陰道壁組織中TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達(dá)在盆底功能障礙患者中的臨床意義

汪新宇 程永玲 劉曉寧 管曉卿

盆底功能障礙（pelvic floor dysfunction，PFD）是由于各種病因?qū)е屡璧字С纸M織變得薄弱，使盆腔臟器發(fā)生移位，從而導(dǎo)致盆腔器官的位置和功能出現(xiàn)異常，主要包括子宮脫垂及陰道前后壁松弛等盆腔器官脫垂（Pelvic organ prolapse，POP）及壓力性尿失禁（Stress urinary incontinence，SUI），該疾病的發(fā)生與支撐盆腔器官的陰道和盆底組織機(jī)械功能減退有關(guān)。目前認(rèn)為，細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白的變化可導(dǎo)致盆底支持組織損傷，破壞盆底完整結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致PFD 的發(fā)生［1］。相關(guān)研究指出，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming Growth factor-β1，TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9，MMP-9）表達(dá)與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性相關(guān)［2］。亦有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 與膠原蛋白的生成和降解有關(guān)［3］。TGF-β1 是一組具有多種功能的蛋白多肽，是細(xì)胞外基質(zhì)的一類生物活性分子，在骨組織和血小板中含量最為豐富，可調(diào)節(jié)膠原代謝，促進(jìn)膠原、纖維蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)膜的分解，進(jìn)而影響PFD 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程；而MMP-9 可直接影響局部組織中多種類型膠原蛋白的生成、結(jié)構(gòu)和功能，可降解細(xì)胞外基質(zhì)膜的有效成分、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏度而抑制PFD 患者的盆地組織正常功能。核因子E-2 相關(guān)因子2（nuclear factor E-2 related factor，NrF 2）是一類細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白，目前對(duì)于其與PFD 發(fā)生的關(guān)系尚無(wú)定論。故本研究通過(guò)分析PFD 患者陰道壁組織中TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達(dá)，旨在探究其與PFD的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年3月至2021年7月于涿州市醫(yī)院就診的92 例PFD 患者為研究對(duì)象，根據(jù)疾病類型將其分為POP 組（35 例）、SUI 組（31 例）及POP 合并SUI 組（26 例），并以47 例健康婦科檢查者為對(duì)照組。POP 組：平均年齡（39.87±4.05）歲，平均孕次（2.25±0.34），平均產(chǎn)次（1.71±0.30）次，絕經(jīng)7 例。SUI 組：平均年齡（38.64±4.21）歲，平均孕次（2.15±0.37）次，平均產(chǎn)次（1.72±0.25）次，絕經(jīng)9 例。POP 合并SUI 組：平均年齡（39.09±4.17）歲，平均孕次（2.19±0.31）次，平均產(chǎn)次（1.75±0.28）次，絕經(jīng)5例。對(duì)照組：平均年齡（40.05±4.73）歲，平均孕次（2.21±0.35）次，平均產(chǎn)次（1.79±0.25）次，絕經(jīng)10 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合有關(guān)PFD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；②存在尿失禁、慢性盆腔疼痛者；③臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心肝腎功能異常者；②既往有盆腔手術(shù)史者；③合并嚴(yán)重婦科疾病患者；④合并惡性腫瘤疾病患者；⑤妊娠期婦女；⑥盆腔神經(jīng)損傷者。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，研究對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

①標(biāo)本采集：于患者盆底手術(shù)中在膀胱頸與尿道連接處旁開(kāi)1.5 cm 處，留取陰道前壁組織約1 cm3，用生理鹽水充分洗凈后，放入高壓滅菌的Eppendorf 管后立即置入液氮中保存。②總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄：應(yīng)用大連寶生物工程有限公司RNAiso Reagent 試劑盒進(jìn)行總RNA 提取，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。③PCR 反應(yīng)：TGF-β 1、MMP-9、Nrf 2基因的PCR 引物采用Primer5.0 引物軟件設(shè)計(jì)［TGF-β1引物序列：上游：5′-ACCCACAAGGAAA TCTATGACA-3′，下游：5′-GCTGAGGTATCGTTAGGAAT-3′；MMP-9引物序列：上游：5′-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′，下游：5′-CGGGAAGT CTTCCGAGTAGTTT-3′；Nrf 2引物序列：上游：5′-GTCGACATGAAGCACCTGAAGCGG-3′，下游：5′-GGATCCCTTTCTCTTTCCCTTTTG-3′］，并用GenBank Blast 進(jìn)行同源性比對(duì)，引物序列由奧科生物科技有限公司合成。④產(chǎn)物鑒定：取6 μL PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行凝膠電泳，經(jīng)GelDolXR 凝膠成像及Quantity one 分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以β-actin為內(nèi)參物，測(cè)定TGF-β1、MMP-9、Nrf 2和β-actin的平均積分光密度，以其與β-actin的比值表示其表達(dá)相對(duì)水平。

嚴(yán)重程度分組：參照Cullen PK Jr 等［5］方法及《女性壓力性尿失禁診斷和治療指南（2017）》［6］將SUI 分為Ⅰ～Ⅳ度。根據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》第6 版［4］中關(guān)于POP 標(biāo)準(zhǔn)將POP 患者分為Ⅰ～Ⅲ度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)后用（）表示，用t檢驗(yàn)比較兩組間差異，用單因素方差分析比較多組間差異；采用ROC 曲線分析TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達(dá)量對(duì)POP、SUI 的鑒別價(jià)值；采用spearman 檢驗(yàn)分析TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達(dá)量與POP、SUI 嚴(yán)重程度的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組及對(duì)照組TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達(dá)比較

POP 合并SUI 組的TGF-β1表達(dá)量低于POP組、SUI 組，MMP-9、Nrf 2表達(dá)量高于POP 組、SUI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；POP 組、SUI組、POP 合并SUI 組的TGF-β1表達(dá)量低于對(duì)照組，MMP-9、Nrf 2表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 四組患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達(dá)比較（±s）Table 1 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 among the four groups（±s）

表1 四組患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達(dá)比較（±s）Table 1 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 among the four groups（±s）

注：與POP 合并SUI 組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05。

Nrf2 0.31±0.05ab 0.34±0.06ab 0.42±0.07b 0.15±0.03 182.27＜0.001組別POP 組SUI 組POP 合并SUI 組對(duì)照組F 值P 值n 35 31 26 47 TGF-β1 0.31±0.04ab 0.29±0.05ab 0.22±0.06b 0.40±0.08 51.857＜0.001 MMP-9 0.27±0.05ab 0.31±0.05ab 0.43±0.06b 0.09±0.02 363.929＜0.001

2.2 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達(dá)對(duì)POP 及SUI 的鑒別價(jià)值

TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達(dá)單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)鑒別POP 及SUI 的AUC 分別為0.629、0.637、0.653、0.665。見(jiàn)表2、圖1。

表2 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達(dá)對(duì)POP 及SUI 的鑒別價(jià)值Table 2 The differential value of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 for POP and SUI

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curves

2.3 不同嚴(yán)重程度POP 及SUI 患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達(dá)比較

TGF-β1表達(dá)隨POP、SUI 病情的加重而降低，MMP-9、Nrf 2表達(dá)隨POP、SUI 病情的加重而增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 不同嚴(yán)重程度POP 及SUI 患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達(dá)比較（±s）Table 3 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 in patients with different severity of POP and SUI（±s）

表3 不同嚴(yán)重程度POP 及SUI 患者的TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達(dá)比較（±s）Table 3 Comparison of TGF-β1，MMP-9 and Nrf 2 in patients with different severity of POP and SUI（±s）

組別POP nⅠ度Ⅱ度Ⅲ度F 值P 值Ⅰ度Ⅱ度Ⅲ～Ⅳ度F 值P 值23 21 17 SUI 17 26 14 TGF-β1 0.31±0.06 0.28±0.06 0.21±0.05 15.936＜0.001 0.28±0.04 0.26±0.05 0.23±0.04 5.048＜0.05 MMP-9 0.27±0.05 0.34±0.06 0.43±0.08 33.278＜0.001 0.31±0.05 0.35±0.06 0.46±0.06 29.600＜0.001 Nrf 2 0.32±0.05 0.36±0.05 0.40±0.07 10.486＜0.001 0.33±0.06 0.37±0.07 0.45±0.08 12.275＜0.001

2.4 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達(dá)與POP、SUI 嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

TGF-β1表達(dá)與POP、SUI 嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，MMP-9、Nrf 2表達(dá)與POP、SUI 嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。見(jiàn)表4。

表4 TGF-β1、MMP-9、Nrf 2 表達(dá)與POP、SUI 嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析Table 4 Correlation between TGF-β1，MMP-9，Nrf 2 and the severity of POP and SUI

3 討論

PFD 又稱為盆地缺陷或盆底支持組織松弛，好發(fā)于中老年婦女，會(huì)給患者帶來(lái)一系列精神、生理方面的困擾，嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量［7］。據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，老年婦女的PFD 患病率高達(dá)50%，是影響中老年女性身心健康的主要疾?。?］。目前認(rèn)為，盆底結(jié)締組織結(jié)構(gòu)及功能與PFD 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。膠原蛋白是盆底支持組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，細(xì)胞外基質(zhì)降解可導(dǎo)致盆底支持組織膠原蛋白含量減少，使得支持組織彈性兼容，而造成盆底結(jié)構(gòu)損傷、松弛，最終導(dǎo)致PFD［9］。相關(guān)報(bào)道指出，MMP 相關(guān)因子與彈性蛋白、膠原蛋白相關(guān)，參與了細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)過(guò)程［10］。MMP-9 是MMP家族成員之一，具有蛋白水解功能，其可分解細(xì)胞外基質(zhì)，可降解膠原、改變膠原蛋白的形狀，可降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，破壞細(xì)胞外基質(zhì)正常結(jié)構(gòu)和功能。分娩、產(chǎn)傷等因素使得女性盆底結(jié)締組織受損后，可促進(jìn)MMP-9 分泌，影響細(xì)胞外基質(zhì)的合成及降解，進(jìn)而導(dǎo)致盆底結(jié)構(gòu)改變。TGF-β1是一種多功能生長(zhǎng)因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化，抑制炎癥。相關(guān)研究指出，TGF-β1 能刺激細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)中大多數(shù)膠原基因的表達(dá)，并能促進(jìn)膠原蛋白產(chǎn)物分泌［11］。NrF 2 可通過(guò)參與細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)控制細(xì)胞周期，目前臨床上有關(guān)其與PFD 發(fā)生過(guò)程的報(bào)道較少。本研究表明PFD患者存在MMP-9、Nrf 2異常表達(dá)現(xiàn)象，且POP 患者合并SUI 可促進(jìn)MMP-9、Nrf 2分泌，抑制TGF-β1表達(dá)，其原因目前尚不可知，故后期需進(jìn)行進(jìn)一步探究。POP 及SUI 是兩種不同的PFD 類型，治療方法也存在差異。POP 是指盆腔器官疝出至陰道壁及超出陰道壁，主要采用陰道子宮托及修補(bǔ)手術(shù)治療；SUI 是一種常見(jiàn)疾病，表現(xiàn)為尿液不自主流出，目前尚無(wú)有效藥物治療方案，主要通過(guò)盆底肌肉鍛煉、膀胱訓(xùn)練等進(jìn)行治療。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達(dá)鑒別POP 及SUI 的AUC 均小于0.7，表明其對(duì)POP、SUI 的鑒別價(jià)值較低，故不建議通過(guò)檢測(cè)TGF-β1等來(lái)鑒別不同類型PFD。

盆底結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分為膠原蛋白、彈性蛋白等，有助于維持正常盆地結(jié)構(gòu)［12］。在正常生理?xiàng)l件下，成纖維細(xì)胞釋放的纖維蛋白原及其溶解處于平衡狀態(tài)，但在病理狀態(tài)下，TGF-β1可刺激細(xì)胞外基質(zhì)合成，誘導(dǎo)纖維酶活化因子抑制因子及膠原酶的合成釋放，進(jìn)而抑制膠原降解［13］。TGF-β1 對(duì)膠原的調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，可通過(guò)自分泌調(diào)控方式及細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，間接調(diào)控膠原膠原相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平，并能維持相關(guān)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性［14-15］。臨床資料顯示，MMP-9 與細(xì)胞外基質(zhì)的合成及降解代謝有關(guān)，而盆底結(jié)締組織一旦受到損傷或炎癥刺激，其所產(chǎn)生的細(xì)胞炎性因子即能激活MMP-9，而影響結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)的重建和修復(fù)［16-17］。本研究結(jié)果提示POP、SUI 患者TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達(dá)或與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β1表達(dá)與POP、SUI 嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，MMP-9、Nrf 2表達(dá)與POP、SUI 嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，表明TGF-β1、MMP-9、Nrf 2或參與了PFD 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其原因TGF-β1 水平降低可促進(jìn)MMP表達(dá)，從而抑制陰道膠原合成，進(jìn)而可加重病情。

綜上所述，PFD 患者陰道壁組織TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達(dá)與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，且不同類型患者TGF-β1、MMP-9、Nrf 2表達(dá)水平不同，但其對(duì)PFD 患者類型鑒別價(jià)值較低。但本研究尚存在不足之處，納入樣本量較少且為回顧性分析，可能會(huì)影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，故后期需增加樣本量，并進(jìn)行前瞻性研究，排除其他因素對(duì)本研究的影響，以減少研究過(guò)程中的誤差，提高研究結(jié)果的可靠性。