淋巴管肌瘤病生物標(biāo)志物研究新進(jìn)展

楊晟楠， 魏風(fēng)芹， 劉培培， 代華平

淋巴管肌瘤病(lymphangioleiomyomatosis,LAM)是一種罕見的緩慢進(jìn)展性腫瘤性疾病，其特征是囊性肺破壞、乳糜胸/腹、腎血管肌脂瘤(angiomyolipoma,AML)等肺外表現(xiàn)和淋巴管肌瘤。該病好發(fā)于育齡期女性，發(fā)病率為0.34/10萬～0.78/10萬，女性確診時(shí)的平均年齡為(41.00±0.65)歲。LAM早期癥狀輕微，肺部進(jìn)行性囊性破壞可導(dǎo)致勞累性呼吸困難和復(fù)發(fā)性氣胸。該病進(jìn)展緩慢，確診患者的中位生存期超過20年，晚期的LAM患者常因嚴(yán)重的低氧血癥而死亡。臨床上存在兩種形式的LAM：散發(fā)型LAM(sporadic lymphangioleiomyomatosis,S-LAM)和結(jié)節(jié)性硬化癥相關(guān)的LAM(tuberous sclerosis complex-associated lymphangioleiomyomatosis,TSC-LAM)。結(jié)節(jié)性硬化癥(tuberous sclerosis complex,TSC)是常染色體顯性遺傳多系統(tǒng)腫瘤性疾病，在成年女性TSC患者中可以檢測到LAM的高患病率。LAM的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，目前認(rèn)為可能與TSC基因突變導(dǎo)致的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路過度激活有關(guān)。當(dāng)前指南推薦的治療藥物包括西羅莫司和依維莫司，盡管這兩種藥物在治療期間能夠穩(wěn)定患者的肺功能并改善整體生活質(zhì)量，但停止治療后疾病仍會(huì)持續(xù)進(jìn)展，肺移植仍是終末期LAM患者的最佳選擇。目前血管內(nèi)皮生長因子-D(vascular endothelial growth factor-D,VEGF-D)是指南推薦的唯一可用于診斷的生物標(biāo)志物，未來關(guān)于預(yù)測疾病進(jìn)展和評價(jià)治療效果的生物標(biāo)志物的鑒定，對進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)LAM的早診斷、早評估、早干預(yù)具有重要意義。根據(jù)生物標(biāo)志物的功能，在臨床應(yīng)用中可分為：(1)疾病易感性標(biāo)志物；(2)診斷性標(biāo)志物；(3)預(yù)測性標(biāo)志物；(4)治療反應(yīng)性標(biāo)志物；(5)預(yù)后性標(biāo)志物。診斷性生物標(biāo)志物被定義為檢測疾病的存在或識(shí)別具有該疾病亞型的個(gè)體特征。LAM的診斷需結(jié)合臨床癥狀，肺部/腹部高分辨率計(jì)算機(jī)斷層掃描(high-resolution computed tomography,HRCT)和(或)肺活檢病理及免疫組化結(jié)果，目前指南推薦使用的僅為診斷性生物標(biāo)志物VEGF-D。疾病易感性生物標(biāo)志物的鑒定有利于篩查高風(fēng)險(xiǎn)人群，預(yù)測性標(biāo)志物可以判斷疾病活動(dòng)程度。隨著越來越多的藥物用于LAM治療，因此有必要利用一些反應(yīng)參數(shù)來進(jìn)行監(jiān)測評估。預(yù)后性生物標(biāo)志物被定義為獨(dú)立于治療的，可提供患者整體結(jié)局和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的信息特征。生物標(biāo)志物具有巨大價(jià)值，因此亟需尋求非侵入性、便捷安全、重復(fù)性好且敏感性/特異性高的LAM生物標(biāo)志物。本文按照生物標(biāo)志物的類型綜述了近年LAM生物標(biāo)志物方面的研究進(jìn)展。

1 蛋白質(zhì)類

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VEGF-D 血管內(nèi)皮生長因子是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成的作用。它是血管內(nèi)皮生長因子家族中的一員，主要在腫瘤組織的新生血管和新生淋巴管的形成過程中起作用。在Young等的一項(xiàng)前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，與其他類型的囊性肺疾病(包括Birt-Hogg-Dube和朗格漢斯組織細(xì)胞增生癥)患者相比，LAM患者的血清VEGF-D水平明顯升高。該研究還發(fā)現(xiàn)，對于HRCT提示具有肺囊性病變的患者，血清VEGF-D值>800 pg/ml時(shí)，LAM診斷的敏感度為73%，特異度為100%。美國胸科協(xié)會(huì)(American Thoracic Society，ATS)聯(lián)合日本呼吸學(xué)會(huì)(Japanese Respiratory Society，JRS)在2016年及2017年相繼發(fā)表了LAM診斷和管理臨床指南及補(bǔ)充性指南建議，若患者胸部HRCT有LAM特征性改變，且血清VEGF-D≥800 pg/ml，可以確診LAM，無需進(jìn)行肺活檢。雖然指南明確指出VEGF-D可以作為確診的依據(jù)，但該檢測指標(biāo)尚未在亞洲人群中進(jìn)行充分驗(yàn)證。為此，Hirose等進(jìn)行了一項(xiàng)臨床對照試驗(yàn)，檢測了108例LAM患者、14例疾病對照者和51名日本健康志愿者的血清VEGF-D水平。結(jié)果表明，基線血清VEGF-D水平可以有效將LAM患者與健康志愿者區(qū)別開，在700 pg/ml和800 pg/ml時(shí)，VEGF-D的診斷敏感度和特異度分別為80%和97%以及72%和100%。該研究令人滿意的診斷效力支持了ATS/JRS的LAM指南在亞洲人群中的應(yīng)用。血清VEGF-D除了作為LAM的診斷性生物標(biāo)志物，還可以用來評價(jià)治療效果以及預(yù)測疾病進(jìn)展。在一項(xiàng)具有里程碑意義的研究中，與安慰劑組相比，接受mTOR通路抑制劑西羅莫司治療12個(gè)月后血清VEGF-D水平明顯降低[(1848±1514)pg/ml vs (862±540)pg/ml]。Taveira-DaSilva等的研究結(jié)果也支持同樣的觀點(diǎn)。在預(yù)測疾病進(jìn)展方面，Gupta等研究顯示血清VEGF-D水平>600 pg/ml的LAM患者，其疾病進(jìn)展速度更快，但同時(shí)也有著更好的治療反應(yīng)性。此外，血清VEGF-D水平還可以作為LAM患者肺功能下降的獨(dú)立預(yù)測因素。盡管如此，VEGF-D在LAM患者中的上調(diào)機(jī)制尚不清楚，仍有待進(jìn)一步研究來闡明。

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維生素D結(jié)合蛋白(vitamin D binding protein,VDBP) VDBP是由肝臟、腎臟、脂肪組織和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖基化α球蛋白，由第四號(hào)染色體上的GC基因編碼，分為AA、AC和CC三種基因類型。其具有多種生物學(xué)功能：結(jié)合和運(yùn)輸維生素D及其代謝物，參與肌動(dòng)蛋白清除，可增強(qiáng)促炎反應(yīng)并清除組織損傷產(chǎn)物，并具有免疫調(diào)節(jié)特性。研究者利用質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，VDBP是LAM患者中下調(diào)最顯著的血清蛋白(logFC=2.6)。與LAM穩(wěn)定期相比，疾病進(jìn)展期血清VDBP水平進(jìn)一步降低，并且與一氧化碳彌散量(diffusing capacity of lung for carbon monoxide,DLCO)下降顯著相關(guān)?；蚍中脱芯勘砻?，與AA和AC基因型相比，CC基因型的LAM患者死亡時(shí)間/移植時(shí)間出現(xiàn)更早(150個(gè)月 vs 104個(gè)月)，并且CC基因型的VDBP水平更低。這表明VDBP與疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)，CC基因型可以幫助預(yù)測LAM的無移植生存期。

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血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme,ACE) 經(jīng)典的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system,RAS)與體循環(huán)動(dòng)脈壓調(diào)節(jié)相關(guān)，RAS也存在于不同類型的腫瘤中，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和轉(zhuǎn)移。一項(xiàng)納入了426例LAM患者的回顧性研究表明，33.2%的患者血清ACE水平高于正常值，并且血清ACE水平與患者的肺功能呈負(fù)相關(guān)。接受血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)治療的患者，全部肺功能指標(biāo)(除一秒率外)的下降速度明顯低于未接受治療的患者。其原因可能是血管緊張素Ⅱ可以通過血管緊張素Ⅱ1型受體(AngⅡ type 1 receptor,AT1R)誘導(dǎo)VEGF-D的合成，ACEI通過影響VEGF-D的合成，進(jìn)而影響血管和淋巴管的生成，從而抑制LAM細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，起到改善肺功能的作用。由此可見，血清ACE水平有可能成為LAM診斷、預(yù)測病情進(jìn)展以及評價(jià)治療效果的新型生物標(biāo)志物。

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癌胚抗原125(carcinoembryonic antigen-125,CA-125) CA-125是一種在多個(gè)器官內(nèi)膜上皮細(xì)胞表達(dá)的跨膜糖蛋白，尤其在卵巢癌中高表達(dá)。既往研究提示CA-125可能是心包、腹膜或胸膜受刺激的生物標(biāo)志物。在一項(xiàng)對241例LAM患者的研究中，約有25%的患者至少有一次血清CA-125升高，并且免疫組化顯示CA-125在LAM結(jié)節(jié)中表達(dá)，較高的CA-125水平與胸腔積液和肺功能下降有關(guān)，血清CA-125水平升高可能提示LAM患者漿膜受累。因此，CA-125有可能成為預(yù)測LAM患者疾病活動(dòng)程度的潛在生物標(biāo)志物。

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血管內(nèi)皮生長因子受體和趨化因子 對于臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)而言，重要的是要確定與LAM相關(guān)的早期的生物標(biāo)志物。一項(xiàng)回顧性研究表明，使用西羅莫司聯(lián)合羥氯喹治療LAM患者的過程中，分析最早的治療時(shí)間點(diǎn)顯示，趨化因子CCL18變化最為顯著，較基線值下降了48.6%，使其有可能成為評價(jià)治療效果的早期生物標(biāo)志物。該研究還顯示，在整個(gè)治療過程中，血管內(nèi)皮生長因子受體3(vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR3)和趨化因子CCL21與肺功能下降的相關(guān)性最為顯著。VEGFR3在LAM細(xì)胞表面表達(dá)，與淋巴管內(nèi)皮的生物學(xué)活性有關(guān)，可以用來預(yù)測肺功能的下降趨勢。CCL21是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的趨化因子，主要在免疫耐受中起重要作用，在LAM發(fā)病機(jī)理中的作用還需進(jìn)一步研究。

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涎液化糖鏈抗原(Krebs von den Lungen-6,KL-6)KL-6是一種高分子量黏液糖蛋白，主要由受損或再生的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)，對肺成纖維細(xì)胞具有促纖維化和抗凋亡作用。多項(xiàng)研究表明，在多種間質(zhì)性肺疾病中血清KL-6濃度升高，因此推斷KL-6可以作為這些間質(zhì)性肺病的診斷性生物標(biāo)志物。在最近的研究中，比較了LAM患者與健康對照者的血清KL-6濃度，結(jié)果顯示LAM患者的血清KL-6濃度明顯高于對照組(

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=0.013)。ROC曲線法分析顯示，LAM患者血清KL-6的AUC值為81%(95%

CI

：61%～100%)，LAM患者血清KL-6的最佳臨界值為250.0 U/ml(敏感度為70%，特異度為87.5%)。這表明KL-6有可能成為LAM的診斷性生物標(biāo)志物。

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內(nèi)皮抑素 盡管前面的研究已經(jīng)描述了一些關(guān)于LAM的生物標(biāo)志物，但是尚沒有一種標(biāo)志物可以用來區(qū)分TSC-LAM和S-LAM。Lamattina等研究表明，與S-LAM相比，TSC-LAM患者的血清內(nèi)皮抑素水平顯著升高，并且內(nèi)皮抑素水平與DLCO下降呈相關(guān)性。最近研究人員首次利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法鑒定和表征人肺組織中的LAM細(xì)胞，篩選出新的潛在血清生物標(biāo)志物，包括膠原蛋白XVIIIα1(Col18α1)和人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4(insulin-like growth factor-binding protein 4,IGFBP-4)，它們在TSC-LAM患者的血清中升高。內(nèi)皮抑素是Col18α1的裂解產(chǎn)物，是一種體內(nèi)外血管生成的有效抑制劑，可能使血管生成偏向淋巴譜系。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的確切原因尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證內(nèi)皮抑素在LAM發(fā)病機(jī)制中的作用。

2 脂質(zhì)

大多數(shù)血漿代謝物的測定具有變異率低、可重復(fù)性高以及在個(gè)體中可穩(wěn)定重現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)，所以代謝或代謝組學(xué)產(chǎn)生的小分子代謝產(chǎn)物的高通量鑒定和定量化越來越多地用于評估代謝變化及其與人類疾病的關(guān)系。Priolo等對14例LAM患者和9名健康女性對照者進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果顯示LAM患者血漿中131種復(fù)雜脂質(zhì)物質(zhì)中有18種具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中有15種脂類水平升高，包括4種溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine,LPC)。LPC是磷酸膽堿(phosphatidylcholine,PC)通過磷脂酶A(phospholipase A,PLA)活化產(chǎn)生的生物活性脂質(zhì)，通過分析TSC/LAM的體外臨床前模型，發(fā)現(xiàn)LPC在TSC2缺陷型細(xì)胞中大量聚集。Li等通過激光捕獲顯微切割術(shù)收集LAM結(jié)節(jié)細(xì)胞和非LAM細(xì)胞(包括肺癌/腫瘤)，比較兩者中磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)家族成員的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示與非LAM肺相比，LAM結(jié)節(jié)細(xì)胞中的兩個(gè)PLA2轉(zhuǎn)錄本PLA2G16和PLA2G4C增長了兩倍(

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<0.05)。另有研究表明血漿脂質(zhì)水平不受年齡、體重指數(shù)和相對脂肪量的影響，且在1～2年的隨訪中保持相對穩(wěn)定。因此，血漿LPC和PLA2具有成為LAM診斷性生物標(biāo)志物的潛力。最新的研究發(fā)現(xiàn)LAM患者脂質(zhì)代謝發(fā)生明顯改變，其血漿中的鞘脂、脂肪酸和磷脂代謝產(chǎn)物與第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second,FEV)的下降速率相關(guān)。疾病負(fù)擔(dān)評分較高者的脂肪酸、磷脂和溶血磷脂均異常。這提示脂類物質(zhì)有可能成為評價(jià)疾病嚴(yán)重程度的標(biāo)志物。目前關(guān)于LAM血漿脂質(zhì)組的研究還不多，有待進(jìn)一步研究來確定脂質(zhì)作為LAM生物標(biāo)志物的潛力。

3 核酸類

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無細(xì)胞循環(huán)DNA(cell-free DNA，cfDNA) 高通量測序技術(shù)測序(next generation sequencing,NGS)，也稱為二代測序，以其快速、信息全面等優(yōu)勢得以廣泛應(yīng)用。cfDNA的NGS已成為最近用于鑒定腫瘤細(xì)胞的有前景的技術(shù)。最近的一項(xiàng)研究從23例LAM患者和7名健康對照者中獲取血液樣本分析了cfDNA和基因組DNA(gDNA)。結(jié)果顯示，cfDNA突變等位基因頻率與gDNA顯著不同，在LAM患者可觀察到cfDNA不同的體細(xì)胞突變譜，其中RAD50和BRCA2與受試者表型具有最強(qiáng)的相關(guān)性。該研究發(fā)現(xiàn)了潛在的LAM驅(qū)動(dòng)基因，即RAD50和BRCA2，為關(guān)鍵分子標(biāo)志物的臨床應(yīng)用提供了重要信息，可用于未來的精準(zhǔn)診斷和治療。

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微小RNA(micro RNA,miRNA) miRNA是一種小的非編碼調(diào)節(jié)分子，通過與靶mRNA特異性結(jié)合，降解mRNA或者干擾其翻譯過程來調(diào)節(jié)許多重要的生物過程。miRNA作為腫瘤和其他疾病的候選生物標(biāo)志物已被廣泛研究。Trindade等從TSC2缺陷患者的AML細(xì)胞中篩選了946個(gè)miRNA進(jìn)行分析，確定了18個(gè)上調(diào)的miRNA和8個(gè)下調(diào)的miRNA，其中包括miR-21。隨后的小鼠模型證實(shí)，miR-21在TSC2缺陷細(xì)胞中顯著升高，通過抑制miR-21的調(diào)控作用可以限制體內(nèi)TSC2缺陷型腫瘤的生長。因此，循環(huán)miRNA是診斷LAM的非常有前景的候選生物標(biāo)志物。Trelinska等對10例TSC患者以及10名性別和年齡匹配的健康人進(jìn)行了血清miRNA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSC是一種血清miRNA水平顯著改變的疾病，依維莫司治療3個(gè)月降低了TSC依賴的miR-142和miR-136水平。這種與TSC相關(guān)的miR-142和miR-136血清miRNA譜變化的可逆模式表明，血清miRNA水平也可以用作評價(jià)治療效果的生物標(biāo)志物。

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腫瘤DNA 單細(xì)胞測序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)技術(shù)可以對單個(gè)細(xì)胞中存在的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行非靶向定量，從而識(shí)別新的細(xì)胞類型并定義為稀有細(xì)胞群體，引起研究者極大的興趣。最近完成的一項(xiàng)研究中，Guo等對LAM患者的肺組織和子宮組織進(jìn)行scRNA-seq，鑒定出獨(dú)特的間充質(zhì)細(xì)胞群，命名為LAM細(xì)胞。這些細(xì)胞不僅表達(dá)已知LAM標(biāo)記的特征基因，包括PMEL、FIGF、CTSK和MLANA，還表達(dá)許多更具選擇性的標(biāo)記基因，如HOXD11、HOXA11、VGLL2、SLC35F1。該研究團(tuán)隊(duì)還鑒定出LAM特征基因編碼的分泌組蛋白，其中11種僅在LAM患者肺中發(fā)現(xiàn)。功能富集分析表明，其中9個(gè)與女性生殖道腫瘤發(fā)生有關(guān)(PMEL、IGSF21、C10orf90、NELL2、GOLM1、CPA6、PRLR、MMP11、CHI3LI)，6個(gè)與子宮癌相關(guān)(C10orf90、NELL2、GOLM1、CPA6、PRLR、MMP11)。該研究鑒定出的新的標(biāo)記基因及其轉(zhuǎn)錄的生物標(biāo)志物可能用于高風(fēng)險(xiǎn)人群的篩選。

4 小結(jié)

盡管對LAM的診斷和治療方面已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，但還缺乏更深入探索，VEGF-D作為指南推薦的生物標(biāo)志物在診斷和評價(jià)方面仍存在一定局限性，而最近的一些研究發(fā)現(xiàn)VDBP、CCL8、CA-125等可能在LAM的診斷、評價(jià)預(yù)后和治療方面發(fā)揮作用，成為潛在的生物標(biāo)志物，未來需要更多的研究來證實(shí)它們的效用(見表1)。與單個(gè)生物標(biāo)志物相比，組合不同的生物標(biāo)志物可能對疾病作出更全面的評價(jià)，提高診斷和預(yù)后的準(zhǔn)確性，并有助于臨床干預(yù)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)。未來還需要研究更多關(guān)于疾病進(jìn)展或評價(jià)治療效果的生物標(biāo)志物，以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)針對LAM患者個(gè)性化的治療。

表1 潛在的LAM生物標(biāo)志物類型及其證據(jù)強(qiáng)度

名 稱易感性標(biāo)志物診斷性標(biāo)志物預(yù)測性標(biāo)志物治療反應(yīng)性標(biāo)志物預(yù)后性標(biāo)志物VEGF-D++/-+/-VDBP+/-+/-KL-6+/-CA-125+/-ACE+/-+/-+/-內(nèi)皮抑素+/-VEGFR3和CCL21+/-+/-脂質(zhì)+/-+/-miRNA+/-+/-RAD50和BRCA2(基因)+/-scRNA-seq標(biāo)記基因+/-

注：+：支持某物質(zhì)成為潛在標(biāo)志物的證據(jù)較一致或有力；+/-：支持某物質(zhì)成為潛在標(biāo)志物的證據(jù)有爭議或不夠充分；空白：目前無相關(guān)證據(jù)