Cx43在老年性聾小鼠耳蝸中的表達(dá)及意義

黃興玉，饒 澄，蘇琳凌，李 歡，王世飛

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科，貴州 遵義 563099)

老年性聾(Presbycusis)是隨著年齡增長(zhǎng)而出現(xiàn)聽(tīng)力逐漸減退的現(xiàn)象，多表現(xiàn)為雙耳聽(tīng)力的對(duì)稱(chēng)性感音神經(jīng)性高頻下降[1-2]。在中國(guó)，該病是第二大嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量的非致病性疾病。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)老年性聾的發(fā)生機(jī)制及病理生理學(xué)特征進(jìn)行研究，認(rèn)為老年性聾患者言語(yǔ)識(shí)別率降低可能與耳蝸帶狀突觸病變有關(guān)，耳蝸帶狀突觸病變主要影響內(nèi)毛細(xì)胞(Inner hair cell，IHC)間聯(lián)系，降低神經(jīng)纖維自發(fā)放電率，受影響神經(jīng)細(xì)胞功能障礙造成嘈雜環(huán)境中言語(yǔ)識(shí)別率降低[3]。人類(lèi)顳骨標(biāo)本解剖學(xué)研究示隨年齡增長(zhǎng)，每IHC突觸比由約13.3降至2.0[4]。同時(shí)，有研究證明，確定內(nèi)毛細(xì)胞-突觸功能障礙是老年性耳聾患者言語(yǔ)識(shí)別率驟降的主因[5]。Liu對(duì)大鼠出生后耳蝸發(fā)育過(guò)程中連接蛋白43(Connexin 43，Cx43)的表達(dá)模式進(jìn)行分析，認(rèn)為Cx43可能是耳蝸帶狀突觸功能正常發(fā)揮的關(guān)鍵[6]，近年來(lái)，有個(gè)別報(bào)道在老年性聾鼠模型中檢測(cè)到了Cx43蛋白的表達(dá)降低[7]，說(shuō)明Cx43與老年性聾可能有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平檢測(cè)Cx43蛋白的表達(dá)，觀察小鼠耳蝸帶狀突觸的變化，研究Cx43蛋白表達(dá)變化與耳蝸帶狀突觸老化之間的關(guān)系，進(jìn)而探討二者在老年性聾發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選C57BL/6J 雄性小鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)前檢查外耳道，排除中耳炎及其他外耳道異常。選取16月齡C57BL/6J雄性小鼠作6只為老年組。將12只3月齡C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)均分為兩組，D-gal擬老年性聾模型鼠組采用經(jīng)典D-gal衰老模型制造方法，每天頸背皮下注射5% D-gal 500 mg/kg，注射時(shí)長(zhǎng)為8周，對(duì)照組每天頸背皮下注射等體積生理鹽水，注射時(shí)長(zhǎng)為8周。小鼠被安置在可自由進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，進(jìn)食、水的可控馴化環(huán)境條件下。本研究已獲遵義醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。(倫理審查編號(hào)：KLLY(A)-2021-131)。

1.2 主要儀器 酶標(biāo)儀(Rayto，美國(guó))；垂直蛋白電泳裝置(天能公司，中國(guó))；凝膠成像儀(Vilber公司，法國(guó))；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(HITACHI，日本)。

1.3 主要試劑 電泳液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、梯度酒精、2%四氧化鋨溶液、2.5%戊二醛溶液、Bicin Choninic Acid蛋白定量試劑盒(碧云天公司，中國(guó))；兔抗鼠Cx43/GJA1多克隆抗體(abcam公司)；SDS-PAGE凝膠(碧云天公司，中國(guó))；Mouse GJA1 / CX43 / Connexin 43 (Sandwich ELISA) ELISA Kit(LSBio，美國(guó))；蛋白裂解液(碧云天公司，中國(guó))；單寧酸,HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(三鷹生物技術(shù)有限公司，中國(guó))。

1.4 D-gal老年聾模型鼠的構(gòu)建 選用耳廓反應(yīng)靈敏，鼓膜完整，ABR閾值在正常聽(tīng)力級(jí)的健康雄性3月齡C57BL/6小鼠造模。為檢驗(yàn)D-gal造模是否成功，本實(shí)驗(yàn)采取測(cè)量造模前后聽(tīng)覺(jué)腦干電位(Auditory brainstem responses,ABR)以驗(yàn)證造模效果。

1.5 小鼠聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試 在聲電屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，并保持周?chē)h(huán)境安靜。小鼠采用戊巴比妥鈉聯(lián)合鹽酸西拉嗪進(jìn)行麻醉。麻醉滿意后開(kāi)始測(cè)試ABR閾值，純音給聲(持續(xù)時(shí)間5 ms，21次/s)，測(cè)試頻率為4，8，16，24、32 kHz，聲強(qiáng)區(qū)間為20～90 dB SPL，ABR記錄并做1 024次平均，閾值由ABR Ⅰ，Ⅲ和Ⅴ波變化情況綜合確定。

1.6 耳蝸標(biāo)本采集 取各組小鼠，全麻后( 2% 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為 50 mg/kg)在顯微鏡下，將小鼠固定于腦立體定位儀,斷頭處死動(dòng)物，相應(yīng)組依次取出聽(tīng)泡后，去除多余組織，打開(kāi)聽(tīng)泡，將耳蝸進(jìn)行分離，采集標(biāo)本后，用4 ℃生理鹽水洗凈耳蝸樣本，并將樣本(耳蝸) 置入-80 ℃冰箱中進(jìn)行保存。

1.7 掃描電鏡觀察 各組各取兩個(gè)聽(tīng)泡，暴露耳蝸，顯微鏡下刺破蝸?lái)敽蛨A窗膜，置于2.5%戊二醛中充分固定48 h，在2.5%戊二醛溶液中剝除耳蝸骨質(zhì)、血管紋、支持韌帶、前庭膜及蓋膜，剪取基底膜，置于2.5%戊二醛中繼續(xù)固定，隨后置于2%四氧化鋨溶液及單寧酸溶液中繼續(xù)固定和增加導(dǎo)電性，梯度酒精脫水，干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

1.8 Western blot法測(cè)定耳蝸Cx43蛋白表達(dá)水平 收集各組小鼠基底膜置于EP管中剪碎，加入蛋白裂解液充分裂解，離心后取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度后加緩沖液，煮沸變性，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后依次孵化β-actin一抗、Cx43一抗(1∶100 0)、二抗(1∶200 00)，濾紙瀝吸干，滴ECL發(fā)光液，凝膠成像儀拍照。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Elisa)法測(cè)定耳蝸Cx43蛋白表達(dá)水平 收集各組小鼠基底膜置于EP管中剪碎，加入蛋白裂解液充分裂解，離心后取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度后常規(guī)處理，取上清液待測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)品溶液于待測(cè)樣品按1∶1至1∶32梯度稀釋。37 ℃溫育90 min。待測(cè)，加入100 μL1x Biotinylated Detection Antibody，孵育，清洗。最后1次洗滌后，抽吸以除去任何剩余的洗滌緩沖液，加入100 μL 1x HRP辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，孵育，清洗5次。加入TMB底物溶液，孵育，避光檢測(cè)至最佳顯色效果。加停止反應(yīng)液，用450 nm酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的光密度(OD值)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料比較用單因素方差分析，有差異者進(jìn)一步采用LSD行兩兩比較，耳蝸組織中Cx43蛋白表達(dá)、耳蝸帶狀突觸寬度以及ABR閾值的相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR閾值 對(duì)3組小鼠聽(tīng)覺(jué)腦干電位ABR 閾值進(jìn)行比較(見(jiàn)圖1、2)。與對(duì)照組的正常范圍的聽(tīng)覺(jué)腦干電位ABR閾值相比，老年組和D-gal組小鼠的聽(tīng)覺(jué)腦干電位ABR閾值明顯升高(P<0.05)。老年組和D-gal組小鼠之間比較的聽(tīng)覺(jué)腦干電位ABR閾值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 3組小鼠聽(tīng)覺(jué)腦干電位 ABR 閾值

**：與對(duì)照組相比，P<0.01，n=6。圖2 3組小鼠聽(tīng)覺(jué)腦干電位ABR閾值均值

2.2 耳蝸帶狀突觸掃描電鏡觀察 通過(guò)電鏡觀察小鼠耳蝸帶狀突觸，相較于對(duì)照組，老年組和D-gal組耳蝸帶狀突觸寬度明顯縮小(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

A：對(duì)照組小鼠耳蝸帶狀突觸電鏡圖；B：老年組小鼠耳蝸帶狀突觸電鏡圖；C：D-gal 組小鼠耳蝸帶狀突觸電鏡圖；D：小鼠耳蝸帶狀突觸寬度；**、***:與對(duì)照組相比，P<0.01，P<0.001，n=3。圖3 小鼠耳蝸帶狀突觸掃描電鏡

2.3 耳蝸Cx43蛋白表達(dá) 通過(guò)WB對(duì)3組小鼠耳蝸Cx43蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)(見(jiàn)圖4)。相較于對(duì)照組，老年組和D-gal組小鼠的耳蝸Cx43蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而老年組和D-gal組小鼠耳蝸Cx43蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

*：與對(duì)照組相比，P<0.05，n=3。圖4 WB檢測(cè)3組小鼠耳蝸Cx43蛋白表達(dá)

通過(guò)Elisa對(duì)3組小鼠耳蝸Cx43蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)(見(jiàn)圖5)。相較于對(duì)照組，老年組和D-gal組小鼠的耳蝸Cx43蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而老年組和D-gal組小鼠耳蝸Cx43蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

***：與對(duì)照組相比，P<0.001，n=6。圖5 Elisa檢測(cè)3組小鼠耳蝸Cx43蛋白表達(dá)

2.4 Cx43蛋白表達(dá)與ABR閾值 3組小鼠的耳蝸Cx43蛋白表達(dá)與聽(tīng)覺(jué)腦干電位ABR閾值之間具有相關(guān)性(r=0.74,P<0.001)，在老年聾小鼠及D-gal模型鼠中，與對(duì)照組相比，Cx43蛋白表達(dá)降低，ABR閾值升高(見(jiàn)圖6)。

圖6 耳蝸Cx43蛋白表達(dá)與聽(tīng)覺(jué)腦干電位ABR閾值的相關(guān)性分析

2.5 Cx43蛋白表達(dá)與耳蝸帶狀突觸寬度 3組小鼠的耳蝸Cx43蛋白表達(dá)與耳蝸帶狀突觸寬度之間具有相關(guān)性(r=0.83,P<0.001)，在老年聾小鼠及D-gal模型鼠中，和對(duì)照組相比，Cx43蛋白表達(dá)降低，帶狀突觸寬度降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖7)。

圖7 耳蝸Cx43蛋白表達(dá)與耳蝸帶狀突觸寬度的相關(guān)性分析

3 討論

隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，老年性聾的發(fā)病率呈逐年急劇增漲趨勢(shì)，需予以高度重視[8]，目前，關(guān)于老年性聾的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確，主要有以下研究假說(shuō)：胞間交流障礙、血供障礙、炎癥因子風(fēng)暴以及神經(jīng)-突觸結(jié)構(gòu)異常等[9-11]。既往研究認(rèn)為耳蝸微循環(huán)障礙是老年性聾發(fā)病的主要機(jī)理，但其無(wú)法解釋為何部分耳蝸血供正常的患者卻發(fā)生了老年性聾。

而最新國(guó)內(nèi)外研究提示，耳蝸帶狀突觸結(jié)構(gòu)老化可能是老年性聾發(fā)病的更關(guān)鍵因素[12]。帶狀突觸(Ribbonsynapse，RS)是聲音信號(hào)傳遞至中樞所經(jīng)過(guò)的最起始的突觸結(jié)構(gòu)，也是信息傳導(dǎo)以及釋放的關(guān)鍵位點(diǎn)，可使聲音信號(hào)能夠瞬時(shí)、高保真并持續(xù)性的從內(nèi)毛細(xì)胞(Inner hair cell，IHC)傳入相連接的聽(tīng)覺(jué)纖維，耳蝸毛細(xì)胞將聲音刺激轉(zhuǎn)換為生物電信號(hào)，對(duì)聲音的編碼以及聽(tīng)力的維持擁有著無(wú)法替代的作用[13-15]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠逐漸衰老，帶狀突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及數(shù)量都將發(fā)生改變，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)不同程度的感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失[16-17]。 本研究中，老年組和D-gal組的腦干電位ABR閾值較正常組明顯升高，而耳蝸帶狀突觸寬度則明顯縮小，說(shuō)明隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，帶狀突觸也開(kāi)始逐漸老化，聽(tīng)力閾值增高，進(jìn)一步提示耳蝸帶狀突觸老化可能是老年性聾的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制。

連接蛋白 43(Connexin43，Cx43) 是由 GJA1 基因所編碼，在耳蝸組織(血管紋、皮質(zhì)器、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)的支持細(xì)胞以及前庭感覺(jué)的上皮等)中廣泛表達(dá)，是聽(tīng)覺(jué)感受器官空間三維排列的基礎(chǔ)[18]。有報(bào)道稱(chēng)，在部分非綜合征型耳聾患者中可見(jiàn)Cx43突變，可能是因?yàn)镃x43蛋白表達(dá)異常干擾重要的耳蝸信號(hào)、毛細(xì)胞的功能和可能的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致耳聾[19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，常在老年性聾小鼠模型中檢測(cè)到Cx43表達(dá)的降低，提示Cx43的低表達(dá)與老年聾性的發(fā)病密切相關(guān)[20]。Si等[21]在D-gal 致衰老模型豚鼠中，測(cè)得耳蝸螺旋動(dòng)脈上Cx43 mRNA及Cx43表達(dá)低于對(duì)照，原代 SMA 血管平滑肌細(xì)胞中Cx43表達(dá)水平同樣低于對(duì)照。Zhang等[18]研究表明，Cx43蛋白表達(dá)下調(diào)影響血管紋血管通透性，對(duì)內(nèi)耳血-迷路屏障造成一定影響，造成聽(tīng)力下降。本研究通過(guò)WB和Elisa實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠耳蝸Cx43蛋白表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組，老年組和D-gal組小鼠的耳蝸Cx43蛋白表達(dá)明顯降低，而Cx43蛋白表達(dá)與聽(tīng)覺(jué)腦干電位ABR閾值之間呈負(fù)相關(guān)，提示隨著耳蝸Cx43蛋白表達(dá)降低，聽(tīng)覺(jué)腦干電位ABR閾值升高，耳蝸Cx43蛋白可能參與老年性聾的發(fā)生發(fā)展，可能對(duì)疾病的嚴(yán)重性有一定預(yù)測(cè)作用。

耳蝸毛細(xì)胞帶狀突觸出生時(shí)即已存在，出生后逐漸發(fā)育和完善，聽(tīng)覺(jué)發(fā)生與帶狀突觸成熟時(shí)間高度吻合，表明成熟帶狀突觸的形成可能是聽(tīng)覺(jué)發(fā)生的前提條件之一[21]。有研究證明，老年性耳聾患者言語(yǔ)識(shí)別率降低與耳蝸突觸病變有關(guān)，耳蝸突觸病變參與了老年人聽(tīng)覺(jué)通路的退化，并逐漸從耳蝸發(fā)展并擴(kuò)散到聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)[16]。本研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，即隨著帶狀突觸的老化，聽(tīng)力閾值增高。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)Cx43蛋白在老年小鼠及D-gal老年聾模型鼠的耳蝸中表達(dá)降低，同時(shí)出現(xiàn)耳蝸帶狀突觸寬度的降低及ABR閾值的升高。提示Cx43蛋白含量會(huì)引起耳蝸帶狀突觸發(fā)生形態(tài)變化，其含量的下降參與老年性聾的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)Cx43蛋白在老年性耳聾的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，且Cx43蛋白的表達(dá)與耳蝸帶狀突觸寬度呈正相關(guān)，而與聽(tīng)覺(jué)腦干電位ABR閾值之間呈負(fù)相關(guān)，提示Cx43蛋白可能通過(guò)介導(dǎo)耳蝸帶狀突觸老化參與老年性聾的發(fā)生發(fā)展。本研究不僅為解釋老年性聾發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供了方向，同時(shí)為老年性聾的防治及個(gè)體化治療提供了新的治療方案及思路，但對(duì)于小鼠各生命周期中Cx43含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，還需另行實(shí)驗(yàn)和深入探討。