骨髓炎患兒血清組織蛋白酶G、乳鐵蛋白表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性

李佳鑫 王樹人 單志濤 王特哈斯

骨髓炎是臨床中常見的一種感染性骨科疾病，其發(fā)病原因與化膿性細(xì)菌侵襲機(jī)體血液循環(huán)，影響骨髓內(nèi)結(jié)締組織，是一種感染性骨科炎癥，一部分患者是因?yàn)榧?xì)菌對(duì)鄰近軟組織進(jìn)行侵染發(fā)展形成，也有一部分是因?yàn)殚_放性骨折導(dǎo)致的感染［1-2］。學(xué)齡兒童發(fā)生骨髓炎的概率較大，一旦治療不及時(shí)，會(huì)對(duì)機(jī)體骨結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，對(duì)兒童的生長發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，其生理、病理性變化常常伴隨不可逆性，最終導(dǎo)致殘疾［3］。乳鐵蛋白（lactoferrin，lf）主要是通過上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生，屬于一種鐵結(jié)合糖蛋白，起作用主要體現(xiàn)在抗病毒和抗氧化，同時(shí)發(fā)揮抑菌作用，通過免疫調(diào)節(jié)參與多種生理、病理過程［4］。已經(jīng)有研究證實(shí)，lf 對(duì)成骨細(xì)胞增殖具有一定的促進(jìn)作用［5］，但是關(guān)于在骨髓炎中的相關(guān)研究較少。組織蛋白酶G（Cathepsin G，ctsg）是組織蛋白酶家族中的重要成員，主要存在于中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞中，參與病原體清除過程，在細(xì)胞因子水解以及細(xì)胞表面受體激活、脫落中具有參與作用［6］。目前臨床中主要采用抗生素、手術(shù)對(duì)骨髓炎患兒進(jìn)行治療，但是患兒的預(yù)后狀況較差。本文旨在研究骨髓炎患兒血清ctsg、lf 表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為兒童骨髓炎臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年11月至2021年11月在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的骨髓炎患兒60 例，分為骨髓炎組，男35 例，女25 例，平均年齡（6.18±4.90）歲，平均病程（5.23±4.00）d，根據(jù)患病部位分為骨干骨髓炎30 例，干骺端骨髓炎30 例，其中包括預(yù)后良好20 例，預(yù)后不良40 例。選取同時(shí)期在本院健康體檢患兒50 名，分為正常組，男25 例，女25例，平均年齡（7.13±4.85）歲。兩組性別比例、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患兒均符合《中華小兒外科雜志》［7］中關(guān)于骨髓炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)：局部壓痛，肢體活動(dòng)受限、屈曲狀，患兒伴有發(fā)熱、煩躁不安、哭鬧等，感染敗血癥；所有患兒均經(jīng)過CT、MRI 檢查、血清生化確診；本文研究患兒家屬均知情，簽署知情同意書，經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。排除標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)核性骨髓炎患兒；白血病患兒；精神異?；純海换撔躁P(guān)節(jié)炎患兒；骨干肉瘤、骨樣瘤患兒；退變性關(guān)節(jié)病等合并其他骨科疾病患兒；蜂窩組織炎、凝血功能異?；純骸?/p>

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)ctsg、lf 水平

抽取兩組研究對(duì)象入院當(dāng)天空腹靜脈血5 mL，轉(zhuǎn)速3 000 rpm 離心10 min 后離心半徑10 cm，提取上層血清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)：將提前稀釋好的血液標(biāo)本100 μL 加入相應(yīng)的微孔板反應(yīng)空中，第1 孔只加樣品稀釋液為零孔，混合均勻，37℃孵育90 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；每孔加入準(zhǔn)備好的抗體0.1 mL，在37℃孵育60 min，底物四甲基聯(lián)苯胺（TMS）空白孔不加；甩去孔內(nèi)液體，每孔中加入90 μL PBS，浸泡1～2 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；每孔中加入90 μL TMS，避光放置15～20 min；每孔中加入90 μL TMS 終止液，即藍(lán)色變?yōu)辄S色。分光光度計(jì)測(cè)量450 mm 處OD值，分析ctsg、lf 水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒由深圳市科潤達(dá)生物工程有限公司提供。

1.2.2 急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ（Acute physiology and chronic health status scoring system Ⅱ，APACHE Ⅱ）分評(píng)估［8］

APACHEⅡ評(píng)分系統(tǒng)主要包括年齡、急性生理學(xué)（APS）、慢性健康狀況評(píng)分組成，其中APS 包括12項(xiàng)生理參數(shù)，總分為三者之和，最高分為71 分，＞15分表示患者為重癥，15 分以下表示患者為非重癥。

1.2.3 預(yù)后評(píng)估

采用危重評(píng)分（Pediatric Critical Illness Score，PCIS，PCIS）［9］、兒童死亡危險(xiǎn)評(píng)分（Pediatric Risk of Mortality，PRISM）［10］評(píng)估骨髓炎患兒預(yù)后，PCIS評(píng)分主要包括8 項(xiàng)內(nèi)容，總分為80 分，患兒得分越低說明病情越嚴(yán)重。PRISM 評(píng)分總分為100 分，患兒得分越低說明病情越危重。PCIS 評(píng)分為80～70 分，PRISM 評(píng)分為100-90 分表示患兒優(yōu)良預(yù)后；PCIS 評(píng)分為＜70 分，PRISM 評(píng)分為＜90 分表示患兒不良預(yù)后。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓炎患兒與正常兒童ctsg、lf 表達(dá)水平比較

與正常組相比，骨髓炎組ctsg 表達(dá)水平升高，lf 表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 骨髓炎患兒與正常兒童ctsg、lf 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of CTSG and LF expression levels between osteomyelitis children and normal children（±s）

表1 骨髓炎患兒與正常兒童ctsg、lf 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of CTSG and LF expression levels between osteomyelitis children and normal children（±s）

組別正常組骨髓炎組t 值P 值n 50 60 ctsg（ng/mL）32.25±12.36 260.26±26.96 55.140 0.001 lf（mg/mL）7.90±2.18 5.25±1.03 8.367 0.001

2.2 不同APACHEⅡ分值患兒ctsg、lf 表達(dá)水平比較

與0-15 分組相比，大于15 分組ctsg 表達(dá)水平升高，lf 表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同APACHEⅡ分值ctsg、lf 表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of expression levels of CTSG and LF in different APACHE ⅱscores（±s）

表2 不同APACHEⅡ分值ctsg、lf 表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of expression levels of CTSG and LF in different APACHE ⅱscores（±s）

APACHEⅡ0～15 分＞15 分t 值P 值n 22 38 ctsg（ng/mL）188.90±10.11 301.57±20.23 24.360 0.001 lf（mg/mL）7.60±1.10 3.89±0.66 16.370 0.001

2.3 不同預(yù)后患兒ctsg、lf 表達(dá)水平比較

與不良預(yù)后相比，預(yù)后優(yōu)良患兒ctsg 表達(dá)水平降低，lf 表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同預(yù)后患兒ctsg、lf 表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of CTSG and LF expression levels in children with different prognoses（±s）

表3 不同預(yù)后患兒ctsg、lf 表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Comparison of CTSG and LF expression levels in children with different prognoses（±s）

APACHEⅡ不良預(yù)后優(yōu)良預(yù)后t 值P 值n 40 20 ctsg（ng/mL）321.71±30.37 137.36±10.63 26.260 0.001 lf（mg/mL）4.02±0.89 7.71±1.26 13.130 0.001

2.4 骨髓炎患兒ctsg、lf 水平與APACHEⅡ分相關(guān)性比較

ctsg 與APACHEⅡ分呈正相關(guān)（r=0.814，P=0.001）；lf 與APACHEⅡ分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.786，P=0.001）。見圖1。

圖1 ctsg、lf 水平與APACHEⅡ分相關(guān)性比較Figure 1 Comparison of correlation between CTSG，LF levels and APACHE ⅱ

3 討論

骨髓炎主要分為急性和慢性，急性骨髓炎是通過細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體生理、病理進(jìn)行誘導(dǎo)導(dǎo)致發(fā)病，其主要發(fā)病機(jī)制為大量炎癥介質(zhì)以及細(xì)胞因子釋放，引起免疫系統(tǒng)紊亂，炎癥反應(yīng)失調(diào)［11］。慢性骨髓炎病理變化主要體現(xiàn)在骨內(nèi)有膿液，肉芽組織產(chǎn)生，出現(xiàn)死骨和硬化骨等，感染病灶出現(xiàn)，炎癥不斷擴(kuò)散，引起炎性反應(yīng)，慢性骨髓炎患者進(jìn)行藥物治療后，局部炎癥消失，但是病情常反復(fù)發(fā)作［12］。相關(guān)研究顯示，較輕的骨髓炎患者因?yàn)殚L時(shí)間炎癥不治愈，引起肌肉萎縮，關(guān)節(jié)變得僵硬，對(duì)肢體功能、外觀等產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，病情嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致癌癥發(fā)生，影響患者的生活質(zhì)量和生命安全［13］。

lf 作為一種非血紅色鐵結(jié)合蛋白，具有抗病毒、抗細(xì)菌活性的作用，抑制炎性細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化具有促進(jìn)作用，同時(shí)能促進(jìn)腸道益生菌生長［14］。且lf 能有效的顯示機(jī)體中中性粒細(xì)胞總數(shù)及轉(zhuǎn)化率，有研究指出，lf 濃度的高低反應(yīng)中性粒細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，提示lf 與中性粒細(xì)胞成熟度有關(guān)［15］。lf 對(duì)鐵誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化過程有一定的抑制作用，抑制丙二醛、超氧離子產(chǎn)生，避免中性粒細(xì)胞受損；同時(shí)lf 通過抑制氫氧根基團(tuán)，從而保護(hù)周圍組織不受損傷［16-17］。在本文研究結(jié)果顯示，骨髓炎患兒lf 水平較低，提示lf 水平可能參與骨髓炎發(fā)病過程。＞15 APACHEⅡ分值患兒lf 表達(dá)水平下降明顯，提示lf 水平高低與骨髓炎患兒嚴(yán)重程度有關(guān)。預(yù)后不良患兒lf 表達(dá)水平低，提示骨髓炎患兒病情越來越嚴(yán)重，患兒預(yù)后狀況也越來越差。

ctsg 作為一種常見的絲氨酸類蛋白酶，對(duì)IL-1β、TNF-α、IL-8 等細(xì)胞因子具有活化水解作用，參與炎癥因子免疫應(yīng)答過程，進(jìn)而發(fā)揮促炎和抗炎功能［18］。ctsg 通過對(duì)蛋白酶激活受體（PAR）N 末端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行加工，促進(jìn)PAR 受體活化，通過降低凝血酶受體活性，參與凝血平衡以及炎癥反應(yīng)過程［19］。本文研究結(jié)果顯示，在骨髓炎患兒血清中ctsg 表達(dá)水平較高，提示骨髓炎患兒發(fā)病可能與ctsg 水平有關(guān)。相關(guān)研究顯示，當(dāng)氣道被金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌感染，氣道中的上皮細(xì)胞以及骨髓細(xì)胞會(huì)對(duì)病原體產(chǎn)生影響，導(dǎo)致大量的中性粒細(xì)胞被釋放，在氣道募集，大量粘液產(chǎn)生，炎癥性反應(yīng)加重［20-21］。在本文研究中＞15 APACHEⅡ分值患兒ctsg 表達(dá)水平顯著升高，說明ctsg 水平與骨髓炎患兒病情嚴(yán)重程度有關(guān)，參與疾病發(fā)展。ctsg 過渡活化會(huì)激活機(jī)體中的細(xì)胞間黏附分子1、TNF-α 等，內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，血管屏障功能障礙較為嚴(yán)重［22］。在本文研究中，預(yù)后優(yōu)良患兒ctsg 表達(dá)水平較低，說明ctsg 水平的高低影響骨髓炎患兒預(yù)后。

綜上所述，在骨髓炎患兒血清中，ctsg、lf 呈表達(dá)異常，而且ctsg、lf 表達(dá)高低與病情嚴(yán)重程度以及患兒預(yù)后具有緊密聯(lián)系。由此可知，ctsg、lf應(yīng)用于骨髓炎患兒的檢測(cè)當(dāng)中，能夠明顯提高臨床預(yù)測(cè)效果，可為臨床治療骨髓炎提供有效的使用價(jià)值。