EB-DNA檢測在重離子治療鼻咽癌中的臨床應(yīng)用價值

王興昌 陳東基 周俊年 李霞 楊婷

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種具有明顯低于分布差異的惡性腫瘤，2018年估計月129 079 例NPC 新病例和72 987 例相關(guān)死亡病例中，大多數(shù)在東南亞地區(qū)，并且可能每年呈上升趨勢［1］。其中我國NPC 患者占世界NPC 患者的47%，其中我國南方城市NPC 發(fā)病率普遍高于北方城市［2］。由于NPC 的腫瘤位置較深、臨近的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、與顱底緊鄰，因此手術(shù)無法完全切除，而放射治療則成為了治療NPC 患者的主要有效手段。重離子放射治療也稱為碳離子放射治療，具有準(zhǔn)確投射腫瘤靶區(qū)、倒轉(zhuǎn)劑量分布深度、較少的氧效應(yīng)等特點，是治療NPC 的一種重要手段［3］。然而NPC 早期癥狀不典型、初次治療后存在復(fù)發(fā)風(fēng)險等問題，因此尋找一項NPC 早期診斷、療效及預(yù)后情況的指標(biāo)尤為重要。研究［4］表明，EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）為NPC 發(fā)病的危險因素。但EB 病毒與NPC 患者的臨床療效及預(yù)后的關(guān)系研究報道相對較少，同時目前缺乏大量的臨床數(shù)據(jù)及長期隨訪研究。因此本研究對早期鼻咽癌患者EB-DNA 進行檢測，分析其表達情況在重離子治療鼻咽癌中的臨床應(yīng)用價值。報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2021年8月至2022年5月期間甘肅省武威腫瘤醫(yī)院收治的42 例鼻咽癌患者資料進行分析并作為病例組，選取同期門診體檢30 名健康志愿者作為對照組。病例組：男25 例，女17 例，平均年齡（47.83±7.64）歲，臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)《ESMO2012 版臨床實踐指南：鼻咽癌，轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌，支氣管和兇險神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，胃腸道間質(zhì)瘤》［5］中關(guān)于NPC 診斷標(biāo)準(zhǔn)，及經(jīng)病理活檢診斷為NPC；②臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期；③治療期間均接受重離子放射治療；④治療期間均接受重離子放射治療；⑤病人及其家屬均對本課題知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在其他部位的惡性腫瘤；②合并嚴重的心、肺、腎等重要器官功能障礙；③依從性差，無法配合治療者；④臨床資料不完整患者。對照組：為同期門診體檢志愿者。男16 例，女14 例，平均年齡（43.76±8.21）歲。兩組性別比例、年齡等具有可比性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 治療方法

患者采用CT 平掃加增強掃描定位，取仰臥位于定位床上，雙手置于身側(cè)，采用頭頸肩膜進行體位固定。CT 掃描自頭頂至胸鎖關(guān)節(jié)下方掃描，層厚1.5 mm，并與治療體位下的頭頸部增強CT 及MRI 圖像相融合，必要時與PET/CT 進行圖像融合。由具有豐富經(jīng)驗的臨床醫(yī)師在定位CT 上勾畫GTV、CTV，根據(jù)我院實測擺位誤差進行外擴3 mm 形成PTV。同時勾畫視神經(jīng)、大腦顳葉、視交叉、內(nèi)耳、顳頜關(guān)節(jié)、脊髓、腦干、腮腺等臨近危及器官。處方劑量和危及器官限量均采用國內(nèi)外發(fā)表的相關(guān)重離子文章及我院SOP 文件規(guī)定劑量。采用中國近代物理研究所自主開發(fā)的HIMM 重離子加速器及Ci-Plan 重離子治療計劃系統(tǒng)進行治療計劃制定計劃，經(jīng)醫(yī)師、物理師雙方審核通過后，采用HIMM 重離子加速器進行重離子治療。

1.3 血漿EB-DNA 檢測

采集對照組及病例組治療前、治療1 個月后的靜脈血3 mL，3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，取上層血漿，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)對EB-DNA 進行檢測，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。EB-DNA＞5×102copy·mL-1為檢測陽性。試劑盒產(chǎn)自美國eBioscience 公司。

1.4 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計對照組治療前的EB-DNA 檢測陽性率；以鼻咽部活檢診斷結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制EB-DNA 表達對NPC 的診斷ROC 曲線，統(tǒng)計診斷效能；以治療1 個月后臨床療效為近期療效，對患者進行EB-DNA 檢測，檢測陽性患者為陽性組，檢測陰性患者為陰性組，比較兩組的近期療效準(zhǔn)。

近期療效評價標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)文獻［6］中評價標(biāo)準(zhǔn)進行評價，其中分為完全緩解（complete remission，CR）、部分緩解（partial mitigation，PR）、病情穩(wěn)定（stable disease，SD）以及病情進展（progressive disease，PD）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析；計量資料符合正態(tài)分布采用（）表示，比較用t檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用M（P25，P75）表示，比較采用Mann-Whitney U 檢驗；計數(shù)資料用n（%）表示，比較用Kruskal Wallis 檢驗；ROC 曲線檢測EB-DNA 表達對NPC 的診斷效能；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組EB-DNA 拷貝量及陽性檢出率比較

病例組血漿EB-DNA 拷貝量顯著高于對照組，EB-DNA 陽性檢出率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組EB-DNA 拷貝量及陽性檢出率比較［M（P25，P75），n（%）］Table 1 Comparison of EB-DNA copy numbers and positive detection rates between the two groups［M（P25，P75），n（%）］

2.2 血漿EB-DNA 檢測對NPC 的診斷效能分析

繪制血漿EB-DNA 表達對NPC 診斷的ROC曲線，結(jié)果顯示，曲線下面積（area under the cure，AUC）為0.963［P＜0.001，95%CI（0.916～1.000）］。見圖1。其對應(yīng)的敏感度、特異度分別為0.929、0.933。

圖1 血漿EB-DNA 檢測對NPC 的診斷ROC 曲線圖Figure 1 ROC plot of plasma EB-DNA testing for the diagnosis of NPC

2.3 治療1 個月后患者EB-DNA 檢測結(jié)果與近期療效比較

Kruskal Wallis 檢驗結(jié)果顯示，治療一個月后EB-DNA 檢測陰性患者近期療效顯著優(yōu)于EB-DNA 檢測陽性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 治療1 個月后患者EB-DNA 檢測結(jié)果與近期療效比較［n（%）］Table 2 Comparison of EB-DNA test results between patients after 1 month of treatment and recent outcomes［n（%）］

3 討論

NPC 是一類高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，其臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，包括鼻出血、視力障礙甚至腦神經(jīng)損傷等［7］，其多發(fā)于鼻咽頂壁、咽引窩等位置，目前全球范圍內(nèi)的發(fā)病人數(shù)已大于8 萬，而病死人數(shù)接近5 萬［8］，具有明顯的地理分布特點，在東亞和東南亞尤為流行［9］。NPC 病人對放療、化療均具有較高的敏感性，若患者在疾病早期及早被發(fā)現(xiàn)且積極接受治療，治療后5年生存率可達到80%以上，但仍有部分患者進展至中后期或轉(zhuǎn)移，其預(yù)后及生存情況不甚理想。重離子放射治療即為碳素離子放射治療，該治療方案具有較高的癌細胞致死率，且可實現(xiàn)單+次照射劑量高、照射次數(shù)少的可能性，進一步增強了療效。然而，NPC 腫瘤位置復(fù)雜、放療照射范圍不足或存在放療不敏感細胞等原因可能造成治療后局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。因此，NPC 發(fā)病早期一定的隱匿性、治療后可能復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等情況下，尋找NPC 的診療有效檢測指標(biāo)尤為重要。體格檢查、計算機斷層掃面、MRI、纖維鼻咽鏡等檢測手段是常用的NPC 診斷技術(shù)，然而其費用昂貴，普適性較差。

1988年某學(xué)者在NPC 患者血漿中發(fā)現(xiàn)EB 病毒的DNA，并認為患者血漿EB-DNA 水平動態(tài)變化可作為NPV 的診斷輔助指標(biāo)［10］。同時，研究［11］發(fā)現(xiàn)，EB-DNA 的表達檢測可用于NPC 患者的預(yù)后評估中。EB 病毒是1964年被Epstein 與Barr 兩位學(xué)者發(fā)現(xiàn)的，屬于孢疹病毒科R 亞科，可感染靈長類動物的B 淋巴細胞。已有大量的研究表明，部分個體感染EB 病毒后，可轉(zhuǎn)化形成腫瘤，如NPC、淋巴癌等，EB 病毒是NPC 的一個誘發(fā)因子。已有研究表明，EB-DNA 在NPC 的診斷、療效評估、預(yù)后評估等方面存在重要的意義［12］。但目前尚未有充足的臨床數(shù)據(jù)以及長期隨訪數(shù)據(jù)的相關(guān)研究支持該結(jié)論，因此本課題對42 例NPC 患者EB-DNA 進行檢測，分析NPC 患者EB-DNA 對疾病的診斷、近遠期療效及其預(yù)后的評估效能，以EB-DNA 檢測在重離子治療NPC 中的臨床應(yīng)用價值。

為探討血漿EB-DNA 載量對早期NPC 的診斷效能，本研究選取了42 例早期（臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期）NPC 患者作為研究對象，與同期體檢的健康人群比較。結(jié)果顯示，病例組EB-DNA 陽性檢出率顯著高于對照組，與Hui 等［13］研究中NPC 患者EB-DNA 陽性檢出率96%、健康人群EB-DNA 陽性檢出率檢出率7%結(jié)果基本一致。進一步進行診斷效能分析，結(jié)果顯示，EB-DNA 表達對NPC 的診斷具有較高的效能。兩項結(jié)果提示，NPC 患者血漿EB-DNA 載量與健康人群存在顯著的差異，同時其對NPV 早期診斷篩查均有顯著的應(yīng)用價值。研究［14］表明，EB 病毒可在B 淋巴細胞內(nèi)進行增殖，并以環(huán)狀DNA 的形式在細胞質(zhì)中游離并整合，整合至染色體內(nèi)，NPC 細胞死亡后，染色體內(nèi)的EB 病毒片段則被釋放入血中，血漿EB-DNA 載量隨之上升。

本課題在研究對象治療1 個月后再進行EB-DNA 檢測，并對近期療效進行評估，結(jié)果顯示，EB-DNA 檢測陰性患者CR 的比例顯著高于EB-DNA 檢測陽性患者。結(jié)果表明EB-DNA 檢測陽性患者預(yù)后較差，與報道研究［15］結(jié)果一致，提示EB-DNA 檢測陽性對重離子治療NPC 的近、遠期療效具有一定的預(yù)測性?；颊哐獫{中EB-DNA 主要來源于NPC 腫瘤灶，血漿中EB-DNA 載量反應(yīng)了人體腫瘤的符合，因此EB-DNA 檢測陽性表明可能存在腫瘤遺留或存在復(fù)發(fā)的風(fēng)險。

綜上，EB-DNA 檢測可作為NPC 早期診斷與重離子放射治療療效和預(yù)后的參考指標(biāo)。然而本研究中選取病例有限，經(jīng)分析了EB-DNA 的表達情況與治療近遠期療效的關(guān)系，后續(xù)仍需收集更多的病例樣本，進一步分析患者血漿中EB-DNA載量在重離子治療NPC 的應(yīng)用。