地貧核酸檢測國家參考品對單分子測序試劑的適用性評價

于婷 胡澤斌 黃杰 孫楠

地中海貧血（以下簡稱地貧）是指因珠蛋白基因缺陷（包括點突變、缺失等）導(dǎo)致的一種常染色體隱性遺傳?。?-3］，重者以進行性溶血性貧血為主要特征。我國以兩廣地區(qū)、海南等南部沿海地區(qū)發(fā)病率最高［4］。重型地貧目前尚無經(jīng)濟有效的治療方法，因此通過遺傳咨詢與產(chǎn)前篩查技術(shù)是避免重型胎兒出生的最佳措施。截止到2022年7月，已有20 多個地中海貧血基因檢測試劑盒獲得醫(yī)療器械注冊證，檢測原理包括跨越斷裂點PCR（Gap-PCR）等。由于檢測原理及平臺不同，存在漏檢、假陰性及交叉反應(yīng)等風(fēng)險點，中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）在2017年發(fā)布了地中海貧血核酸檢測國家參考品（以下簡稱國家參考品），作為統(tǒng)一尺度評價各類試劑盒的性能。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，第三代測序技術(shù)（即單分子測序）也開始應(yīng)用在地中海貧血基因突變檢測上，部分已開發(fā)成試劑盒。由于國家參考品研制時，只采用了當時已上市試劑盒進行驗證，并不包含三代測序技術(shù)的試劑盒，因此本研究擬開展該套參考品適用范圍的擴展研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象

地中海貧血核酸檢測國家參考品，批號：360014-201701，32 支/套，包含α 缺失和突變、β 缺失和點突變以及正常人樣本，由中檢院研制并提供。

1.2 試劑

地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）、核酸提取或純化試劑、測序反應(yīng)通用試劑盒（杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司）；Qubit dsDNA HS Assay Kit（美國ThermoFisher SCIENTIFIC 公司）；No-Amp Accessory Kit、Sequel II Binding Kit 2.1、SMRT Cell 8M（1-Cell Tray）、Sequel II Sequencing Plate 2.0（1 rxn）（美國Pacific Biosciences 公司）。

1.3 儀器和軟件

Sequel II CNDx 基因測序儀、地中海貧血基因檢測數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司）；Qubit 熒光定量儀Qubit3.0（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；基因擴增儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）試劑盒檢測原理

基于第三代測序技術(shù)平臺的單分子實時DNA測序技術(shù)（Single Molecule Real-Time，SMRT）。針對人全血樣本，通過在各突變位點附近設(shè)計引物，直接對目標區(qū)域進行長片段擴增，在目標DNA 長片段兩端連接接頭，使用消化酶去除非環(huán)狀片段，最終獲得啞鈴狀文庫。試劑盒配套使用基因測序儀Sequel II CNDx，構(gòu)建好的啞鈴狀文庫結(jié)合測序引物和酶，在SMRTCell 的納米小孔（ZMW）中進行單分子測序。測序后的基因序列對比到參考基因序列上，通過生物信息軟件分析，識別攜帶基因突變的DNA 序列，獲得相關(guān)基因突變信息。具體過程見圖1。

圖1 地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）試劑盒檢測原理Figure 1 The detection principle of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing）kit

1.4.2 適用性研究方案

按照α/β-地中海貧血基因分型檢測試劑盒行業(yè)標準（YY/T 1527-2017）［5］及國家參考品說明書要求，確定研究項目為準確性、特異性及檢測限。要求檢測試劑盒范圍內(nèi)的國家陽性參考品，結(jié)果應(yīng)為相應(yīng)基因型別；檢測國家陰性參考品和試劑盒范圍外的國家陽性參考品，結(jié)果應(yīng)為未檢出突變；檢測限濃度要求不高于10 ng/μL，本研究中采用試劑盒聲稱的檢測限濃度（3 ng/μL）進行考察。

1.4.3 文庫構(gòu)建、純化及質(zhì)檢

取國家參考品恢復(fù)至室溫混勻備用，并將試劑盒檢測范圍內(nèi)的國家參考品稀釋至3 ng/μL 混勻備用，即為檢測限參考品。按照試劑盒說明書的操作方法，對國家參考品擴增、接頭連接、消化反應(yīng)構(gòu)建DNA 文庫；完成后，立即使用配套的DNA 純化試劑盒進行兩次純化，并對純化后到的文庫進行質(zhì)檢。采用Qubit 熒光定量儀檢測，滿足以下條件方可進行上機測序：①單個文庫濃度≥3 ng/μL；NTC 文庫濃度≤1 ng/μL；②等質(zhì)量混合后文庫濃度≥3 ng/μL。

1.4.4 上機測序

采用測序反應(yīng)通用試劑盒，按照說明書要求對質(zhì)檢合格的文庫處理后上機。文庫上機濃度180～220 pM，推薦200 pM，文庫片段默認2 535 bp。按照配套儀器Sequel II CNDx 基因測序儀的標準操作規(guī)程上樣，測序模式選擇CCS，測序時長15 h。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析和結(jié)果判定

采用地中海貧血基因檢測數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對下機數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果判定原則為：對于α 缺失型陽性判斷值以5%為閾值，根據(jù)--SEA、-α3.7、-α4.2和--THAI及WT（野生型或非缺失）的比值結(jié)果，判定為缺失型雜合突變、雙雜合突變、純和突變或者野生型；對于α 和β 點突變陽性判斷值，以突變比值≥20%且≤80%，判定為對應(yīng)雜合點突變；突變比值＞80%，判定為對應(yīng)純合點突變；突變比值＜20%時，判定為N，表示未檢出檢測范圍內(nèi)的突變。

2 結(jié)果

2.1 準確性結(jié)果

檢測范圍內(nèi)的國家陽性參考品的檢測結(jié)果均為相應(yīng)突變型別，準確性滿足要求。見表1。

表1 地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）的準確性結(jié)果Table 1 Accuracy results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

2.2 特異性結(jié)果

野生型國家參考品及檢測范圍外的國家陽性參考品的缺失檢測結(jié)果均顯示為αα/αα，點突變檢測結(jié)果均顯示為“N”，特異性滿足要求。見表2。

表2 地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）的特異性結(jié)果Table 2 Specific results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

2.3 檢測限結(jié)果

稀釋至3 ng/μL 的試劑盒檢測范圍內(nèi)的國家陽性參考品檢測結(jié)果均符合預(yù)期，檢測限滿足要求。見表3。

表3 地中海貧血基因檢測試劑盒（單分子測序法）的檢測限結(jié)果Table 3 Detection limit results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

3 討論

地貧以α 和β 型最為常見［6-7］。缺失型α 地貧95%以上是由于α 珠蛋白基因大片段缺失所致。我國最常見的是--SEA、-α3.7 和-α4.2 缺失型突變。最常見的非缺失型α 地貧包括αWS（CD122）、αQS（CD125）等［8-9］。我國β 地貧以突變型為主，主要有IVS-Ⅱ-654、CD41/42 等［10-11］。基因檢測在地貧的防控中不可或缺。目前檢測方法主要有Gap-PCR 法、PCR-反向斑點雜交法、二代測序法等［12］。Gap-PCR 法主要用于缺失型α 地貧診斷［13］，該方法設(shè)備要求低、步驟簡單，但不能診斷點突變或未知的缺失突變。PCR-反向斑點雜交法主要用于點突變檢測，可對未知樣本中多個突變進行篩查，但檢測時間長、操作復(fù)雜、影響因素較多。二代測序技術(shù)具有高通量等優(yōu)點，對于單核苷酸多態(tài)性和小于50 bp 的插入或缺失變異檢測比較準確，但是大的結(jié)構(gòu)變異檢測卻不是很理想。近幾年推出的單分子測序技術(shù)［14-15］，優(yōu)勢在于DNA 無需PCR 擴增，可避免在擴增過程中引入DNA 突變以及對富含AT 和富含GC 序列的偏好性，實現(xiàn)對每一條DNA 的單獨測序。它可產(chǎn)生超長的讀長結(jié)果，具有高度均一性，可獲得許多當前測序平臺無法得到的基因組信息。因此采用單分子測序技術(shù)有利于提高地中海貧血產(chǎn)前篩查的準確性。

為評價基于不同檢測原理的地中海貧血核酸檢測試劑盒的性能，中檢院建立了國家參考品，包含7 種α-突變以及18 種β-突變。本研究中，采用國家參考品對基于PacBio 單分子測序的地中海貧血基因檢測試劑盒進行評價。結(jié)果顯示：無α 缺失的樣本，--SEA、-α3.7、-α4.2和--THAI比值在0～0.88%范圍內(nèi)，遠低于閾值（5%），而野生型樣本的WT 比值均在99%以上。α 缺失的樣本，--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAI中一種或者兩種的比值在42.19%～99.83%范圍內(nèi)，遠高于閾值（5%）；α 或β 點雜合突變樣本，突變比值均在20%～80%范圍內(nèi)，α 或β 點純合突變樣本，突變比值均＞80%，無α 或β 點雜合突變樣本，突變比值均顯示為＜20%。準確性和特異性均符合預(yù)期結(jié)果，閾值設(shè)置合理。當把試劑盒檢測范圍內(nèi)的陽性參考品稀釋至檢測限濃度（3 ng/μL）后進行檢測，結(jié)果亦滿足要求。要指出的是，5 例檢測范圍外的國家陽性參考品，2 例為未設(shè)計相應(yīng)位點探針，故無檢測數(shù)據(jù)輸出，另外3 例雖設(shè)計了位點亦可檢出，但考慮到后期臨床樣本較難獲得，申報醫(yī)療器械注冊證難以獲批，因此在結(jié)果設(shè)置上顯示為野生型，這也是在現(xiàn)有法規(guī)體系下的一種折衷做法。以上結(jié)果表明，基于單分子測序平臺的待評價試劑盒，國家參考品檢測結(jié)果未出現(xiàn)假陽性或假陰性情況。綜上所述，地中海貧血核酸檢測國家參考品，適用于三代測序的地中海貧血檢測試劑盒質(zhì)量評價要求，有利于促進同類試劑盒的標準化工作。