血清TSP-2對(duì)非酒精性脂肪性肝病和肝纖維化診斷的價(jià)值

何秀麗，萬 瑩，林 潔

(武漢市第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖北 武漢 430000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是全球日益嚴(yán)重的一個(gè)健康問題[1]。以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要特征，排除其他肝臟疾病(例如病毒性肝炎及自身免疫性肝炎)、大量飲用酒精、服用致脂肪變的藥物(例如胺碘酮、甲氨蝶呤或異煙肼)，以及遺傳性疾病等[2]。NAFLD發(fā)病原因復(fù)雜，根據(jù)“多重打擊”假說，熱量攝入過多和運(yùn)動(dòng)不足而導(dǎo)致的能量不平衡增加了胰島素抵抗，這是基因易感性方面誘發(fā)的一個(gè)“關(guān)鍵性打擊”，其次，進(jìn)一步的“打擊”包括脂肪組織分泌的激素、營養(yǎng)因子、腸道微生物群以及遺傳和表觀遺傳因素的影響，促使脂肪變性發(fā)展為NAFLD，甚至更嚴(yán)重的肝纖維化進(jìn)展[3]。基于NAFLD發(fā)病機(jī)制的“多重打擊”假說，尋找潛在的生物標(biāo)志物，對(duì)于臨床診斷和治療具有重要的實(shí)際意義。血小板反應(yīng)蛋白(TSP)是一種具有多結(jié)構(gòu)域的分泌型多細(xì)胞鈣結(jié)合糖蛋白，屬于血小板反應(yīng)蛋白家族成員，可與多種細(xì)胞因子、生長因子、受體和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用[3]。既往研究表明TSP-2不僅有抗血管生成的作用，還與膠原纖維生成相關(guān)[4-5]。因此本研究旨在分析血清TSP-2水平與NAFLD及其肝纖維化程度的相關(guān)性，從而為NAFLD精準(zhǔn)醫(yī)療提供候選生物標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 本項(xiàng)前瞻性、橫斷面研究由當(dāng)?shù)蒯t(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在遵循《赫爾辛基宣言》的前提下進(jìn)行。2018年3月至2021年4月，在我院肝膽外科共招募96例NAFLD患者，男54例，女42例，平均年齡(52.99±13.48)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均依據(jù)腹部超聲檢查結(jié)果進(jìn)行診斷，沒有酗酒史(酒精攝入量男性<140 g/周，女性<70 g/周)，并且經(jīng)過綜合檢查排除了其他引起肝臟疾病的原因(病毒性肝炎、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病、肝豆?fàn)詈俗冃?、酒精性肝炎、威爾遜氏病、遺傳性血色素沉著癥和Citrin缺陷病)，符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[6]；(2)所有患者有完整的肝臟超聲記錄和肝臟瞬時(shí)彈性硬度檢查報(bào)告，必要時(shí)，患者會(huì)進(jìn)行肝臟活檢以作組織學(xué)診斷；(3)獲得所有參與者的書面同意。排除肝功能不全、患有全身性炎癥(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和炎癥性腸病)、接受免疫抑制治療的患者。最終納入的患者臨床狀況都很穩(wěn)定，收集的數(shù)據(jù)包括身高、體重、腰圍、肝腎功能參數(shù)以及全血細(xì)胞計(jì)數(shù)等。記錄所有患者的人口統(tǒng)計(jì)資料及合并病(如糖尿病、高血壓、高脂血癥或有心血管疾病史)。此外收集100例在我院進(jìn)行健康體格檢查的志愿者的血清樣本，作為對(duì)照組，平均年齡(53.21±15.49)歲、性別構(gòu)成(男50例，女50例)與NAFLD組患者一致(P>0.05)，酒精攝入量男性<140 g/周，女性<70 g/周；在血清采集前也獲得樣本使用的知情同意書。

1.2 血清TSP-2水平檢測 所有患者均于肝組織活檢前采集肘靜脈血，血液樣本收集于BD SST II Advance血清分離管(BD Vacutainer Systems，美國)中。凝血30 min后，于25℃環(huán)境下，2 000 r/min離心10 min，分離上清液血清，儲(chǔ)存于-80℃環(huán)境中，待進(jìn)一步分析。血清使用微量滴定板孵育，室溫下使用捕獲抗體處理1 h。洗板后在室溫下與特異性抗體孵育0.5 h，再洗板，然后將二抗加入滴定板，用終止液終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀(BioRad，加拿大)記錄450 nm處的吸光度。詳細(xì)方案根據(jù)制造商說明書操作。

1.3 其他實(shí)驗(yàn)室檢查 使用羅氏Cobas 8000型全自動(dòng)生化分析儀及配套的原裝試劑檢測血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽紅素(TBIL)、血清肌酐(sCr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、C反應(yīng)蛋白(CRP)等，另外使用SysmexXN-9000多功能全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測血小板計(jì)數(shù)(PLT)等，計(jì)算AST/PLT指數(shù)(APRI)和FIB-4指數(shù)[公式：(年齡×AST)/(PLT×ALT2)]。

1.4 Fibroscan檢查 瞬時(shí)彈性成像使用Fibroscan?502 Touch(Echosens，法國)進(jìn)行，由經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員使用標(biāo)準(zhǔn)化的操作進(jìn)行所有的瞬時(shí)彈性成像檢查?；颊呷⊙雠P位，右臂最大外展，通過肋間間隙測量右肝葉。所有檢測都是從M探針開始，只有在設(shè)備的自動(dòng)探針選擇工具提示下才會(huì)過渡到XL探針。同一個(gè)患者由同一檢查人員重復(fù)進(jìn)行瞬時(shí)彈性成像檢查。采用2次瞬時(shí)彈性成像檢驗(yàn)的平均值。本分析中使用的肝臟硬度值(LSM)是通過兩次檢驗(yàn)獲得的中位數(shù)的平均值。肝纖維化分期為：F0～F1期(無或輕度纖維化,<7 kPa)、F2期(中度纖維化，7～8.99 kPa)、F3期(嚴(yán)重纖維化，9～12.49 kPa)和F4期(肝硬化，≥12.5 kPa)[7]。將F0～F2期的患者作為輕中度組，F(xiàn)3～F4期作為重度組。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者血清TSP-2水平比較 經(jīng)ELISA分析，與健康對(duì)照組相比，NAFLD組患者血清TSP-2水平顯著升高[48.39(30.15，86.28)ng/mLvs32.37(22.47，66.84)ng/mL，Z=7.321，P<0.001]。經(jīng)ROC曲線分析，血清TSP-2水平診斷NAFLD的AUC為 0.784(95%CI：0.716～0.851)，見圖1。

圖1 血清TSP2水平診斷NAFLD的ROC曲線

2.2 NAFLD患者肝纖維化程度與臨床特征的關(guān)系 根據(jù)Fibroscan結(jié)果，將本研究共有68例F0～F2期患者，共有28例F3～F4期患者。經(jīng)分析，F(xiàn)3～F4期患者的年齡、男性比例、糖尿病及家族性糖尿病例數(shù)、血清TSP-2水平、APRI、FIB-4均顯著高于F0～F2期患者(P<0.05，見表1)。

表1 NASFLD患者肝纖維化程度與臨床特征的關(guān)系

(續(xù)表)

2.3 NAFLD組患者血清TSP-2水平與AST、ALT、APRI、FIB-4指數(shù)的關(guān)系 經(jīng)Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析，NAFLD組患者血清TSP-2水平與AST(rs=0.240，P=0.042)、ALT(rs=0.276，P=0.030)、APRI(rs=0.306，P=0.021)、FIB-4指數(shù)(rs=0.667，P<0.001)均呈正相關(guān)性(見圖2)，進(jìn)一步校正年齡、性別等混在參數(shù)后，經(jīng)多元線性回歸分析，血清TSP-2水平與FIB-4指數(shù)(β=0.006，95%CI：0.003～0.010，P<0.001)仍呈正相關(guān)性。

2.4 NAFLD組患者血清TSP-2水平與Fibroscan結(jié)果的關(guān)系 經(jīng)Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析，NAFLD組患者血清TSP-2水平與Fibroscan結(jié)果呈正相關(guān)性(rs=0.331，P<0.001，見圖3)。進(jìn)一步校正年齡、性別、合并癥史、家族性糖尿病史造成的偏倚，經(jīng)多元線性回歸方程校正上述混雜因素后，血清TSP-2仍然是影響NAFLD患者Fibroscan肝纖維化結(jié)果的獨(dú)立因子(非標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)=0.004，t=1.801，95%置信區(qū)間=0.002～0.008，P=0.007)。

圖3 NAFLD患者血清TSP-2水平與Fibroscan結(jié)果的Spearman分析

2.5 ROC曲線分析血清TSP-2水平用于診斷F3～F4期肝纖維化患者的臨床價(jià)值 經(jīng)ROC曲線分析，血清TSP-2水平分別聯(lián)合APRI及FIB-4診斷F3～F4期肝纖維化NAFLD患者的AUC值分別為0.754(95%CI：0.649～0.859)、0.743(95%CI：0.631～0.855)，均優(yōu)于它們單獨(dú)預(yù)測(Z=-2.719，-3.018，P<0.05，見表2、圖4)。

圖4 APRI、FIB-4、血清TSP-2水平診斷NAFLD患者重度肝纖維化的ROC曲線

表2 APRI、FIB-4、血清TSP-2水平診斷NAFLD患者重度肝纖維化的ROC曲線分析

3 討論

NAFLD的特征是肝臟內(nèi)脂肪過度積累(≥5%)，與酒精攝入和病毒感染無關(guān)。NAFLD發(fā)生過程十分復(fù)雜，但是已確定與肝細(xì)胞損傷、炎癥和纖維化的過程緊密相連[8-10]。因此，“纖維化的生物標(biāo)記物”通常能夠反映這一病理進(jìn)程[11]。臨床診斷NASH主要依靠癥狀、肝臟影像學(xué)檢查等綜合判斷，但價(jià)值有限。而本研究結(jié)果證實(shí)，血清TSP-2可以作為NAFLD以及中晚期肝纖維化的生物標(biāo)志物。

TSP家族由5個(gè)亞型組成，根據(jù)分子n端1型重復(fù)結(jié)構(gòu)域的存在(A組)或缺失(B組)，可分為A組(TSP-1、TSP-2)和B組(TSP-3、TSP-4、TSP-5)。TSP-2為A組TSP，在結(jié)構(gòu)上與TSP-1非常相似，某些功能也與TSP-1類似，如抑制血管生成、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、參與整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路等。然而，TSP-1和TSP-2有一些關(guān)鍵的區(qū)別。TSP-1和TSP-2均由血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌，TSP-1儲(chǔ)存在血小板α顆粒中，并在動(dòng)脈損傷后大量釋放，而TSP-2的釋放相關(guān)緩慢且穩(wěn)定，血管平滑肌細(xì)胞中TSP-2的釋放在損傷后3d才檢測到，并在損傷后10d時(shí)達(dá)到峰值。因此TSP-1可能更像急性期的反應(yīng)物，而TSP-2可能在損傷后的炎癥和重塑期更重要[12-13]。大量研究表明TSP-2 可能參與調(diào)節(jié)血管生成、增殖、細(xì)胞凋亡、腫瘤遷移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β激活[14-16]。既往眾多研究證實(shí)，APRI、FIB-4指數(shù)對(duì)于肝纖維化的診斷及嚴(yán)重程度有良好的評(píng)估效能，但易受用藥因素影響[17-18]，在本研究中，NAFLD患者血清TSP-2水平與AST、ALT、APRI、FIB-4均呈正相關(guān)，尤其是與APRI、FIB-4指數(shù)在校正年齡、性別等混雜因素后仍然有關(guān)，表明TSP-2與NAFLD的疾病進(jìn)展及肝纖維化程度相關(guān)。雖然ALT和AST異常與NAFLD的存在和嚴(yán)重程度無關(guān)，但定量相關(guān)性仍然有一定的價(jià)值，因?yàn)樗梢越沂靖螕p傷趨勢和關(guān)聯(lián)，以便進(jìn)一步調(diào)查。

早有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[4]發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，在心肌細(xì)胞移植2周后TSP-2敲除小鼠纖維化面積減少了4.5倍，移植物周圍瘢痕囊厚度減少了7倍，證實(shí)TSP-2在心肌細(xì)胞移植后的促纖維化及抑制血管生成作用；Kunkemoeller等[19]發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠和糖尿病患者皮膚組織中TSP-2表達(dá)升高，盡管TSP-2缺陷小鼠與糖尿病對(duì)照組小鼠相比出現(xiàn)了肥胖和高血糖，但它們的愈合顯著得到改善，其特征是加速再上皮化及肉芽組織形成、成纖維細(xì)胞遷移及血管成熟。同時(shí)證實(shí)高血糖增加了成纖維細(xì)胞中TSP-2的表達(dá)，而成纖維細(xì)胞是創(chuàng)傷后TSP2的主要細(xì)胞來源；TSP在骨折愈傷組織中其發(fā)揮重要作用，在早期骨折愈傷組織的未分化區(qū)域可觀察到類似的TSP-2表達(dá)細(xì)胞群，以及在愈傷組織形成后期也可觀察到TSP-2表達(dá)集中在愈傷組織外圍[20]。本研究經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清TSP-2水平的升高與肝纖維化程度增加相關(guān)，這與Kozumi等[18]的研究結(jié)論相符，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，血清TSP-2水平聯(lián)合APRI或FIB-4且均具有良好診斷肝纖維化程度的效能。

綜上所述，NAFLD患者血清TSP-2水平與Fibroscan檢測結(jié)果呈正相關(guān)性，雖然還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證，但是TSP-2結(jié)合APRI、FIB-4，可以潛在地作為NAFLD肝纖維化進(jìn)展的候選標(biāo)志物，從而為臨床上是否有必要進(jìn)行肝活檢提供一定的信息參考。然而，本研究也存在一定的不足：首先本研究為單中心隊(duì)列研究，并沒有分析TSP-2在NAFLD疾病進(jìn)展中的作用；其次，本研究僅單次分析患者活檢前的血清TSP-2水平，未對(duì)血清TSP-2水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測、分析。后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步對(duì)血清TSP-2水平進(jìn)行分析，來最終確定使用TSP2作為NAFLD生物標(biāo)志物的真正臨床有效性和成本效益。