Klotho在缺血性腦卒中患者血清中的表達及臨床意義

畢芳芳 史敏 蘇明權(quán) 程微微 張露

世界范圍內(nèi)，每年有近1 500 萬人罹患卒中，近600 萬人死于該病，近50 萬人遺留終身殘疾，其已成為繼癡呆后致殘的第二位因素［1］。缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS），也稱腦栓塞，指由于腦的供血動脈狹窄或閉塞、供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中大約占臨床上卒中疾病總數(shù)的60%～80%，可反復(fù)發(fā)作，有一定的致殘率和致死率，而幸存者往往遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙，其突發(fā)性、嚴重性和不可預(yù)測性給患者和家屬帶來了嚴重的生理和心理負擔(dān)［2］。因此相關(guān)機制和治療策略的研究一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的焦點。本研究前期研究顯示：氧化應(yīng)激與炎癥過度反應(yīng)可能是CIS 疾病進展中的重要因素之一［3］。近年有研究發(fā)現(xiàn)Klotho 水平的下降與炎癥反應(yīng)，細胞死亡有關(guān)［4］。另有動物實驗證明，血清中Klotho水平的下降［5］。上述研究共同表明：Klotho在血清中起著至關(guān)重要的作用。但Klotho在CIS 患者中的具體表達及其與CIS 患者疾病活動度的關(guān)系，目前尚未見報道。本研究分析其與CIS 患者疾病活動度的相關(guān)性，為CIS 的診療及CIS 機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 CIS 患者標(biāo)本的收集

選取2020年4月至2022年4月西安市西京醫(yī)院收治的52 例CIS 患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡60～85 歲；②確診為缺血性腦卒中；③自愿受試。排除標(biāo)準(zhǔn)：①出血性腦卒中；②精神?。虎垡缽男圆?。所有患者及其家屬均對本研究充分知情，并已經(jīng)簽署知情同意書，本研究經(jīng)西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

RNA 提取試劑盒（DP400，天根，西安）；GAPDH抗體（Santa Cruz Biotechnology，美國），Klotho 抗體（Sigma-Aldrich，美國）。Viia 7 實時定量PCR 儀（ABI Viia 7，美國）。Klotho 及內(nèi)參引物均由上海生工生物公司合成；Klotho上游引物：5′-TAGCC AGCGA CAGCT ACAAC-3′，下游引物：5′-GAAGC GGTAG TGAGT GACCC-3′，GAPDH 上游引物：5′-CTCTG CTCCT CCTGT TCGAC-3′，GAPDH下游引物：5′-TAGCC TCCCG GGTTT CTCTC-3′。

1.3 RT-qPCR

根據(jù)說明書提取總的RNA，并檢測其濃度和純度，RNA 純度A260/280 在1.8～2.1 之間認為合格。逆轉(zhuǎn)錄條件：5℃10 min，50℃30 min，85℃5 min。qPCR 反應(yīng)：預(yù)變性95℃，5 min；循環(huán)反應(yīng)95℃，5 s，58℃，30 s，72℃，30 s，循環(huán)次數(shù)，35；徹底延伸：72℃10 min。每個樣本3 個復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法計算Klotho 的相對表達量。

1.4 Western Blotting

提取組織總蛋白，按照BCA 蛋白測定試劑盒說明書進行濃度檢測，分裝后保存于-80℃冰箱備用。按照所測蛋白濃度，計算含40 μg 蛋白的體積即為上樣量，99℃加熱5 min 后冷卻上樣；60 V 等壓電泳50 min 后轉(zhuǎn)為110 V 繼續(xù)電泳1.5 h 至溴酚蘭到達分離膠的底部；電泳結(jié)束后，取出凝膠，放置在1×Transfer buffer 中平衡15 min。按照白板-濾紙-PVDF 膜（使用前在甲醇中活化5 min）-凝膠-濾紙-黑板的順序置于夾子中，加入預(yù)冷的1×Transfer buffer，100 V、90 min；轉(zhuǎn)完膜后，將PVDF膜取出，放在5%脫脂牛奶中封閉2 h，用1×TBST洗滌一次；將目的條帶，放在相應(yīng)的一抗抗體（使用前按照說明書推薦比例用1×TBST 稀釋）中4℃搖床孵育過夜。第二天，目的條帶在1×TBST 中洗3 次，每次10 min，再放入相應(yīng)的二抗抗體中（使用前按照說明書推薦比例用5%脫脂牛奶稀釋），常溫搖床孵育1 h，再在1×TBST 中洗3 次，每次10 min；最后化學(xué)發(fā)光、顯影。結(jié)果分析：FluorchemTM8900圖像分析軟件定量分析靶蛋白及內(nèi)參GAPDH條帶的含量，求其比值進行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析；計量資料用（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；用非參數(shù)相關(guān)的Spearman 軼相關(guān)系數(shù)（r）分析評估兩個變量之間的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Klotho 的mRNA 表達結(jié)果

Klotho的mRNA 水平在CIS 患者血清標(biāo)本中的相對表達量為（1.83±0.23），低于正常對照組（3.34±0.56），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.986，P＜0.05）。見圖1。

圖1 Klotho mRNA 在CIS 患者及正常對照組表達Figure 1 mRNA Expression of Klotho in CIS patients and the normal controls

2.2 Klotho 的蛋白表達結(jié)果

Klotho的蛋白水平在CIS患者血清標(biāo)本中的表達量為（141.78±69.04），低于正常對照組（375.82±83.71），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.554，P＜0.05）。見圖2。

圖2 Klotho 蛋白在CIS 患者及正常對照組表達Figure 2 Protein Expression of Klotho in CIS patients and the normal controls

2.3 Klotho 的表達與CIS 患者疾病活動度的相關(guān)性分析

CIS 患者血清樣本中Klotho的表達與其疾病活動度評估指標(biāo)NIHSS 評分及Barthel 指數(shù)（BI）評分具有一定的相關(guān)性。見圖3。

圖3 Klotho 的表達與CIS 患者疾病活動度的相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis between the expression of Klotho and disease activity in patients with CIS

3 討論

CIS 也稱腦栓塞，是腦動脈狹窄或阻塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的腦缺血類型的總稱，為臨床常見的腦血管疾病之一［1］。腦缺血性損傷的機制涉及許多病理生理過程，越來越多的研究認為，其發(fā)病原因與炎癥、氧化應(yīng)激、細胞凋亡、細胞焦亡等均有一定的相關(guān)性［6］。其中，炎癥級聯(lián)反應(yīng)所導(dǎo)致的細胞凋亡和焦亡是CIS 發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。因此，抑制機體內(nèi)源性炎癥級聯(lián)反應(yīng)是CIS 治療的關(guān)鍵所在。流行病學(xué)研究顯示：CIS 在中國仍呈逐年增高的趨勢［7-8］，己成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點和難點之一。因此，進一步闡明CIS 發(fā)病相關(guān)機制和治療策略，是一項十分重要且扼待解決的任務(wù)，具有重要的臨床價值及意義。

在生命發(fā)育與健康維持過程中，Klotho基因通過調(diào)控離子通道、Wnt等多個信號通路和靶基因的表達發(fā)揮抗衰老、腎臟保護、心血管保護、抗腫瘤和調(diào)節(jié)代謝等作用［9-10］。Klotho基因是Kuro-o 等科學(xué)者在1997年研究自發(fā)性高血壓時偶然發(fā)現(xiàn)的［13］，后來研究發(fā)現(xiàn)Klotho基因缺失鼠（Kl-/-）的表型類似人類的衰老表現(xiàn)，包括壽命縮短、動脈硬化、皮膚肌肉萎縮、認知障礙、運動神經(jīng)元受損、軟組織鈣化、聽力下降、骨質(zhì)疏松等。然而，當(dāng)Klotho蛋白過表達時，實驗動物的壽命可得以延長，表明了它是一個衰老抑制基因；當(dāng)Klotho蛋白表達異常時，會出現(xiàn)一系列與衰老及與衰老密切相關(guān)的疾病，提示Klotho基因在衰老和衰老相關(guān)疾病的發(fā)生中起著重要作用。Klotho基因首先從表現(xiàn)為衰老的模型小鼠中克隆成功［11］。隨后發(fā)現(xiàn)人和大鼠中也存在Klotho基因，且它們之間具有較高的同源性（83%）。Klotho基因全長50 kb，包含5 個外顯子和4 個內(nèi)含子，在人和小鼠中均定位于第13 號染色體（13q12）。在其基因結(jié)構(gòu)中，其RNA 可通過選擇性拼接產(chǎn)生兩種蛋白產(chǎn)物，一種為包括5 個外顯子和4 個內(nèi)含子，編碼形成的膜型Klotho蛋白；一種為僅含3 個外顯子和2 個內(nèi)含子而編碼形成的分泌型Klotho蛋白，分泌型的還有一種是直接從膜型Klotho蛋白的胞外域脫離下來的。人的分泌型Klotho蛋白全長有549 個氨基酸殘基（小鼠為550個），該類型缺乏跨膜結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，在人的大腦、海馬、胎盤、腎臟、前列腺和小腸等組織中均檢測到其存在，在血清中也檢測到Klotho蛋白的存在［12］。分泌型Klotho可通過中斷細胞內(nèi)控制氧化應(yīng)激、纖維增生、炎癥、細胞衰老等局部或全身性病理過程的關(guān)鍵細胞信號分子起到保護作用。研究表明，Klotho可靶向腎小管細胞中的線粒體功能障礙和細胞衰老來延緩腎纖維，且進一步研究發(fā)現(xiàn)Klotho是通過抑制胰島素下游IRS-1/PI3K/AKT 信號通路從而緩解腎臟的纖維化［13］；此外，也有研究報道Klotho是通過抑制細胞壞死和氧化應(yīng)激從而減輕血管緊張素II 引起的心臟毒性；對于中風(fēng)的研究，有研究報道Klotho在血清中的濃度可預(yù)測急性缺血性中風(fēng)患者三個月后的功能結(jié)局［14］，進一步有研究發(fā)現(xiàn)Klotho協(xié)助FGF21受體FGFR1通過激活PI3K/Akt信號通路來促進對于新生鼠缺氧缺血性腦損傷后的功能恢復(fù)［15］；四川大學(xué)華西藥學(xué)院研究團隊發(fā)現(xiàn)Klotho 增加了腦內(nèi)錳超氧化物歧化酶（Mn-containing superoxide dismutase，Mn-SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）的表達，減少了腦內(nèi)丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，同時Klotho 過表達抑制了Akt 和FoxO1 的磷酸化［15］，研究提示Klotho 可能通過Akt/FoxO1 信號通路在CIS 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，但具體的作用機制仍然需要進一步探究。以上結(jié)果均強烈提示，Klotho很可能在CIS 的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。

本研究提示Klotho 可能在CIS 的發(fā)病中扮演著十分重要的角色，為CIS 發(fā)病機制的相關(guān)研究提供了新的方向和靶點。但Klotho 在CIS 發(fā)病中的具體的作用機制仍然需要進一步的研究。