=0.000 2）。這些研究結(jié)果表明RTX可以影響T細(xì)胞的分化，下調(diào)Th17的表達(dá)，上調(diào)Treg的數(shù)量及活性，通過重置Th17/Treg比例改善紊亂的T細(xì)胞免疫，從而達(dá)到蛋白尿的緩解。

目前關(guān)于RTX如何影響Treg和Th17的具體機(jī)制尚不十分清楚，可能和其B細(xì)胞耗竭有關(guān)。Chan［30］推測RTX可能是通過耗竭B細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-6和TGFβ來調(diào)節(jié)Th17的分化。有研究表明RTX可以降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的局部Th17反應(yīng)，但在B細(xì)胞缺失的情況下，RTX對Th17的抑制效應(yīng)消失，提示B細(xì)胞在Th17反應(yīng)的發(fā)展中起到了重要作用，為RTX通過耗竭B細(xì)胞來抑制Th17反應(yīng)提供了證據(jù)［35］。Ciccia等［36］則認(rèn)為RTX通過誘導(dǎo)肥大細(xì)胞的凋亡來抑制Th17的分化和IL-17的釋放。Eggleton和Bremer［37］則在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)生IL-17的CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞（“雙陰性”T細(xì)胞）和CD4+Th17在細(xì)胞表面共表達(dá)CD20。Holley等［38］亦在多發(fā)性硬化患者的血液和大腦中發(fā)現(xiàn)CD20+Th17細(xì)胞。這表明，部分T細(xì)胞可以直接表達(dá)CD20，而RTX可以通過和T細(xì)胞表面的CD20分子特異性結(jié)合，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的直接耗竭。但具體相關(guān)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

結(jié)語與展望

INS是兒童常見的腎臟疾病，RTX治療INS，尤其是難治性腎病綜合征的有效性和安全性越來越受到肯定。RTX一方面通過非免疫調(diào)節(jié)作用，穩(wěn)定足細(xì)胞的細(xì)胞骨架，避免足細(xì)胞的崩解，另一方面通過調(diào)控免疫細(xì)胞數(shù)量及亞群，重塑失衡的免疫功能，避免足細(xì)胞的免疫損傷。但有些具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步的探索和研究。