液質(zhì)聯(lián)用和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)用于復(fù)方斑蝥膠囊治療原發(fā)性肝癌的機(jī)制研究

賈清馨，周 巡，賴(lài)華清，郭延壘，張建永

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥物分析教研室，貴州 遵義 563099；2.重慶市中藥研究院 藥理毒理所，重慶 400065)

原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，最新數(shù)據(jù)報(bào)告顯示，全球PLC死亡病例占4.7%，位居所有惡性腫瘤的第六位；死亡率高達(dá)8.3%，在癌癥死亡順位中位列第三[2]，因此研發(fā)新型抗PLC藥物具有重要意義。

復(fù)方斑蝥膠囊(Fufang banmao capsule，F(xiàn)FBM)由人參、斑蝥、黃芪、刺五加、三棱、半枝蓮、莪術(shù)、山茱萸、女貞子、熊膽粉及甘草共計(jì)11味中藥材加工而成的中藥復(fù)方制劑，其臨床效果顯著，常用于PLC，肺癌及直腸癌等的治療[3-4]，尤其對(duì)PLC有顯著療效。臨床研究發(fā)現(xiàn)FFBM輔助PLC治療可有效延長(zhǎng)患者的中位生存時(shí)間，降低死亡率[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FFBM聯(lián)合肝動(dòng)脈插管栓塞化療能顯著提高PLC治療效果，改善患者生活質(zhì)量，患者治療后腫瘤標(biāo)志物AFP、CEA、CA199均有不同程度降低，免疫細(xì)胞因子VEGF、HIF-1α含量均明顯降低[1]。進(jìn)一步抗腫瘤機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)FFBM治療PLC與調(diào)節(jié)免疫功能、抑制肝癌細(xì)胞增殖有關(guān)，但是其抗PLC的潛在的有效成分、作用機(jī)制等尚未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性與中醫(yī)藥的整體觀、辨證論等基本理論趨于一致，因此基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)中藥復(fù)方的機(jī)制機(jī)理進(jìn)行分析，在中藥復(fù)方機(jī)制研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[5-6]。本研究采用高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到的潛在成分進(jìn)行靶向性分析，并對(duì)核心成分與其對(duì)應(yīng)靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，從而分析FFBM對(duì)PLC的有效成分、潛在靶標(biāo)和作用機(jī)制，以期為FFBM的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供研究依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫(kù) 應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://lsp.nwu.edu.cn)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.nrc.cn:9090/ETCM/)、PubChemCompound數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.uniprot.org/)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)、DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)、PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www1.rcsb.org/)、Peakview Software Version:1.2.0.3。等數(shù)據(jù)庫(kù)收集整理相關(guān)化合物、靶標(biāo)等信息；采用Cytoscape3.6.0、Discovery Studio 2016 Client、Chem Draw Ultra 7.0等應(yīng)用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分子對(duì)接等。

1.2 儀器與材料 FFBM(批號(hào)：161105，貴州益佰制藥股份有限公司)；UPLC-Q-TOFHRMS高分辨液質(zhì)聯(lián)用(AB SCIEX,Framingham,MA,USA)；LC30A系統(tǒng)(UFLC)(Shimadzu,Kyoto,Japan)；QExactive型高分辨質(zhì)譜(Thermo Fisher Scientific)；Phenomenex Kinetex C18100A色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；十萬(wàn)分之一分析天平；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)；水(超純水)，其余均為色譜純。

1.3 供試品溶液的制備 取FFBM本品3粒，剝?nèi)ツz囊外殼后，取其內(nèi)容物，于分析天平上精密稱(chēng)定約0.500 g，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇∶乙腈：水(4∶4∶2)溶液8 mL后，超聲提取(功率80W)30 min，取出放冷后，以醇∶乙腈∶水(4∶4∶2)溶液定容。取1 mL提取液離心(12 000 r/min)10 min，進(jìn)樣分析。

1.4 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Kinetex C18100A色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動(dòng)相：A相，0.1%甲酸-水；B相，0.1%甲酸-乙腈；梯度洗脫為：0～1 min，0%～10%B；1～7 min，10%～85% B；7～11 min，85% B；11～11.5 min，85%～10% B；11.5～15 min，10%～0% B。

1.5 質(zhì)譜條件 UPLC-Q Exactive 型液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：離子源采用HESI源(heated ESI)，使用動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)觸發(fā)信息關(guān)聯(lián)采集模式(IDA)的方式進(jìn)行掃描，Gas1：55Psi；Gas2：55Psi；IS：4 500V；TEM：600 ℃；CUR：25Psi。

1.6 化合物結(jié)構(gòu)分析 質(zhì)譜進(jìn)樣分析后，數(shù)據(jù)導(dǎo)入Peakview software Version:1.2.0.3鑒定分析軟件擬合可能存在的分子式，利用自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)及相應(yīng)裂解規(guī)律匹配法對(duì)含有MS/MS數(shù)據(jù)的峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。

1.7 藥材成分靶標(biāo)收集 根據(jù)文獻(xiàn)并結(jié)合計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(設(shè)定“OB≥30%”和“DL≥0.18”為篩選條件)獲取FFBM中的主要化學(xué)成分，計(jì)算各成分的分子離子及其準(zhǔn)分子離子的質(zhì)荷比(m/z)，對(duì)“1.6”項(xiàng)下數(shù)據(jù)進(jìn)行靶向性的提取，并對(duì)其靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.8 原發(fā)性肝癌靶標(biāo)收集 以“Primary Liver Cancer”作為關(guān)鍵詞，按照相關(guān)性得分(Relevance score≥21.610)作為篩選條件，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PLC的靶標(biāo)進(jìn)行篩選。

1.9 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶標(biāo)的篩選 “1.7”項(xiàng)下篩選出的FFBM靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行不同模式下生物的同源基因映射，轉(zhuǎn)化為人類(lèi)基因。將轉(zhuǎn)化后的成分靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)共同導(dǎo)入到韋恩2.1.0中，繪制韋恩圖獲取兩者交集，對(duì)FFBM的有效作用靶標(biāo)進(jìn)行篩選，同時(shí)利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(PPI score>0.7)。將篩選后的靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape3.6.0軟件中進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建“藥物靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)”相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.10 KEGG通路富集分析 為進(jìn)一步明確FFBM與PLC交集靶標(biāo)具體的功能以及在相關(guān)通路中的作用，應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)以人類(lèi)為研究對(duì)象，對(duì)核心靶標(biāo)KEGG通路富集分析，解析FFBM的潛在作用機(jī)制。

1.11 分子對(duì)接驗(yàn)證 根據(jù)FFBM的質(zhì)譜分析驗(yàn)證結(jié)果，結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)，從中選取degree值排名靠前的6個(gè)成分，在Chem Draw Ultra 7.0軟件中繪制出6種成分的2D結(jié)構(gòu)，保存為*.mol格式文件，運(yùn)用Discovery Studio 2016 Client軟件使用protocol對(duì)配體進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化同時(shí)加氫、產(chǎn)生異構(gòu)體；后通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載6種成分相應(yīng)靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的*.pdb格式文件，運(yùn)用Discovery Studio 2016 Client軟件移除靶蛋白中的配體以及非蛋白成分(如水分子等)，對(duì)其進(jìn)行蛋白修飾。將上述兩種文件進(jìn)行LibDock分子對(duì)接，以對(duì)接打分(LibDock score)評(píng)價(jià)其相互作用。

2 結(jié)果

2.1 FFBM化學(xué)成分靶標(biāo)分析結(jié)果 FFBM樣品溶液采集得到的UPLC-Q-TOFHRMS基峰圖，見(jiàn)圖1。按“1.6”項(xiàng)下鑒定得到96種化學(xué)成分[7]，結(jié)果見(jiàn)表1。基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取FFBM化學(xué)成分作用的靶標(biāo)，與化合物結(jié)構(gòu)分析鑒定出的96種成分的進(jìn)行比對(duì)，二者合并去除重復(fù)值后，共得到化學(xué)成分59種，靶標(biāo)330個(gè)。其中鑒定出的成分與核心靶標(biāo)具有關(guān)聯(lián)性的用“T”表示，關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)的用“F”表示。

A：為正離子模式；B：負(fù)離子模式。圖1 FFBM BPC圖

表1 FFBM化學(xué)成分鑒定表

(續(xù)表)

2.2 原發(fā)性肝癌靶標(biāo)分析結(jié)果 基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索PLC疾病相關(guān)靶標(biāo)，共得到15 561個(gè)靶標(biāo)，以Relevance score為參數(shù)指標(biāo)，依次取中位數(shù)7.766、13.563、21.610進(jìn)行篩選，最終以Relevance score≥21.610為篩選條件，得到PLC疾病相關(guān)靶標(biāo)1 945個(gè)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶標(biāo)的篩選分析結(jié)果 “1.9”項(xiàng)下STRING數(shù)據(jù)庫(kù)基因映射后共得到290個(gè)人類(lèi)基因靶標(biāo)，與疾病靶標(biāo)獲取的兩者交集共有173個(gè)靶標(biāo)(見(jiàn)圖2)。將這173個(gè)靶標(biāo)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析(PPI)，根據(jù)PPI得分(>0.7)，初步篩選關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白，然后導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

圖2 FFBM與原發(fā)性肝癌交集靶標(biāo)

將關(guān)注基因?qū)牒螅x擇其鄰居節(jié)點(diǎn)，并提取關(guān)注基因的子網(wǎng)絡(luò)，移除網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的自環(huán)，通過(guò)Network Analyzer插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)進(jìn)行分析，取degree，betweenness，closeness3個(gè)拓?fù)鋮?shù)的中位數(shù)為閾值(分別為100、0.012 9、0.392 8)進(jìn)行篩選，最終獲得24個(gè)相互作用的核心靶標(biāo)。將核心靶標(biāo)通過(guò)Cluster Maker 2插件進(jìn)行模塊分解和識(shí)別，刪除連接度為1的模塊，見(jiàn)圖3、4。圖3中核心靶標(biāo)的節(jié)點(diǎn)顏色為藍(lán)色，直觀的表明了蛋白與蛋白之間的相互作用，蛋白之間連線越粗，表明相應(yīng)蛋白之間的相互作用越強(qiáng)[8]。

圖3 FFBM與原發(fā)性肝癌靶標(biāo)與靶標(biāo)的相互作用關(guān)系

圖4 FFBM核心靶標(biāo)的PPI

2.4 KEGG通路富集分析結(jié)果 基于DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)FFBM篩選出的24個(gè)核心靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)P<0.05對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，共獲得238信號(hào)通路，取P值最小的前20條通路進(jìn)行如下分析，見(jiàn)表2、圖5。圖5中氣泡越大代表該通路所包含的輸入基因越多，顏色越紅表明富集程度越高，越靠右表明富集因子越高。表2中P值代表該通路與PLC的相關(guān)強(qiáng)弱，P值越小代表相關(guān)性越強(qiáng)；數(shù)量值代表該通路富集的靶標(biāo)個(gè)數(shù)，數(shù)值越大表明富集的靶標(biāo)越多。

表2 FFBM關(guān)鍵靶標(biāo)KEGG通路富集分析

圖5 FFBM關(guān)鍵靶標(biāo)KEGG通路富集分析

根據(jù)以上分析結(jié)果，將FFBM的化學(xué)成分、PLC的潛在作用靶標(biāo)及其富集得到的信號(hào)通路，導(dǎo)入 Cytoscape 3.6.0軟件繪制“化合物-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖 6，其中紅色為信號(hào)通路，綠色為核心靶標(biāo)，黃色為FFBM的化學(xué)成分，連線代表成分、靶標(biāo)和信號(hào)通路之間的關(guān)系。對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，可知有RB1、JUN、AR、RELA、AKT1、CASP3等16個(gè)核心蛋白靶標(biāo)，對(duì)應(yīng)山柰酚、野黃芩苷、高黃芩素、異鼠李素、沒(méi)食子酸等29個(gè)成分，以及Prostate cancer，Pancreatic cancer，TNF signaling pathway，p53 signaling pathway 等 20 條通路。

圖6 FFBM化合物-關(guān)鍵靶標(biāo)-通路

2.5 分子對(duì)接分析結(jié)果 采用 Discovery Studio 2016 Client軟件的LibDock模塊,對(duì)關(guān)鍵化學(xué)成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，當(dāng)LibDock Score大于105分或高于原配體打分值時(shí),認(rèn)為成分與靶標(biāo)具有較好的結(jié)合活性[9]，取每個(gè)靶標(biāo)評(píng)分最高的化合物，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)合關(guān)鍵成分多的靶標(biāo)，產(chǎn)生藥效的可能性越大，為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)可能性。

表3 FFBM關(guān)鍵成分與對(duì)應(yīng)靶標(biāo)分子驗(yàn)證

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為PLC屬中醫(yī)“臌脹、癥瘕、積聚”范疇[10]，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)·五臟生成論》記載“肝藏血，心行之，人動(dòng)則血運(yùn)于諸經(jīng)，人靜則血?dú)w于肝臟?！薄鹅`樞·本神》曰：“肝藏血，血舍魂?！北砻鱌LC病機(jī)演變過(guò)程與邪氣入絡(luò)客于血脈，影響氣、血、津、液的運(yùn)行及輸布有關(guān)[11]。FFBM11味藥具有破血消瘀，攻毒蝕瘡之功效，其中君藥斑蝥破血逐瘀、解毒蝕瘡，此外其有效成分斑蝥素對(duì)于肝癌、胃癌等多種腫瘤具有較強(qiáng)的抑制作用[12]。臣藥莪術(shù)和三棱相須為用，增強(qiáng)斑蝥化瘀功效的同時(shí)還可消積止痛。人參、刺五加二者合用滋補(bǔ)肝腎效果顯著，具有抗炎、抗病毒等作用；半枝蓮和熊膽粉佐以補(bǔ)養(yǎng)肝腎，抗癌止痛、清熱解毒，使藥甘草調(diào)和諸藥[13-15]。趙士沖等[16]研究發(fā)現(xiàn)FFBM可通過(guò)抑制原癌基因C-Myc的表達(dá)和促進(jìn)抑癌基因p53的表達(dá)發(fā)揮抗肝癌的作用，但其治療PLC的分子機(jī)制尚不清楚。

本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)借助多個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件，構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)以及“化合物-關(guān)鍵靶標(biāo)-通路”的網(wǎng)絡(luò)圖探究FFBM對(duì)PLC的作用機(jī)制。

本研究首先基于高分辨質(zhì)譜對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到的成分進(jìn)行驗(yàn)證，共驗(yàn)證分析得到59種成分，其中單萜類(lèi)成分斑蝥素具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，干擾細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等作用，是臨床上的最佳抗癌藥物之一[17]。封艷艷等[18]研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素可明顯促進(jìn)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化引起肝癌細(xì)胞Hep G2生長(zhǎng)抑制，起到抗肝癌的作用。驗(yàn)證得到的成分中包括芹菜素、山奈素、羥基芫花素等24種黃酮類(lèi)化合物。如芹菜素可通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化、抑制肝細(xì)胞癌的侵襲和血管生成等而發(fā)揮抗癌作用[19]；山奈酚可通過(guò)下調(diào)miR-21抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[20]；羥基芫花素可誘導(dǎo)miR-320a表達(dá)，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子FOXM1和FOXM1下游相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[21]。59種成分中黃芩苷、淫羊藿素、異脫水淫羊霍素等16個(gè)為苷類(lèi)成分。其中黃芩苷可阻斷癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、促進(jìn)機(jī)體自噬、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡和抑制癌細(xì)胞遷移[22]；淫羊藿素具有抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等多重效應(yīng)，并且抗腫瘤作用譜廣,對(duì)多種腫瘤均具有抑制作用，特別是對(duì)肝癌有較好的治療效果[23]，Sun等[24]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿素在體外可以抑制肝癌細(xì)胞腫瘤球的形成，在體內(nèi)抑制肝癌腫瘤形成；此外篩選成分中還有異綠原酸B、沒(méi)食子酸、D-(+)-蘋(píng)果酸等9個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分以及其他類(lèi)成分9個(gè)，這些成分也被報(bào)道有一定的抗肝癌活性。

本研究最終篩選出24個(gè)核心靶標(biāo)，16個(gè)蛋白靶標(biāo)，29個(gè)主要化學(xué)成分以及對(duì)應(yīng)的20條關(guān)鍵信號(hào)通路。在得到的16個(gè)蛋白靶標(biāo)中，主要包括RB1、JUN、AR、RELA、AKT1等靶標(biāo)。其中RB1是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，是一種抑癌基因，它可通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化所需基因的表達(dá)，從而維持細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育平衡[25]。Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)miR-1297通過(guò)下調(diào)抑癌基因RB1參與肝癌的發(fā)生。本研究分子對(duì)接結(jié)果顯示，RB1與槐角苷、野黃芩苷、芹菜素、鷹嘴豆芽素A、淫羊藿素、山柰酚、芒柄花苷等均具有較好地結(jié)合作用。FFBM可能通過(guò)作用于RB1調(diào)控癌細(xì)胞的增殖分化來(lái)治療PLC。JUN可編碼一種蛋白質(zhì)使其與病毒蛋白高度相似，同時(shí)還可以直接與特定靶DNA序列相互作用以調(diào)節(jié)基因表達(dá)[27]。吳林慧等[28]研究發(fā)現(xiàn)SPOP蛋白對(duì)癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響可能與促進(jìn)JUN蛋白中的c-Jun的表達(dá)有關(guān)。AR(雄激素受體)為核受體超家族中的類(lèi)固醇受體，主要介導(dǎo)雄激素的生物學(xué)作用，影響靶蛋白的合成，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中扮演著重要角色。AR對(duì)肝癌具有雙重作用，一方面它可以促進(jìn)肝癌的發(fā)生幾率，另一方面又可以抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[29]。Yeh等[30]研究發(fā)現(xiàn)AR可作用于HBx、TGF-β1、VEGF、CCRK、miR-216a、p38、NF-κB/MMP9等因子或信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。本研究分子對(duì)接結(jié)果顯示AR與野黃芩苷、鷹嘴豆芽素A、淫羊藿素、山柰酚、芒柄花苷、異脫水淫羊霍素等具有較好的結(jié)合作用。文獻(xiàn)研究表明NF-κB家族成員RELA翻譯修飾后可精準(zhǔn)調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，而下調(diào)NF-κB活性已成為癌癥治療的關(guān)鍵[31]。本研究分子對(duì)接結(jié)果顯示RELA與野黃芩苷具有較好的結(jié)合作用。AKT1調(diào)控細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過(guò)程。甘彩玉等[32]通過(guò)建立BEL-7404肝癌裸鼠移植瘤模型，證實(shí)可通過(guò)激活細(xì)胞凋亡PI3K/AkT/p53信號(hào)傳導(dǎo)通路,抑制Bcl-2,提高Bax的表達(dá),促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。以上關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白與相應(yīng)成分具有良好的結(jié)合活性，從分子對(duì)接的角度驗(yàn)證了基于結(jié)構(gòu)相似性驗(yàn)證的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果。

KEGG通路分析結(jié)果表明FFBM治療PLC的過(guò)程主要涉及p53 signaling pathway、TNF signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway等20條信號(hào)通路。其中p53信號(hào)通路以p53基因?yàn)楹诵模ㄟ^(guò)調(diào)控其相關(guān)靶基因的表達(dá)，達(dá)到阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的。p53基因在激活后表現(xiàn)出明顯的抑癌作用，上調(diào)p53基因的表達(dá)，可以提高p53基因的核內(nèi)水平，促進(jìn)其目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[33]。TNF信號(hào)通路以TNF-α細(xì)胞因子為核心，參與全身炎癥反應(yīng)?？追矘s[34]發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中TNF-α的基因表達(dá)水平明顯低于癌旁組織。Zhu等[35]發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子TNF-α能夠通過(guò)瞬時(shí)受體電位通道促使Ca2+內(nèi)流，進(jìn)一步激活鈣蛋白酶/IAP/caspase3信號(hào)通路以促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。NOD樣受體是細(xì)胞質(zhì)PRRs的一個(gè)亞群，在宿主先天免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[36]，其中研究熱點(diǎn)NOD1和NOD2蛋白在與配體結(jié)合后，蛋白可以和下游的RIP2相互作用磷酸化IκB，進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的表達(dá)[37]?？傊犯患治鼋Y(jié)果表明FFBM抗PLC的復(fù)雜作用機(jī)制。

綜上所述，本文基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)FFBM治療原發(fā)性肝癌的有效成分及其作用機(jī)制進(jìn)行研究，研究結(jié)果對(duì)于FFBM的質(zhì)量控制和治療原發(fā)性肝癌的有效活性成分的發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。