牙齦組織中MMP-13和TIMP-1的表達(dá)與游離齦移植術(shù)后應(yīng)用CGF生長(zhǎng)因子創(chuàng)面愈合的關(guān)系

于蘭 于文鳳 呂敏敏

游離齦移植術(shù)是指將用自體健康的牙齦組織移植到角化齦缺失或不足區(qū)域，加寬附著齦，加深前庭溝，目前廣泛用于牙周手術(shù)中［1］。但游離齦移植后，供區(qū)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)開放的傷口，該傷口一般需要2～4周才能完全恢復(fù)，繼發(fā)性創(chuàng)傷會(huì)影響患者的術(shù)后舒適度，嚴(yán)重時(shí)供區(qū)發(fā)生感染，造成傷口愈合時(shí)間延長(zhǎng)［2］。血小板濃縮液能釋放多種生長(zhǎng)因子，釋放的生長(zhǎng)因子可用于促進(jìn)傷口愈合和減輕術(shù)后疼痛和不適。濃縮血小板生長(zhǎng)因子（concentrated growth factors，CGF）是第三代血小板衍生物，相關(guān)研究表明，CGF 釋放的多種生長(zhǎng)因子可用于促進(jìn)骨和軟組織的形成，對(duì)傷口愈合具有促進(jìn)作用［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix mettallo-proteinases，MMPs）是一種主要由結(jié)締組織細(xì)胞分泌的蛋白酶，能破壞細(xì)胞外基質(zhì)，并參與多種生物作用，如重塑組織、創(chuàng)傷愈合等，其中，基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）和組織金屬蛋白酶抑制劑1（Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）是MMPs 家屬成員之一。以往研究以證實(shí)MMPs 在傷口愈合的過程中發(fā)揮著積極作用［4］，但MMP-13 和TIMP-1 游離齦移植術(shù)后應(yīng)用CGF 生長(zhǎng)因子創(chuàng)面愈合過程中的表達(dá)尚不清楚。因此，本研究旨在探討牙齦組織中MMP-13 和TIMP-1 的表達(dá)以及游離齦移植術(shù)后應(yīng)用CGF 生長(zhǎng)因子創(chuàng)面愈合的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年6月至2021年12月滄州人民醫(yī)院口腔科行游離齦移植術(shù)的患者82 例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①行游離齦移植術(shù)者；②年齡＞18歲；③配合度良好；④3 個(gè)月內(nèi)未服用抗生素；⑤所有患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有惡性腫瘤、嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、嚴(yán)重的心、肝、腎功能不全的者；②有血液或免疫系統(tǒng)基本者；③3 個(gè)月內(nèi)有服用干擾軟組織再生的相關(guān)藥物；④存在牙周手術(shù)禁忌癥。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 治療方法

兩組患者均行游離齦移植術(shù)后，對(duì)照組獲得游離齦瓣后，在供體處縫合碘仿紗條，觀察組應(yīng)用CGF 薄膜覆蓋硬腭供區(qū)創(chuàng)面，再用碘仿紗條縫合。

1.2.2 標(biāo)本提取

于治療后3、7、14、30 d 后局部麻醉后沿牙齦近中、遠(yuǎn)中垂直切入牙周袋或齦溝底部，再沿袋底或溝底橫向切開以獲取牙齦組織標(biāo)本。放置在40 g/L 多聚甲醛中進(jìn)行2～12 h 的固定。

1.2.3 免疫組化方法

固定標(biāo)本脫水，透明，石蠟包埋，3 μm 厚切片，60℃烤箱烘烤2 h，經(jīng)梯度乙醇脫水，pH 為9.0 的Tris-EDTA（pH 為9.0）微波復(fù)液修補(bǔ)15 min。在3%的H2O2室溫孵育10 min。滴加按1∶250 稀釋得一抗，在4℃下培養(yǎng)1 晚。非生物素二抗IgG 在37℃下培養(yǎng)15 min。每個(gè)步驟均用pH 為7.4 的沖洗3 次，每次沖洗時(shí)間為5 min。DAB 染色、蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化、脫水、透明、中性膠封片。PBS 替代一抗作為陰性對(duì)照。在400 倍光鏡下，隨機(jī)選取10 個(gè)視場(chǎng)進(jìn)行拍攝，利用Image Pplus 圖像分析測(cè)試軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，并對(duì)其進(jìn)行光度平均值的計(jì)算。

1.2.4 免疫組化陽性判斷及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

牙齦組織中MMP-13、TIMP-1 均以胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采用半定量的積分法［5］，對(duì)10 個(gè)含有陽性細(xì)胞高倍鏡視野（×200）進(jìn)行隨機(jī)觀察，兩名病理科醫(yī)生進(jìn)行雙盲法讀片，并對(duì)所觀察到的陽性細(xì)胞的數(shù)量取其平均值進(jìn)行計(jì)數(shù)。陽性：MMP-13、TIMP-1 的陽性細(xì)胞率為1%～10%，賦予1 分；11%～50%，賦予2 分；51%～75%，賦予3 分，強(qiáng)陽性：陽性細(xì)胞率為＞75%；陰性：MMP-13、TIMP-1 的陽性細(xì)胞率為0 或高倍鏡視野下細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見棕黃色顆粒。低表達(dá)：陽性細(xì)胞率≤3 分，高表達(dá)：＞3 分。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 創(chuàng)面愈合率［6］

治療后3、7、14、30 d 后用單反相機(jī)記錄創(chuàng)面愈合情況。以一定的標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度（參考牙周探針）和單反相機(jī)鏡片垂直于組織創(chuàng)面的條件下進(jìn)行創(chuàng)面拍攝，應(yīng)用ImagePlus6.0 軟件進(jìn)行面積測(cè)量。創(chuàng)面愈合率=（初始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)

治療后3、7、14、30 d 后比較兩組牙齦組織中MMP-13 和TIMP-1 的表達(dá)情況。比較觀察組MMP-13 和TIMP-1 水平表達(dá)情況與創(chuàng)面愈合的關(guān)系。相關(guān)性分析觀察組治療30 d 創(chuàng)面面積愈合率與牙齦組織中TIMP-1 的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（）表述，行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以n（%）表述，采用χ2檢驗(yàn)，用Pearson 相關(guān)性分析MMP-13和TIMP-1 與創(chuàng)面愈合的關(guān)系。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組創(chuàng)面愈合率比較

隨治療時(shí)間的延長(zhǎng)，觀察組的創(chuàng)面面積愈合率逐漸升高，觀察組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組創(chuàng)面愈合率比較（±s）Table 1 Comparison of wound healing rates between the two groups（±s）

表1 兩組創(chuàng)面愈合率比較（±s）Table 1 Comparison of wound healing rates between the two groups（±s）

組別觀察組對(duì)照組t 值P 值n 41 41 3 d 2.60±0.48 2.20±0.60 3.316 0.002 7 d 34.02±4.87 30.24±4.06 3.817 0.000 14 d 48.90±7.15 44.79±10.18 2.115 0.037 30 d 62.09±10.65 55.72±8.93 2.934 0.004

2.2 兩組MMP-13 表達(dá)情況比較

隨治療時(shí)間的延長(zhǎng)，觀察組牙齦組織中MMP-13 的表達(dá)水平逐漸下降，觀察組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 兩組MMP-13 表達(dá)情況比較（±s）Table 2 Comparison of MMP-13 expression between the two groups（±s）

表2 兩組MMP-13 表達(dá)情況比較（±s）Table 2 Comparison of MMP-13 expression between the two groups（±s）

組別觀察組對(duì)照組t 值P 值n 41 41 3 d 0.72±0.03 0.74±0.04 2.561 0.012 7 d 0.67±0.03 0.69±0.05 2.196 0.031 14 d 0.54±0.05 0.59±0.04 5.000 0.000 30 d 0.50±0.03 0.53±0.02 5.327 0.000

2.3 兩組TIMP-1 表達(dá)情況比較

隨治療時(shí)間的延長(zhǎng)，觀察組牙齦組織中TIMP-1的表達(dá)水平逐漸上升，觀察組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖1。

圖1 2 組牙齦組織中TIMP-1、MMP-13 的表達(dá)（SP，×400）Figure 1 Expression of TIMP-1 and MMP-13 in gingival tissue of two groups（SP，×400）

表3 兩組TIMP-1 表達(dá)情況比較（±s）Table 3 Comparison of TIMP-1 expression between the two groups（±s）

表3 兩組TIMP-1 表達(dá)情況比較（±s）Table 3 Comparison of TIMP-1 expression between the two groups（±s）

組別觀察組對(duì)照組t 值P 值n 41 41 3 d 0.49±0.03 0.47±0.04 2.561 0.012 7 d 0.56±0.12 0.50±0.13 2.171 0.032 14 d 0.69±0.18 0.60±0.20 2.141 0.035 30 d 0.77±0.17 0.59±0.13 5.385 0.000

2.4 觀察組MMP-13 和TIMP-1 水平表達(dá)情況與創(chuàng)面愈合的關(guān)系

MMP-13 的高表達(dá)組創(chuàng)面愈合率顯著低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TIMP-1 的高表達(dá)組創(chuàng)面愈合率顯著高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 觀察組MMP-13 和TIMP-1 水平表達(dá)情況與創(chuàng)面愈合的關(guān)系［n（%），（±s）］Table 4 The relationship between the expression of MMP-13 and TIMP-1 in observation group and wound healing［n（%），（±s）］

表4 觀察組MMP-13 和TIMP-1 水平表達(dá)情況與創(chuàng)面愈合的關(guān)系［n（%），（±s）］Table 4 The relationship between the expression of MMP-13 and TIMP-1 in observation group and wound healing［n（%），（±s）］

項(xiàng)目MMP-13高表達(dá)（n=26）低表達(dá)（n=15）t 值P 值TIMP-1高表達(dá)（n=14）低表達(dá)（n=27）t 值P 值創(chuàng)面愈合率60.08±8.34 65.79±7.16 2.218 0.032 67.80±8.78 61.15±7.75 2.490 0.017

2.5 觀察組治療30 d 創(chuàng)面面積愈合率與牙齦組織中MMP-13、TIMP-1 的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，觀察組治療30 d創(chuàng)面面積愈合率與牙齦組織中MMP-13 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.031，P=0.035），與牙齦組織中TIMP-1表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.403，P=0.009）。見圖2。

圖2 觀察組治療30 d 創(chuàng)面面積愈合率與牙齦組織中MMP-13、TIMP-1 的相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis between wound healing rate and MMP-13、TIMP-1 in gingival tissue in the observation group after 30 days of treatment

3 討論

修復(fù)各種由外傷或醫(yī)源性引起的軟組織缺損，是臨床上普遍存在的問題。傷口的愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要各種膠原、可溶性介質(zhì)、細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞等多種因素的綜合作用。目前，F(xiàn)GG術(shù)后腭部供區(qū)粘膜創(chuàng)面修復(fù)的方法較多，如血小板濃縮物等血液制品中豐富的生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合。相關(guān)研究表明，濃縮生長(zhǎng)因子能促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞的增殖和分化，并促進(jìn)種植體軟組織的再生，對(duì)口腔種植體骨組織的起修復(fù)作用［7］?；|(zhì)金屬蛋白酶與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的動(dòng)態(tài)平衡在修復(fù)組織細(xì)胞、炎性細(xì)胞遷移、促進(jìn)創(chuàng)面上皮化等方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中，MMP-13、TIMP-1均屬于MMPs 家族［8］7。但MMP-13、TIMP-1 與游離齦移植術(shù)后應(yīng)用CGF 治療創(chuàng)面愈合中具體機(jī)制仍不清楚，需要深入探究其在牙齦組織中表達(dá)情況，分析其與創(chuàng)面愈合的關(guān)系。

血小板濃縮物由自提全血離心所得，CGF 是第三代血小板衍生物，與富血小板血漿、富血小板纖維蛋白相比，CGF 中含有更豐富的生長(zhǎng)因子，具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖和修復(fù)作用。本研究結(jié)果顯示，隨治療時(shí)間的延長(zhǎng)，觀察組的創(chuàng)面面積愈合率逐漸升高，觀察組高于對(duì)照組。由于CGF 中的生長(zhǎng)因子較為豐富，治療時(shí)間越長(zhǎng)，觀察組表現(xiàn)出較對(duì)照組更好的創(chuàng)面愈合效果。CGF 中富含纖維蛋白支架、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子以及表皮生長(zhǎng)因子等，這些生長(zhǎng)因子對(duì)上皮細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用，并能在創(chuàng)面中形成新的血管網(wǎng)絡(luò)，從而保證硬腭供區(qū)的營(yíng)養(yǎng)供給［9］。此外，CGF 膜中豐富的生長(zhǎng)因子，能夠滿足機(jī)體早期修復(fù)所需，且與細(xì)胞間存在良好的協(xié)同效應(yīng)，彌補(bǔ)了單一生長(zhǎng)因子對(duì)組織修復(fù)的影響，加快缺損區(qū)的修復(fù)。本研究結(jié)果顯示，隨治療時(shí)間的延長(zhǎng)，MMP-13 的表達(dá)水平逐漸下降，觀察組低于對(duì)照組。慢性難愈合創(chuàng)面是由于過多的炎性因子作用所致，早期可見到少量MMP-13 及TIMP-1 的表達(dá)，到晚期時(shí)，由于大量的炎癥因子存在，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)MMP-13 和TIMP-1 被釋放，破壞創(chuàng)面的正常組織，導(dǎo)致機(jī)體形成久不愈合的狀況［10-11］。MMP-13是多種炎癥因子最后作用的靶分子，TIMP-1 參與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的過程，本研究創(chuàng)面愈合的其作用機(jī)理考慮是通過降低MMP-13、TIMP-1 的表達(dá)水平相關(guān)［12-13］。MMP-13、TIMP-1 在上皮細(xì)胞再生及傷口愈合中具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，MMP-13 高表達(dá)組創(chuàng)面愈合率均低于低表達(dá)組，TIMP-1 高表達(dá)組創(chuàng)面愈合率均高于低表達(dá)組。MMP-13 參與多種正常的生理、病理過程，如組織愈合、形態(tài)形成和修復(fù)，當(dāng)創(chuàng)面愈合程度越高，MMP-13 表達(dá)水平越低［14］。TIMP-1 的高水平表達(dá)可能通過對(duì)MMPs 的清除、細(xì)胞的遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等作用，從而起到促進(jìn)傷口的愈合效果［15］。本研究Pearson 相關(guān)性分析顯示，觀察組術(shù)后30d 創(chuàng)面面積愈合率與牙齦組織中MMP-13表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與TIMP-1 表達(dá)水平呈正相關(guān)。因此，術(shù)后通過監(jiān)測(cè)患者牙齦組織中MMP-13、TIMP-1 表達(dá)情況，而給予針對(duì)性的治療，及時(shí)糾正游離齦移植術(shù)后供區(qū)創(chuàng)面的微環(huán)境，可促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，行游離齦移植術(shù)后應(yīng)用CGF 生長(zhǎng)因子治療患者牙齦組織中MMP-13 的表達(dá)水平逐漸下降，TIMP-1 的表達(dá)水平逐漸逐漸升高，兩者與創(chuàng)面愈合率密切關(guān)聯(lián)，CGF 生長(zhǎng)因子可能通過調(diào)控MMP-13 和TIMP-1 之間的關(guān)系以達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面愈合的目的。