腸道病毒EV71型和CA16型IgM抗體檢測(cè)試劑盒的分析性能

何水珍 嚴(yán)荔貞 施少鑫 鐘秋蓉

手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD）是一種由病毒引起的傳染性疾病，5 歲以下兒童為常見患者［1］。腸道病毒71 型（Enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A16 型（Coxsackievirus A16，CA16）是手足口病最常見的致病病原體，其中EV71 是重癥和致命病例中最常見的致病病原體［2］。從20世紀(jì)90年代開始，EV71 在亞洲地區(qū)及太平洋沿岸地區(qū)已經(jīng)導(dǎo)致了數(shù)千人死亡［3］，2008-2017年，全國手足口病總報(bào)告發(fā)病率為134.59/10 萬［4］。手足口病不僅對(duì)嬰幼兒的健康造成了極大的傷害，而且造成的疾病負(fù)擔(dān)尤為嚴(yán)重［5］，已納入我國法定傳染病丙類管理［6］。IgM特異性抗體是感染初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，可作為感染的早期診斷指標(biāo)。根據(jù)中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)《手足口病診療指南（2018年版）》診斷建議：在臨床診斷病例基礎(chǔ)上，急性期血清相關(guān)病毒IgM 抗體陽性可定為確診病例［1］。早期開展CA16 IgM 和EV71 IgM 抗體的聯(lián)合檢測(cè)，可以為手足口病的診斷及監(jiān)控治療，提供切實(shí)支撐［7］，因此，EV71 IgM和CA16 IgM 的檢測(cè)具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究對(duì)基于化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)腸道病毒71 型IgM 抗體的試劑盒和檢測(cè)柯薩奇病毒A16 型IgM抗體的試劑盒進(jìn)行分析性能評(píng)價(jià)，并探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Caris200（廈門優(yōu)邁科醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；DEM-3 型洗板機(jī)（北京拓普分析儀器有限公司）；電熱恒溫標(biāo)準(zhǔn)水箱ZD-600（杭州藍(lán)天儀器有限公司）；酶標(biāo)儀Sunrise（Tecan Austria GmBH）；廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司研制的腸道病毒71 型IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）（EV71 IgM CMIA）和柯薩奇病毒A16 型IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）（CA16 IgM CMIA）；北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的腸道病毒71 型IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）和柯薩奇病毒A16 型IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）。

1.2 方法

1.2.1 分析性能評(píng)價(jià)

1.2.1.1 精密度評(píng)價(jià) 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）相關(guān)文件［8］，連續(xù)測(cè)定重復(fù)性參考品CV1 和CV2 各10 次，計(jì)算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），以此作為批內(nèi)精密度。將兩批試劑每天在不同儀器上重復(fù)檢測(cè)一份強(qiáng)陽樣本（P1）、中陽樣本（P2）、弱陽樣本（P3）及一份陰性樣本（N1）兩次，連續(xù)檢測(cè)20 d，綜合日間、臺(tái)間、批間等影響變量，計(jì)算CV，以此作為中間精密度。

1.2.1.2 機(jī)載穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 將試劑放置于儀器上，分別在開瓶的第1 天、第7 天、第14 天、第21 天、第28 天檢測(cè)3 例陽性樣本，通過比對(duì)與第0 天發(fā)光強(qiáng)度比值，評(píng)估試劑的機(jī)載穩(wěn)定性。

1.2.1.3 交叉反應(yīng)試驗(yàn) 收集臨床病癥與手足口病相似或者病原結(jié)構(gòu)與腸道病毒相近的其他病原體，如：弓形蟲IgM（Tox IgM）、甲流IgM（FluA IgM）、乙流IgM（FluB IgM）、人類副流感病毒IgM（HPIVs IgM）、風(fēng)疹病毒IgM（RV IgM）、嗜肺軍團(tuán)菌IgM（LP IgM）、巨細(xì)胞病毒IgM（CMV IgM）、單純皰疹病毒I 型IgM（HSV-I IgM）、單純皰疹病毒Ⅱ型IgM（HSV-ⅡIgM）、合胞病毒IgM（RSV IgM）、肺炎支原體IgM（MP IgM）、肺炎衣原體IgM（CP IgM）、EB 病毒IgM（EBv IgM）的高濃度特異性抗體血清樣本，使用CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA 進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1.4 方法學(xué)比對(duì) 選擇經(jīng)柯薩奇病毒A16 型IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）檢測(cè)為CA16 IgM 陽性的樣本153 例，以及438 例CA16 IgM 為陰性的健康體檢人群樣本，用CA16 IgM CMIA 進(jìn)行檢測(cè)，獲得相應(yīng)樣本檢測(cè)的相對(duì)發(fā)光值（Relative luminous value，RLU）。對(duì)陽性樣本和陰性樣本檢測(cè)RLU 值進(jìn)行ROC 曲線分析，并計(jì)算與已上市酶免試劑的符合率。

選擇經(jīng)腸道病毒71 型IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）檢測(cè)為EV71 IgM 陽性的樣本154例以及500 例EV71 IgM 為陰性的健康體檢人群樣本，用EV71 IgM CMIA 進(jìn)行檢測(cè)，獲得相應(yīng)樣本檢測(cè)的RLU。對(duì)陽性樣本和陰性樣本檢測(cè)RLU值進(jìn)行ROC 曲線分析，并計(jì)算與已上市酶免試劑的符合率。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用WPS Office Excel 及Prism8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)數(shù)資料以n或%表示；對(duì)樣本檢測(cè)RLU用Prism8 進(jìn)行ROC 曲線繪制。

2 結(jié)果

2.1 試劑精密度

CA16 IgM CMIA 測(cè)定重復(fù)性參考品的批內(nèi)精密度CV 分別為1.10%和1.63%，檢測(cè)強(qiáng)、中、弱陽樣本和陰性樣本的中間精密度CV 為5.70%～7.20%；EV71 IgM CMIA 測(cè)定重復(fù)性參考品的批內(nèi)精密度CV 分別為2.80%和1.59%，檢測(cè)強(qiáng)、中、弱陽樣本和陰性樣本的中間精密度CV 為2.91%～4.49%。見表1、表2。

表1 批內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10）Table 1 Test results of intra-assay precision（n=10）

表2 中間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=40）Table 2 Test results of intermediate precision（n=40）

2.2 試劑機(jī)載穩(wěn)定性

試劑機(jī)載穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示，CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA 的偏差均小于±10%。見表3。

表3 CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA 機(jī)載穩(wěn)定性評(píng)價(jià)（偏差）Table 3 On-board stability evaluation of CA16 IgM CMIA and EV71 IgM CMIA（deviation）

2.3 交叉反應(yīng)試驗(yàn)

Tox IgM、FluA IgM、FluB IgM、HPIVs IgM、RV IgM、LP IgM、CMV IgM、HSV-I IgM、HSV-II IgM、RSV IgM、MP IgM、CP IgM、EBv IgM 的高濃度特異性抗體血清樣本不會(huì)影響CA16 IgM CMIA和EV71 IgM CMIA 的檢測(cè)結(jié)果，不存在交叉反應(yīng)。見表4。

表4 高濃度的其它病原體抗體血清交叉反應(yīng)結(jié)果Table 4 Results of cross reaction with high concentration antibody serum of other pathogens

2.4 方法學(xué)比對(duì)

以柯薩奇病毒A16 IgM 型檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）判定結(jié)果，用CA16 IgM CMIA 對(duì)陽性樣本和陰性樣本檢測(cè)RLU 值進(jìn)行ROC 曲線分析，結(jié)果顯示，陽性符合率為96.1%，陰性符合率為96.6%。見表5。ROC 曲線下面積為0.9908，以RLU為243907 作為Cut-off 值，特異性為96.60%，靈敏度為96.08%。見圖1a。

表5 CA16 IgM CMIA 陰陽符合率Table 5 Positive and negative coincidence rate of CA16 IgM CMIA

以腸道病毒71 型IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）判定結(jié)果，用EV71 IgM CMIA 對(duì)陽性樣本和陰性樣本檢測(cè)RLU 值進(jìn)行ROC 曲線分析，結(jié)果顯示，陽性符合率為100%，陰性符合率為98.5%。見表6。ROC 曲線下面積為0.9993，以RLU 為79533 作為Cut-off 值，特異性為100.00%，靈敏度為98.53%。見圖1。

表6 EV71 IgM CMIA 陰陽符合率Table 6 Positive and negative coincidence rate of EV71 IgM CMIA

圖1 CA16 IgM CMIA 和EV71 IgM CMIA ROC 曲線Figure 1 Receiver operating characteristic curve of CA16 IgM CMIA and EV71 IgM CMIA

3 討論

腸道病毒的早期診斷對(duì)后期疾病的防治工作意義重大。盡早明確患者感染類型對(duì)于手足口病的診斷分型進(jìn)而采取最佳預(yù)防措施至關(guān)重要，其可有效地控制手足口病的傳播及暴發(fā)［9］。目前，主要的診斷方式有RNA 檢測(cè)［10］及IgM 抗體檢測(cè)［9］。相較于價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜的RNA 檢測(cè)，IgM 抗體檢測(cè)價(jià)格低廉，操作簡單，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。目前，腸道病毒EV71 IgM 抗體和CA16 IgM 抗體的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），膠體金免疫層析法（Gold immunochromatographic assay，GICA）和化學(xué)發(fā)光法（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）［7，11-13］。其中，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)操作簡單，檢測(cè)效率高，特異性強(qiáng)、靈敏度好，有助于提高臨床檢測(cè)效率。除此之外，由于手足口病的與大多流感、肺炎以及其他病毒引起的腦膜炎（如單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB 病毒等）病癥接近，從而導(dǎo)致誤診的情況，因此，高特異性無交叉反應(yīng)的檢測(cè)試劑尤為重要，它可有效避免誤診導(dǎo)致的治療延后，提高診治效益。

通過EV71 IgM 和CA16 IgM 的聯(lián)合檢測(cè)有助于手足口病致病原的明確，對(duì)于手足口病患兒的及時(shí)、合理治療、預(yù)后改善有重要的指導(dǎo)意義。本研究基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的柯薩奇病毒A16 型IgM 抗體檢測(cè)試劑盒和腸道病毒71 型IgM 抗體檢測(cè)試劑盒具有良好性能，適應(yīng)于臨床診斷應(yīng)用，將為手足口病的診斷及監(jiān)控治療提供切實(shí)支撐。