短時(shí)二次取精對(duì)精液質(zhì)量及精子動(dòng)態(tài)指標(biāo)的影響

陳良師，黃悅悅，張小慧，施 文，韋娉嬪，李政達(dá)，毛獻(xiàn)寶，王世凱，薛林濤

近年來(lái)，由于受到飲食習(xí)慣、環(huán)境污染及工作壓力等因素影響，男性不育的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為臨床上亟待解決的問(wèn)題。精液質(zhì)量分析是男性生育力評(píng)估的最基本依據(jù)，是男性不育臨床診斷及治療評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)，但是精液質(zhì)量受到多方面因素影響，而禁欲時(shí)間就是其中一個(gè)重要因素。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)建議精液質(zhì)量分析前男性禁欲時(shí)間為2～7 d，但是近年有研究發(fā)現(xiàn)禁欲時(shí)間縮短對(duì)精液質(zhì)量有顯著影響，同時(shí)精子及精漿蛋白表達(dá)譜呈現(xiàn)明顯差異，因此，短時(shí)二次取精對(duì)精液質(zhì)量的具體影響有待進(jìn)一步探討。本研究選擇接受體外受精助孕的夫婦，取卵當(dāng)日男方一次取精后2 h內(nèi)進(jìn)行短時(shí)二次取精，通過(guò)比較不同分組精液質(zhì)量及精子動(dòng)態(tài)指標(biāo)的差異，探討禁欲時(shí)間對(duì)精液質(zhì)量的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

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研究對(duì)象 選擇2016年5月至2020年6月在我院接受體外受精助孕的夫婦65對(duì)。男方平均年齡(37.14±6.41)歲，女方平均年齡(35.10±4.90)歲，不孕不育年限(3.59±2.80)年。65例男性患者均完成第一次取精，3例患者由于個(gè)人原因拒絕短時(shí)二次取精，3例短時(shí)二次取精失敗，59例完成短時(shí)二次取精。最終納入這59例男性作為研究對(duì)象。

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納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)不育年限1～7年；(2)男方染色體檢查正常，排除了女方不孕因素；(3)男方無(wú)嚴(yán)重少弱精子癥、無(wú)性功能障礙和生殖系統(tǒng)感染等疾病；(4)取卵日第一次取精精液優(yōu)化后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)<1.0×10，在2 h內(nèi)進(jìn)行第二次取精。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫妻有遺傳性疾病家族史；(2)逆行射精男性；(3)男方3個(gè)月內(nèi)服用抗癲癇藥或抗腫瘤藥等影響精子活力藥物。

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方法

1.3.1 標(biāo)本采集 所有取精者在標(biāo)本采集前禁欲2～7 d，通過(guò)手淫法采集標(biāo)本，將精液射入清潔廣口無(wú)菌塑料杯中，置于37 ℃孵育箱中液化，待精液完全液化后在30 min內(nèi)進(jìn)行精液分析。之后在2 h內(nèi)進(jìn)行第二次取精。

1.3.2 精液分析 初步通過(guò)肉眼觀察精液外觀和液化程度，測(cè)量精液標(biāo)本體積。待精液完全液化后充分混勻，用加樣器取2 μl精液置于37 ℃預(yù)熱5 min以上的一次性精子計(jì)數(shù)板(GoldCyto，西班牙)，待精液樣本停止漂移(60 s內(nèi))，采用SCA精子動(dòng)態(tài)圖像自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)(MicroPtic，西班牙)在100倍負(fù)相差顯微鏡下隨機(jī)選擇至少6個(gè)視野，對(duì)至少200條精子進(jìn)行分級(jí)分析。通過(guò)人工觀察、核對(duì)，適當(dāng)刪除精液分析系統(tǒng)識(shí)別錯(cuò)誤的精子并分類標(biāo)記，每份標(biāo)本均在2～3 min內(nèi)完成檢測(cè)，獲得精子濃度、精子總數(shù)、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率及直線性百分率等指標(biāo)參數(shù)。

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觀察指標(biāo) (1)精子活力指標(biāo)。前向運(yùn)動(dòng)：精子主動(dòng)地呈直線或沿一大圓周運(yùn)動(dòng)，無(wú)論其速度如何。非前向運(yùn)動(dòng)：其他非前向運(yùn)動(dòng)的形式，如以小圓周泳動(dòng)，尾部動(dòng)力幾乎不能驅(qū)使頭部移動(dòng)，或者只能觀察到尾部擺動(dòng)。不動(dòng)精子：沒(méi)有運(yùn)動(dòng)。(2)精子運(yùn)動(dòng)速率指標(biāo)。曲線運(yùn)動(dòng)速率：精子頭沿其實(shí)際曲線，以二維方式運(yùn)動(dòng)軌跡的時(shí)均速率。直線運(yùn)動(dòng)速率：精子頭在開(kāi)始檢測(cè)時(shí)的位置與最后所處位置之間的直線運(yùn)動(dòng)的時(shí)均速率。平均路徑速率：精子頭沿其平均路徑移動(dòng)的時(shí)均速率。(3)精子運(yùn)動(dòng)方式指標(biāo)。直線性：曲線路徑的直線性。前向性：平均路徑的直線性。擺動(dòng)性：實(shí)際的曲線路徑中關(guān)于平均路徑的擺動(dòng)值。(4)精子空間位移指標(biāo)。精子頭側(cè)擺幅度：精子頭關(guān)于其平均路徑的側(cè)向位移幅度，以側(cè)擺的最大值或平均值表示。鞭打頻率：精子曲線路徑跨越其平均路徑的平均頻率。正常參考值：前向運(yùn)動(dòng)精子百分率≥32%，前向運(yùn)動(dòng)精子百分率+非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率≥40%，精子濃度≥15×10/ml，圓細(xì)胞濃度≤1.0×10/ml，一次射精精子總數(shù)≥39×10，精液體積≥1.5 ml。

2 結(jié)果

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59例取精者兩次取精一般指標(biāo)結(jié)果比較 短時(shí)二次取精的精液體積、不動(dòng)精子濃度、不動(dòng)精子百分率小于一次取精，前向運(yùn)動(dòng)精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率大于一次取精，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05)。兩次取精的精液濃度、圓細(xì)胞濃度、非前向運(yùn)動(dòng)精子濃度水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 59例取精者兩次取精一般指標(biāo)結(jié)果比較

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59例取精者兩次取精的精子動(dòng)態(tài)指標(biāo)比較 短時(shí)二次取精的曲線運(yùn)動(dòng)速率、直線運(yùn)動(dòng)速率、平均路徑速率、鞭打頻率和前向性占比均大于一次取精，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 59例取精者兩次取精的精子動(dòng)態(tài)指標(biāo)比較

3 討論

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精液是附睪內(nèi)儲(chǔ)存高度濃縮的精子懸液與附性腺分泌液的混合物。其中90%的精液體積由前列腺和精囊腺的分泌液組成，其分泌量決定了精液體積的大小。而精囊腺和前列腺的分泌液存貯在其特有組織學(xué)皺襞中，容量與禁欲持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示短時(shí)二次取精所得精液體積小于一次取精，這與Keihani等的報(bào)道結(jié)果相似。但是，本研究結(jié)果顯示短時(shí)二次取精的精子運(yùn)動(dòng)能力較一次取精顯著改善。附屬性腺分泌液內(nèi)含高濃度的果糖和前列腺素，其中果糖為精子提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，前列腺素可促進(jìn)射精時(shí)尿道平滑肌收縮，刺激精子活動(dòng)。在射精過(guò)程中，精液會(huì)分成數(shù)段按照順序射出，一次射精不能完全排空在附睪中存儲(chǔ)的精子，有些精子會(huì)繼續(xù)留存。若禁欲時(shí)間較長(zhǎng)，留存精子發(fā)生氧化應(yīng)激和自然老化程度加深，從而導(dǎo)致毒性物質(zhì)累積，附睪內(nèi)的pH值發(fā)生改變，精子活動(dòng)力隨之下降。另外，隨著新精子發(fā)生，附睪中存儲(chǔ)的精子進(jìn)一步增多，分泌液中的果糖不能為新生成的精子提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，加上長(zhǎng)時(shí)間禁欲使精子生存環(huán)境惡化，前列腺素不能有效刺激平滑肌的收縮，導(dǎo)致射出的精子獲能不足。既往也有研究結(jié)果證實(shí)，通過(guò)縮短禁欲時(shí)間，減少精子從生成到離體時(shí)間，能夠提高精子活力。

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精子運(yùn)動(dòng)指標(biāo)可反映精子離體以后獲得自主運(yùn)動(dòng)的能力，精子特征性自主運(yùn)動(dòng)有利于穿過(guò)卵子復(fù)合物和透明帶，是體外受精成功的重要前提。精子指標(biāo)參數(shù)中的曲線運(yùn)動(dòng)速率、直線運(yùn)動(dòng)速率、平均路徑速率可反映精子自主運(yùn)動(dòng)速度。前向性、直線性、擺動(dòng)性、側(cè)擺幅度和鞭打頻率等指標(biāo)則反映精子運(yùn)動(dòng)頻率。本研究結(jié)果顯示，短時(shí)二次取精的精子運(yùn)動(dòng)速度、前向性占比和鞭打頻率均顯著提高，精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)較一次取精改善。有文獻(xiàn)報(bào)道，微量元素是影響人類生殖健康的重要因素。其中，鋅是一種必需的微量元素，不僅能抑制DNA酶活性以維持精子活力，還參與了二硫鍵的形成，是男性生殖系統(tǒng)正常功能和精子發(fā)生過(guò)程所必需的。Osadchuk等也報(bào)道了延長(zhǎng)禁欲會(huì)導(dǎo)致前列腺分泌鋅水平減少，鋅缺乏可能是精液質(zhì)量下降的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)因素。楊雪梅等從精子核組成結(jié)構(gòu)方面給出另一個(gè)解釋，認(rèn)為人類成熟精子核由組蛋白和魚精蛋白結(jié)合形成。魚精蛋白是一種小分子堿性蛋白，可通過(guò)中和DNA的負(fù)電荷并與二硫鍵交聯(lián)形成魚精蛋白-DNA復(fù)合體。魚精蛋白-DNA復(fù)合體結(jié)構(gòu)使精子核極度壓縮致密，起到保護(hù)精子抵御外界氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。但隨禁欲時(shí)間的延長(zhǎng)，精子核老化程度增加，精子核氧化磷酸化運(yùn)轉(zhuǎn)速度變快，磷酸酶活性升高。吳文靜等研究表明，磷酸酶被催化或活性升高會(huì)抑制小鼠附睪內(nèi)精子獲能，導(dǎo)致精子不運(yùn)動(dòng)或運(yùn)動(dòng)度降低。也有研究顯示，禁欲時(shí)間會(huì)影響精子蛋白的表達(dá)，尤其影響人精子過(guò)氧化還原蛋白2(peroxiredoxin 2,Prdx2)表達(dá)。Prdx2主要定位于精子中段線粒體區(qū)域以及精子頭部核區(qū)域，它參與精子線粒體的形成，且有清除細(xì)胞內(nèi)高濃度活性氧的能力，可防止過(guò)多的活性氧進(jìn)入精子核區(qū)域造成精子損傷，影響精子的運(yùn)動(dòng)能力。線粒體作為精子的動(dòng)力裝置，Prdx2低表達(dá)會(huì)使合成的線粒體數(shù)量減少，加劇了精子質(zhì)量的下降，這可能是延長(zhǎng)禁欲導(dǎo)致精子活力水平下降的一個(gè)主要因素。

綜上所述，短時(shí)二次取精可以顯著改善精液質(zhì)量和精子動(dòng)態(tài)指標(biāo)，同時(shí)具有無(wú)創(chuàng)簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，因此在臨床上具有一定應(yīng)用價(jià)值。