肺炎支原體感染的致病機制及實驗室檢測

陳晗璐 吳盛海,2

1 浙江中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院, 杭州 310006；2 浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院檢驗科，杭州 310006

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae）是 1944 年 Eaton等[1]通過組織培養(yǎng)，首次從一名原發(fā)性非典型肺炎患者的痰液中分離而來，被稱為“Eaton”病原體。 肺炎支原體感染除引起下呼吸道感染 (LRTIs) 外，還可以累及其他器官，包括皮疹和黏膜炎癥[2]、多形性紅斑[3]和Stevens-Johnson 綜合征/中毒性表皮壞死松解癥[4]以及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和血液系統(tǒng)癥狀等，還可以引起原發(fā)性體液免疫缺陷患者的關節(jié)炎[5]以及兒童哮喘[6]。 由于許多臨床指南并不推薦病原學檢測作為肺炎支原體感染的治療依據(jù)，臨床醫(yī)生往往通過經(jīng)驗性使用大環(huán)內酯類抗菌藥物進行治療。 目前肺炎支原體對大環(huán)內酯類藥物耐藥性不斷上升， 包括中國在內的亞洲國家耐藥率高達70%~100%[7-8]，因此抗感染治療的效果被高估，導致患者不能得到及時有效的治療， 極有可能會導致其他病原體的合并感染，引起更為嚴重的后果。 本文就肺炎支原體感染的主要致病機制及實驗室檢測研究進展進行綜述。

一、肺炎支原體感染的流行病學特征

肺炎支原體主要通過呼吸道飛沫在人際間傳播，引起呼吸道感染，多見于兒童和老年人。 肺炎支原體感染占社區(qū)獲得性細菌性肺炎發(fā)病的4%~8%，流行期間可達20%，密切接觸者高達70%[9-11]。 肺炎支原體感染的暴發(fā)通常發(fā)生在新兵營、醫(yī)院、療養(yǎng)院和其他長期護理機構等人群密集機構[12]，5%~10%的肺炎支原體感染者會發(fā)展成肺炎支原體肺炎[13]。 我國尚未開展全國性肺炎支原體感染流行病學相關監(jiān)測，總體發(fā)病率尚不清楚。 在呼吸道感染的患兒中，肺炎支原體的構成比為20%~30%，不同的地區(qū)有所差異，女童要明顯高于男童[14-15]。

肺炎支原體的分型主要包括基于黏附素蛋白P1 的分型、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(MLVA)、細菌多位點序列分型(MLST) 和單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因分型等方法，其中P1 分型和MLVA 應用比較廣泛[16]。 不同地區(qū)流行的型別，菌株耐藥性均有不同。 中國以P1 中的1 型為主，這種耐藥主要與23S rRNA V 區(qū) A2063G 突變相關， 且這種耐藥菌株主要集中在MLVA 分型中的 M4-5-7-2 型[7]。

二、肺炎支原體致病機制

1. 黏附與滑動

掃描電鏡顯示，肺炎支原體呈逗號形或梭形，一端有一種復雜而特殊的附著細胞器（OA），這是一個與細胞膜連續(xù)的長約290 nm 的極性細胞突起[17]，其與宿主上皮細胞緊密連接，保護它不被宿主的上皮細胞纖毛清除機制清除。 OA 中存在兩大類與運動和細胞黏附相關的蛋白質：一類是與黏附和滑動直接相關的蛋白質，另一類是以細胞骨架核心的形式提供潛在結構和組織支持的蛋白質。 肺炎支原體的細胞骨架核心是OA 形成和黏附素定位到該細胞極所必需的, 高分子量蛋白(HMW)1 和HMW2 構成細胞骨架結構的平行薄板和厚板。HMW3 和P65 形成遠端復合體，與跨膜的P30 連接。 近端的碗狀復合體包括 P200、MPN387、P41、TopJ 和 P24，其中 P200和MPN387 都與運動有關，P41 在穩(wěn)定OA 中起關鍵作用[16]。此外，宿主受體部分的性質和密度也反過來影響肺炎支原體的滑動，進而影響肺炎支原體的致病機制和感染結局[18]。對肺炎支原體滑行的研究表明，這種滑行運動是持續(xù)圍繞極性的突起旋轉，肺炎支原體的這種黏附和滑動能力參與了感染過程，使其能夠從支氣管纖毛尖端轉移到宿主細胞表面[19]。

2. 吞噬與融合

肺炎支原體是黏膜病原體， 存在于上皮細胞外表面，已經(jīng)證實其可以通過與非正常吞噬的宿主細胞融合并進入宿主細胞[20]。 Dallo 和Baseman[21]報道了肺炎支原體可以在人工細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中存活、合成DNA 并進行復制。 肺炎支原體在細胞內存活可能與感染的潛伏期或慢性感染相關，進而逃避機體的免疫機制，促進其跨越黏膜屏障進入內部組織，因此也削弱了某些藥物治療的療效，導致臨床治愈困難[20]。 膜融合還可引起細胞膜受體識別位點的變化，影響細胞間的信號傳遞和細胞因子的產生[22]。目前，肺炎支原體在體內的侵襲和細胞內復制的程度尚不清楚。

3. 細胞毒性

黏附為肺炎支原體誘導局部細胞毒作用提供了條件。 肺炎支原體黏附在支氣管細胞表面后，穿透支氣管黏膜，釋放核酸酶和過氧化氫，導致支氣管上皮細胞腫脹、壞死和結合，微絨毛運動減慢，從而誘導淋巴細胞、漿細胞和單核細胞的浸潤[23-24]，這些作用可能與肺炎支原體呼吸道感染的臨床表現(xiàn)相關，比如常見的持續(xù)性干咳。 一旦肺炎支原體到達下呼吸道，可能被激活的補體或抗體結合，從而導致巨噬細胞向感染部位趨化遷移并開始吞噬，臨床表現(xiàn)為肺泡液中有高比例的中性粒細胞和淋巴細胞[25]。 肺炎支原體可能通過自身產生過氧化氫來調節(jié)感染的上皮細胞脫落，這一機制有助于維持它的定植狀態(tài)[26]。最近研究發(fā)現(xiàn)，社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素 (CARDST) 是肺炎支原體的重要毒力因子。 肺炎支原體接觸宿主細胞后， 誘導其毒素編碼基因 (MPN372) 轉錄，CARDST 水平升高。 在動物模型中， 肺炎支原體的CARDST水平與疾病嚴重程度之間的正相關性進一步揭示了這種毒素作為疾病決定因素的重要性[27]。

4. 機體的免疫反應和炎癥損傷

一旦肺炎支原體到達下呼吸道， 就會被抗體和補體調理，然后被激活的巨噬細胞吞噬。 中性粒細胞浸潤對肺炎支原體肺炎的肺損傷有促進作用， 但不參與清除肺炎支原體，電鏡下顯示中性粒細胞表面附著并吞噬肺炎支原體，吞噬泡中的肺炎支原體依舊活躍[28]。Lai 等[29]在小鼠模型中證明了肺巨噬細胞在控制肺炎支原體感染中的重要作用。 巨噬細胞的激活及隨后對肺炎支原體的殺滅依賴于Toll 樣受體(TLR)，特別是TLR2 的識別[30-31]。 肺炎支原體以熱休克蛋白(HSP-1)依賴的方式誘導TLR2 的表達，TLR2 的過度表達與大量肺炎支原體的相互作用導致免疫細胞的過度活化有關，并因此誘導肺炎支原體相關的并發(fā)癥[32]。

肺炎支原體感染產生的特異性分泌型免疫球蛋白（sIgA）可以保護呼吸道黏膜免受再次感染，肺炎支原體肺炎急性期和恢復期血清中IgG、IgM、IgA 和免疫復合物含量均顯著升高，重癥患者更為明顯[33]。 雖然已知B 細胞，主要是通過IgG介導參與肺炎支原體在肺部的清除， 但在上呼吸道肺炎支原體清除方面的作用有限[34-35]。 肺炎支原體不僅是一種感染源，對某些個體也是一種過敏原。 MP 的P1 蛋白可誘導P1 特異性IgE 的產生， 從而誘發(fā)IgE 介導的氣道炎癥和氣道高反應性[36]。 慢性穩(wěn)定期哮喘患者的呼吸道檢出肺炎支原體陽性率高于非哮喘患者[37]，但肺炎支原體是否是哮喘的主要原因尚不清楚。

三、肺炎支原體實驗室檢測方法

肺炎支原體感染實驗室檢測包括肺炎支原體培養(yǎng)、肺炎支原體抗原檢測、肺炎支原體血清學檢測以及分子生物學方法檢測肺炎支原體及其耐藥基因等。

1. 肺炎支原體培養(yǎng)

由于肺炎支原體生長緩慢， 需要3～4 周甚至更久的時間，因此肺炎支原體培養(yǎng)方法在實驗室并不被常規(guī)使用。 目前市面上出售的肺炎支原體快速培養(yǎng)檢測試劑盒主要利用的是肺炎支原體分解葡萄糖產酸使液體培養(yǎng)基pH 改變，從而導致酚紅指示劑變色。 由于上呼吸道存在唾液支原體、口腔支原體以及其他菌群的正常定植，往往會導致結果解釋困難，需要通過PCR 方法確認。 盡管肺炎支原體培養(yǎng)很少用于指導急性肺炎支原體感染的治療，但通過培養(yǎng)獲得分離菌株從而進行抗菌藥物敏感性試驗和（或）分型，對獲得流行病學相關數(shù)據(jù)，并指導肺炎支原體感染的防控和經(jīng)驗治療具有極大價值。 如何優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)流程，是臨床微生物工作者有待解決的難題[38-39]。

2. 抗原檢測

抗原檢測用于直接檢測樣本中肺炎支原體特異性抗原，陽性結果可作為早期感染依據(jù)之一。 樣本處理后加入鼠抗人肺炎支原體單克隆抗體，應用熒光素標記羊抗鼠抗體IgG 來檢測抗原，通過觀察被特異熒光標記的肺炎支原體來判斷是否感染[40]。量子點是一種新型熒光材料，量子點免疫層析技術是近年發(fā)展起來的抗原、抗體快速檢測方法。 采用該方法檢測肺炎支原體天然抗原最低檢測限為0.38 μg/mL，與PCR 熒光探針法比較，總符合率達到95.4%[41]。

3. 血清學檢測

肺炎支原體感染人體后產生相應的IgA、IgM、IgG 類抗體，不同類型抗體的出現(xiàn)、達峰和維持時間不同。 在最初感染之后， 正常的免疫系統(tǒng)針對蛋白質和糖脂抗原產生抗體，包括對P1 黏附素蛋白和CARDST 抗體， 通常可在臨床疾病發(fā)作后約1 周內檢測到IgM/IgA， 隨后約2 周后檢測到IgG，抗體水平在3~6 周后達到峰值，隨后在數(shù)月至數(shù)年內逐漸下降[16]。

血清學檢測方法主要包括補體結合試驗(CFA)、膠體金免疫層析法(GICA)、間接免疫熒光試驗(IFA)、ELISA、顆粒凝集試驗(PA)和冷凝集實驗（CAT）等。 目前實驗室最常用的為ELISA 和PA。 ELISA 具有較高的靈敏度和特異性，可定量檢測血清 IgA、IgM 和IgG 抗體表達；PA 試驗采用混合肺炎支原體抗原同時檢測IgM 和IgG，檢測方法重復性好，具有較好的特異性和靈敏度[41]。 作為肺炎支原體感染的實驗室檢測手段之一，血清學方法具有先天的不足，包括試驗方法缺乏統(tǒng)一標準，對于陽性結果的判定及其應用價值尚未達成共識[16]等。一般患者急性期和恢復期血清滴度呈4 倍增高可診斷肺炎支原體現(xiàn)癥感染[42]，但往往是回顧性診斷，臨床應用價值有限。

4. 分子生物學檢測

核酸擴增檢測技術(NAATs) 具有特異性高、樣本周轉時間短、檢測速度快等優(yōu)點，聯(lián)合血清抗體檢測，可為診斷肺炎支原體提供明確依據(jù)。 盡管缺乏廣泛的培養(yǎng)驗證，但NAATs由于具有更高的分析靈敏度和更短的周轉時間，使其被認為是新的“金標準”，例如FilmArray 可以同時檢測包括肺炎支原體在內的20 種不同的呼吸道細菌和病毒[43]，GeXP 可以同時檢測11 種引起呼吸道感染的病原體[44]。 基于NAATs 開發(fā)的POCT 方法在肺炎支原體單一病原檢測也是目前研究的熱點，Smart Gene 和ELITech 不僅能夠完成肺炎支原體檢測，還可以檢測肺炎支原體23S rRNA 基因V 區(qū)點突變情況， 能進一步指導臨床醫(yī)生在抗感染治療中的藥物選擇[45]。

四、結語與展望

下呼吸道感染是全世界5 歲以下兒童發(fā)病和死亡的主要原因，其中肺炎是重要的原因之一[46]。引起肺炎的病原學復雜，且臨床表現(xiàn)缺乏特異性，因此，在肺炎支原體感染的診斷中， 涵蓋多靶位的下呼吸道感染病原NAATs 方法具有重要價值。 由于肺炎支原體缺乏細胞壁，加上經(jīng)驗性大環(huán)內酯類抗菌藥物的使用，導致肺炎支原體耐藥性增加，應對肺炎支原體感染的預防和控制，靶點藥物和疫苗具有較好的臨床應用前景。 雷帕霉素激酶抑制劑作為一種大環(huán)內酯類化合物和細胞增殖抑制劑，最有希望成為危重肺炎支原體肺炎治療的候選藥物[47]。 有學者針對 T 細胞(HTL 和 CTL)、B 細胞和 IFN-γ篩選的4LBL、7CTL 和5HTL 表位，利用免疫學技術和分子對接相結合的方法設計的針對肺炎支原體的多表位疫苗[48]，可以通過選擇和組合最有效的抗原表位來誘導細胞和體液免疫應答，與減毒疫苗或滅活疫苗相比，這種疫苗可以誘導強烈的免疫反應，并且不良反應較小。 總之，研究肺炎支原體感染過程中與機體相互作用的機制，對于開發(fā)新的診斷和治療方法具有重要的現(xiàn)實意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突