精氨酸支原體榆林株的分離鑒定

張慧瑩，郝婷婷△，劉 剛，王田田，王運航，張雅雅，米耀云，李河林，敬曉棋*

(1.榆林學院 生命科學學院榆林市動物疾病診斷與檢測重點實驗室，陜西 榆林 719000；2.榆林市榆陽區(qū)動物疫病預防控制中心，陜西 榆林 719000；3.榆林學院 陜西省陜北絨山羊工程技術研究中心，陜西 榆林 719000；4.榆林學院 陜北羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 榆林 719000)

支原體肺炎是由多種支原體(Mycoplasmaspp，M.spp)引起人和動物以咳嗽、喘氣、纖維素滲出為特征的急慢性傳染病[1]。其中，綿羊支原體(Mycoplasmaovine，MO)[2]、絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.Capri，Mmc)[3]、山羊支原體山羊亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capricolum，Mcc)、山羊支原體肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.Capripneumoniae，Mccp)[4]的單純或混合感染，可導致綿羊支原體肺炎及山羊傳染性胸膜肺炎[5-6]。

精氨酸支原體(Mycoplasmaarginini，M.arginini)是一種常在微生物，可從人、牛、駱駝、綿羊等多種動物呼吸道組織中分離獲得[7]。精氨酸支原體具有潛在的致病能力，當環(huán)境驟變、機體抵抗力降低時，可引起牛呼吸道感染，若與其他病原混合感染并侵入肺部，可導致肺部病變[7-8]。國內(nèi)有文獻報道，從山羊鼻拭子中分離到一株精氨酸支原體[9]，但目前未見從綿羊中分離到精氨酸支原體的報道。湖羊是我國優(yōu)良的肉用綿羊品種，2019年以來，榆林市引入大量湖羊并進行規(guī)?；犸曫B(yǎng)殖。由于北方氣候寒冷，圈舍密閉保溫使空氣質(zhì)量下降，導致湖羊呼吸道疾病頻發(fā)?；疾⊙蚺R床表現(xiàn)為劇烈咳嗽、流鼻，體溫升高至40 ℃以上，多種抗生素治療無明顯效果，且多數(shù)于發(fā)病5～7 d后死亡。為了更好的預防和控制該病，減少死亡和經(jīng)濟損失，本研究從臨床早期急性發(fā)病病例中采集樣品進行了病原的分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 陜西省榆林市某湖羊場26日齡的發(fā)病羔羊，未用任何藥物進行治療。

1.1.2 試劑 PPLO培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，特級馬血清Solarbio公司產(chǎn)品(cat：S9050)，青霉素G鈉購自山東齊魯制藥有限公司；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit，cat：DP304)、細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit：DP302)均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；PCR premix為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品；引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病例樣本觀察及剖解 在了解羊群發(fā)病和用藥治療情況的基礎上，選擇未用藥的患病羔羊，觀察其臨床癥狀剖檢后，無菌采集典型病變組織樣品。

1.2.2 病原菌的初步鑒定 無菌剪取部分病料，涂片，革蘭氏染色鏡檢觀察。另取3 mm3病變組織置于含有0.5 mL生理鹽水的1.5 mL EP管中，用研磨棒擠壓、研磨，離心取上清，按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，并以其此為模板進行PCR檢測，反應體系為premix 10.0 μL、支原體目16s RNA基因引物Myco、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，S.pneumoniae)(表1)上下游各1.0 μL、模板DNA 5.0 μL、ddHO22.0 μL的PCR體系，擴增程序為95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(35個循環(huán))，72 ℃延伸10 min。PCR后用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

表1 引物信息

1.2.3 病原分離培養(yǎng) 無菌采集肺臟病健結合處、眼觀無明顯變化的組織，研磨、離心后取上清接種于含10%馬血清、80萬IU/L 青霉素的液體PPLO培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，若培養(yǎng)基未見混濁則繼續(xù)培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)5 d時顏色變淡的培養(yǎng)物標記為P1代，將其用φ0.45 μm濾器過濾并再次接種PPLO液體連續(xù)傳代，每代培養(yǎng)物均進行革蘭氏染色、油鏡觀察。同時將P3代培養(yǎng)物接種于含20%馬血清、80萬IU/L 青霉素的固體PPLO培養(yǎng)基上，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，5～7 d時在體視顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.2.4 分離株種屬鑒定 取第3代液體培養(yǎng)物3 mL，3 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀物用細菌基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，分別用M.spp、MO、Mcc、Mccp、Mmc、M.arginine等6個支原體引物(表1)進行PCR擴增，反應體系和程序同1.2.2。

1.2.5 分離株的遺傳進化分析 將上述PCR擴增產(chǎn)物膠回收后送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，測序結果在NCBI進行序列比對，并通過DNASTAR 11的MegAlign進行進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 病羊臨床癥狀及剖檢結果

羊場統(tǒng)計記錄顯示，該場湖羊發(fā)病率為26.56%，羔羊發(fā)病率較高，臨床主要表現(xiàn)為咳嗽、流濃稠鼻液、呈典型腹式呼吸等。使用氟苯尼考、頭孢噻呋鈉等治療，無明顯效果，且發(fā)病羊在治療7 d內(nèi)死亡。剖解結果顯示，肺組織部分為正常粉紅色，部分組織暗紅色、肉樣變且覆蓋大量纖維素性滲出物。

2.2 病原的初步鑒定

病料涂片革蘭氏染色后鏡檢，未觀察到典型細菌。肺組織病原核酸檢測結果顯示，支原體目擴增出275 bp的條帶，與預期一致，而其余病原菌無特異性擴增條帶(圖1)。

圖1 肺組織樣品PCR檢測

2.3 分離培養(yǎng)結果

每代液體培養(yǎng)物抹片革蘭氏染色觀察，菌體均為粉紅色，形態(tài)不一，呈桿狀、球狀、短絲狀或長絲狀(圖2)。第3代分離培養(yǎng)物PPLO固體培養(yǎng)上培養(yǎng)7 d后，形成大量圓形菌落，體視顯微鏡下觀察可見菌落形態(tài)為典型的煎蛋樣，中央乳頭狀突起(圖3)。

圖2 培養(yǎng)物革蘭氏染色(1000×)

圖3 菌落形態(tài)(10×)

2.4 分離株種屬鑒定結果

以第3代培養(yǎng)物基因組DNA為模板進行PCR擴增，電泳結果表明，M.spp和M.arginine引物分別擴增出275 bp和546 bp的特異性條帶，與預期大小一致，而MO、Mcc、Mccp、Mmc未見預期特異性擴增條帶。

2.5 分離株測序結果及遺傳進化分析

將測序結果在NCBI進行序列比對結果顯示，與NCBI中已公布的U15794.1、HQ661827.1、NR_041743.1、GQ409971.1、JN935883.1、MN564911.1等20多株精氨酸支原體16S RNA序列相似性為100%(圖4)，說明其為精氨酸支原體，命名為精氨酸支原體榆林株(M.arg YL strain)。遺傳進化分析結果表明，分離株與其他精氨酸支原體均處于同一分支，親緣關系最近，其次與MO Y98(NR_025989.1)較近，而與Mcc ATCC27343(NR_036952.1)、MCCP(NR_037061.1)、Mmc(NR_044772.1)親緣關系最遠(圖5)。

圖4 支原體榆林分離株種屬鑒定

圖5 精氨酸支原體榆林株(M.arg YL)系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

羊支原體肺炎是由多種支原體(Mycoplasmaspp)引起的以咳嗽、喘氣、纖維素滲出為特征的急、慢性傳染病[5]，影響羊的健康并導致嚴重的經(jīng)濟損失[1]。本研究中，發(fā)病羊場為存欄3萬頭的規(guī)?；驁?，場內(nèi)不同年齡羊只均有發(fā)病，臨床表現(xiàn)為間歇咳嗽、喘氣，臨床診斷為肺炎。對患病嚴重的病例采用氟苯尼考、頭孢噻呋鈉等抗生素治療無明顯效果，多數(shù)于發(fā)病5～7 d內(nèi)死亡。因發(fā)病時間長、常規(guī)治療群體癥狀無明顯改變，結合發(fā)病羔羊病理剖檢特征，推測該場湖羊肺炎可能是由支原體感染引起。為了確定其感染病原，先對未使用藥物治療的湖羊羔羊病料進行了常規(guī)抹片革蘭氏染色鏡檢，進而利用本實驗室設計的支原體目16s RNA、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌引物對肺組織病料核酸進行PCR擴增，電泳結果出現(xiàn)275 bp條帶，與設計的支原體目16s RNA目標片段大小一致，而利用其它2種病原引物未擴增出目的條帶，結果初確定患病羔羊肺炎是由支原體感染引起。

病原的分離鑒定是傳染病診斷的黃金標準[10]，因此本研究對病變肺組織進行了常規(guī)的支原體分離培養(yǎng)，病原分離結果顯示，經(jīng)過3次傳代的培養(yǎng)物革蘭氏染色后，菌體為粉紅色，形態(tài)不一，成桿狀、球狀、短絲狀及長絲狀，與支原體典型的多形性特征一致[11]。分離物接種于PPLO固體培養(yǎng)物上，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)7 d，觀察到大量圓形菌落，體視顯微鏡下可見菌落中央乳頭狀突起，呈典型的煎蛋樣形態(tài)[12]。因此，結合病羊癥狀、病理變化、分離培養(yǎng)物菌體特征及菌落形態(tài)可初步確定成功分離到了引起該場湖羊肺炎的病原為支原體。

盡管MO、Mmc、Mcc、MCCP等是引起綿羊支原體肺炎的主要病原，然而通過對10年的綿羊肺炎病原回溯檢測顯示，M.arginini也能夠?qū)е聡乐鼐d羊肺炎[13]，僅根據(jù)臨床癥狀難以確定病原的種屬。因此，本研究用M.spp、M.arginini、Mmc、Mcc、Mccp和MO的特異性引物對分離培養(yǎng)物進行了PCR鑒定，結果顯示Mycoplasmaspp引物擴增出275 bp的目的片的同時，M.arginini引物也擴增出了546 bp的目的片段，而其他4種均沒有目的產(chǎn)物。M.arginini的PCR產(chǎn)物測序后在NCBI中比對顯示，該序列與Genebank中精氨酸支原體序列一致性為100%。因此，從PCR擴增和產(chǎn)物測序結果可以確定分離物為精氨酸支原體。

精氨酸支原體是多種動物呼吸道的常在微生物，有報道牛支原體肺炎(M.bovis)有17%的情況能夠分離到精氨酸支原體，但不能確定是不是牛肺炎的關鍵病原[14]。然而，可以確定的是精氨酸支原體能夠引起駱駝肺炎且能夠傳染人，具有較強的毒力和耐藥性[15]。早在1985年Jones等[16-17]就報道了精氨酸支原體感染綿羊及其對綿羊組織器官的致病性。近來的研究多認為精氨酸支原體與溶血曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，M.haemolytica)、多殺性巴士桿菌(Pasteurellamultocida，P.multocida)混合感染時表現(xiàn)出較強的致病性[13]，然而本研究中未分離到其他可疑的致病菌。限于時間和條件，本研究未進行病原致病性試驗，但結合臨床癥狀、病理解剖以及分離鑒定結果，可確定此次湖羊場發(fā)病是由于精氨酸支原體感染所致。

4 結 論

本研究結果表明，精氨酸支原體為該羊場湖羊肺炎的病原，結果將為榆林市湖羊肺炎的防控和治療提供病原學基礎。