SOCS6對前列腺癌分化的影響及其臨床意義

蘇 浩，王 蔚，袁東波，朱建國

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 研究生院，貴州 遵義 563099；2.貴州省人民醫(yī)院 泌尿外科，貴州 貴陽 550002)

前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是全球男性中被診斷出的第三常見癌癥，僅次于肺癌和結(jié)直腸癌[1]。雖然中國的前列腺癌發(fā)病率較歐美國家低，但隨著我國經(jīng)濟(jì)水平提高、人民生活水平改善、人均壽命延長和篩查范圍擴(kuò)大，中國的前列腺癌發(fā)病率呈顯著上升趨勢，正逐步成為影響中老年男性健康的重要疾病[2]。近幾年，前列腺癌已超過膀胱癌，成為在登記泌尿系癌癥中第一位[3]。雖然前列腺癌是一種惰性癌，但大部分患者初診時已處在疾病的中晚期[4]，并且在激素治療過程中容易發(fā)展為去勢性抵抗前列腺癌[5]。因此，探索新的分子標(biāo)記物，并對其更詳細(xì)地探索，對開發(fā)更有效的治療方式起著非常重要的作用。

細(xì)胞因子信號抑制因子(Suppressors of cytokine signalling，SOCS)是細(xì)胞因子受體信號的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，在癌癥的免疫中起重要的作用，SOCS6是其中重要的一員[6-7]。SOCS6在子宮、甲狀腺和胰腺的正常組織樣本中高表達(dá)，然而在自卵巢、肺、胃、膀胱、前列腺組織相對低表達(dá)[8-9]。SOCS6在大部分的腫瘤研究中主要起到抑癌基因的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SOCS6在前列腺癌中的相對表達(dá)量較正常前列腺組織顯著降低，上調(diào)SOCS6表達(dá)可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，且與Gleason評分等密切相關(guān)[10]。Gleason評分與PCa的病理分期密切相關(guān)，故猜測SOCS6表達(dá)情況影響了前列腺癌的分化。本研究將進(jìn)一步驗證SOCS6在前列腺癌中表達(dá)情況，通過動物體外成瘤實驗，分析其表達(dá)情況與前列腺腫瘤分化的影響，探討其作用機(jī)制和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織樣本采集 本研究經(jīng)貴州省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(編號：2016026)，收集在貴州省人民醫(yī)院泌尿外科行前列腺癌手術(shù)的10例患者的組織標(biāo)本。所有患者手術(shù)前均沒有接受化療或放療，組織標(biāo)本術(shù)后經(jīng)病理診斷為前列腺癌。

1.2 細(xì)胞與試劑 人前列腺癌細(xì)胞株(PC3和LNCaP)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫( ATCC)；胎牛血清( FBS)、胰蛋白酶(EDTA)、1640培養(yǎng)基購買于美國Gibico公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)皿、巴氏管、離心管等塑料制品購買自NEST公司；免疫組化試劑盒、伊紅、蘇木素染液購買自北京索萊寶科技有限公司；β-actin、SOCS6抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購買自Abcam公司；牛血清白蛋白(BSA)、BCA蛋白檢測試劑盒和ECL試劑盒購買自碧云天。

1.3 免疫組化染色 福爾馬林固定和石蠟包埋切片，免疫組織化學(xué)染色使用標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)(IHC)方法，用一抗SOCS6進(jìn)行孵育，在室溫下用優(yōu)化的稀釋度。本課題組前期已使用組織芯片證實前列腺癌組織中SOCS6的相對表達(dá)量較正常前列腺組織顯著降低[11]。此次實驗將使用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測前列腺癌組織中SOCS6表達(dá)及分布情況。

1.4 SOCS6過表達(dá)細(xì)胞株P(guān)C3/LNCaP的構(gòu)建及鑒定 將前列腺癌PC3和LNCaP細(xì)胞株放在加入含10% 胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，并加入1%的雙抗，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至80%～90%時換液傳代。實驗選用對數(shù)生長期細(xì)胞，使用慢病毒載體構(gòu)建SOCS6過表達(dá)細(xì)胞株(LNCaP-pre-scos6、PC3-pre-scos6)和空載細(xì)胞株(LNCaP-pre-000、PC3-pre-000)。將3種細(xì)胞株(過表達(dá)組、空載組、正常組)進(jìn)行蛋白樣品制備，BCA法測定各樣本蛋白濃度，以恒壓80V、20 min(濃縮膠)，120 V、100 min(分離膠)條件電泳，取分離膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，于室溫用5% BSA進(jìn)行封閉1 h，SOCS6一抗(1∶1 000)4°冰箱搖床孵育過夜，第2天洗膜后二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書對PVDF膜上的蛋白印跡進(jìn)行曝光，Tanon 5200型凝膠成像系統(tǒng)拍照。β-actin作為內(nèi)參蛋白對照，相對灰度=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值×100%。

1.5 實驗動物及飼養(yǎng)條件 BLAB/c雄性裸鼠，4～5周齡，體重(15±2) g，12只；購買于廣東醫(yī)學(xué)實驗動物中心。SPF級的環(huán)境中飼養(yǎng)，每籠3只，所有動物飼養(yǎng)在通風(fēng)干燥的房間。

1.6 裸鼠腫瘤模型構(gòu)建 取對數(shù)生長期的LNCaP-pre-scos6、PC3-pre-scos6和LNCaP-pre-000、PC3-pre-000克隆細(xì)胞，用EDTA消化細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞開始掉落，終止消化，吹打混勻制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，隨后將細(xì)胞收集到15 mL離心管中，1 000 r/min ，5 min。棄上清液，用無血清培養(yǎng)基重懸為1.5× 107/mL懸液。根據(jù)接種細(xì)胞種類分為4組裸鼠，每組3只，每只裸鼠腎包膜上接種100 μL細(xì)胞混勻液，共接種12只。LNCaP對照組1-3號裸鼠左側(cè)腎包膜注射LNCaP-pre-000細(xì)胞數(shù)為3.16×106個,實驗組1～3號裸鼠左側(cè)腎包膜注射LNCaP-pre-SCOS6細(xì)胞數(shù)為3.16×106個；PC3對照組1～3號裸鼠左側(cè)腎包膜注射PC3-pre-000細(xì)胞數(shù)為3.44×106個，實驗組 1～3號裸鼠左側(cè)腎包膜注射PC3-pre-SCOS6細(xì)胞數(shù)為3.44×106個。在SPF級環(huán)境中，放回籠中分開繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。LNCaP組接種后的34 d取材，PC3組接種后的27 d取材。

1.7 瘤體組織取材及HE染色 所有動物經(jīng)過處理后，每天觀察裸鼠生長狀況。生長時間到達(dá)后，麻醉狀態(tài)下完整取出瘤體以及其他內(nèi)臟器官，脫頸椎處死動物，稱重并且拍攝，隨即在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，制作石蠟切片，根據(jù)HE染色步驟進(jìn)行染色，隨后在顯微鏡下進(jìn)行觀察組織病理改變。

2 結(jié)果

2.1 SOCS6在前列腺癌組織中表達(dá)情況 通過免疫組化染色，在光鏡下可觀察到SOCS6表達(dá)主要集中于前列腺癌上皮基底細(xì)胞，陽性細(xì)胞著色主要定位于細(xì)胞漿、細(xì)胞核，在前列腺癌樣組織中免疫組化染色強度主要為中、弱陽性，鏡下部分結(jié)果如圖1所示。

A：鏡下×200；B：鏡下×400。圖1 SOCS6在前列腺癌組織中的表達(dá)

2.2 Western blot檢測LNCaP/PC3過表達(dá)細(xì)胞株SOCS6蛋白表達(dá)水平 以β-actin蛋白為內(nèi)參，檢測SOCS6在PC3正常細(xì)胞組(PC3-normal)、空載對照組(PC3-000)、過表達(dá)組(PC3-SOCS6)中的蛋白表達(dá)水平；結(jié)果顯示過表達(dá)組細(xì)胞株的SOCS6蛋白表達(dá)量相對于正常組細(xì)胞和空載對照組顯著增高(P<0.05，見圖2A、B)。同樣，檢測SOCS6在LNCaP正常細(xì)胞組(LNCaP-normal)、空載體對照組(LNCaP-000)、過表達(dá)組(LNCaP-SOCS6)中SOCS6蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示過表達(dá)組細(xì)胞株的SOCS6蛋白表達(dá)量相對于正常組細(xì)胞和空載對照組顯著增高(P<0.05)，見圖2C、D。由此可見兩個細(xì)胞株構(gòu)建成功。

A、B：PC3細(xì)胞株SOCS6蛋白表達(dá)情況；C、D：LNCaP細(xì)胞株SOCS6蛋白表達(dá)情況；*：與正常和空載組細(xì)胞比較，P<0.05。圖2 Western blot檢測PC3/LNCaP細(xì)胞株中各組細(xì)胞SOCS6蛋白表達(dá)水平

2.3 裸鼠成瘤情況 PC3組細(xì)胞生長速度較快,接種27 d腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散侵蝕了大部分的腎臟(見圖3A)。LNCaP組細(xì)胞中LNCaP-pre-000在腎包膜內(nèi)接種的3只裸鼠中，只有兩只成瘤了(1號和2號)，可能是操作失誤導(dǎo)致其中一只沒有細(xì)胞接種成功；LNCaP-pre-SCOS6在腎包膜內(nèi)接種的3只裸鼠均長出大小不一的腫瘤(見圖3B)。

圖3 PC3、LNCaP SOCS6過表達(dá)組與空載組裸鼠成瘤情況

2.4 HE染色觀察裸鼠腫瘤組織分化情況

2.4.1 SOCS6基因?qū)C3腫瘤細(xì)胞分化的影響 實驗組(PC3-pre-SOCS6)與對照組(PC3-pre-000)腫瘤呈中分化或者低分化，特別是1號和3號小鼠的實驗組分化較好，腫瘤內(nèi)有較多的腺腔，部分腫瘤分化為腺體還不明顯。腫瘤中有較多的間質(zhì)生成，癌細(xì)胞形態(tài)與正常細(xì)胞還是有比較大的差異，部分腫瘤細(xì)胞呈高分化，細(xì)胞形態(tài)趨于正?；?。實驗結(jié)果見圖4～6。

A、B:PC3-pre-SOCS6-1號，×100;C、D:PC3-pre-SOCS6-1號，×200。圖4 PC3實驗組1號小鼠腫瘤分化情況

A:PC3-Pre-SOCS6-2號，×100;B:PC3-Pre-SOCS6-2號，×200;C:PC3-Pre-SOCS6-3號，×100;D:PC3-Pre-SOCS6-3號，×200;PC3-Pre-SOCS6-2號：小鼠的腫瘤細(xì)胞分化較好，趨于正常細(xì)胞形態(tài)，無腺腔生成；PC3-pre-SOCS6-3號：小鼠的腫瘤有腺腔形成。圖5 PC3實驗組2號和3號小鼠腫瘤分化情況

A、B：PC3-pre-000，×100；B、C：PC3-pre-000，×200。圖6 PC3對照組小鼠腫瘤分化情況

2.4.2 SOCS6基因?qū)NCaP腫瘤細(xì)胞分化的影響 實驗組(LNCaP-pre-socs6)與對照組(LNCaP-pre-000)腫瘤均呈低分化，腫瘤均已影響到腎臟組織，腎小管上皮細(xì)胞水腫，上皮細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)分裂，實驗組腎小管擴(kuò)張嚴(yán)重，癌細(xì)胞已向腎臟蔓延，部分癌細(xì)胞浸潤腎間質(zhì)，腎小管及腎小球，腎小球炎癥細(xì)胞浸潤。實驗組與對照組腫瘤多有壞死，腫瘤為實質(zhì)性腫瘤，無腺腔，呈低分化實。實驗結(jié)果如圖7～8。

A：腫瘤呈低分化，向腎臟蔓延(LNCaP-pre-socs6 ×100)；B：腎小管嚴(yán)重擴(kuò)張(LNCaP-pre-socs6 ×100)；C：腎小管，腎小球癌細(xì)胞浸(LNCaP-pre-socs6 ×200)；D：腫瘤壞死，低分化(LNCaP-pre-socs6 ×200)；E、F：癌細(xì)胞向腎間質(zhì)蔓延，腎小管被腫瘤包裹，上皮細(xì)胞水樣變，細(xì)胞核分裂(LNCaP-pre-socs6 ×400)。圖7 LNCaP實驗組小鼠腫瘤分化情況

A：LNCaP-pre-000-1號×100;B：LNCaP-pre-000-1號×200;C：LNCaP-pre-000-2號×100;D：LNCaP-pre-000-2號×200;LNCaP-pre-000-1號：小鼠腎小球癌細(xì)胞浸潤，部分腎間質(zhì)也有癌細(xì)胞；LNCaP-pre-000-2號：小鼠腎小管上皮細(xì)胞多核，腫瘤組織發(fā)生壞死，腫瘤呈低分化。圖8 LNCaP對照組小鼠腫瘤分化情況

3 討論

腫瘤的生長速度、侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后等生物學(xué)特征與腫瘤的分化密切相關(guān)，腫瘤分化程度越低，惡性程度就越高。腫瘤的誘導(dǎo)分化治療是治療腫瘤的一個重要的方向，并且在一些疾病的治療中得到了證實[12]。前列腺癌是一種惰性癌，其主要死因為惡性程度高的侵襲性癌轉(zhuǎn)移到全身引起多器官衰竭，因此，促進(jìn)前列腺癌的分化，降低其惡性程度是增加前列腺癌患者生存率的一個有前景的治療方式。Geleson評分是目前國際上使用最廣泛使用的前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)病理分級系統(tǒng)，現(xiàn)已成為前列腺癌診斷、制定治療方案和評估預(yù)后的主要參考條件之一[13]。前期研究已證實，前列腺癌中SOCS6的表達(dá)水平與腫瘤Geleson評分具有顯著相關(guān)性，其表達(dá)水平越高，則Geleson評分越低，反之越高。因此，推測SOCS6基因可能會影響前列腺癌的分化。

細(xì)胞因子信號抑制因子(SOCS)家族是一類由細(xì)胞分泌的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，通過反饋阻斷細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，主要作為JAK/STAT等多條信號通路的負(fù)性調(diào)控蛋白，它由8個成員組成，從SOCS1到SOCS7和CIS[14-15]。SOCS6廣泛表達(dá)在許多組織，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)SOCS6不僅涉及細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡的調(diào)節(jié)，還與眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在許多癌癥中受miRNA的調(diào)控導(dǎo)致其下調(diào)，從而增加癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力[16-18]。

前列腺上皮由腔上皮細(xì)胞層和基底細(xì)胞層構(gòu)成，干細(xì)胞長期以來一直與前列腺形成有關(guān)，基底細(xì)胞和管腔細(xì)胞屬于同一譜系，并且源自共同的干細(xì)胞，且干細(xì)胞位于基底區(qū)室中[19]。在前列腺癌中，正常上皮譜系發(fā)生分化功能障礙，基底膜破壞、消失，連續(xù)基底細(xì)胞層丟失和管腔種群擴(kuò)大[20]。前列腺癌發(fā)生雄激素剝奪和再生睪酮替代后干細(xì)胞會發(fā)生消退，再生研究表明，這些細(xì)胞存在于前列腺的近端導(dǎo)管和基底層[21]。本實驗發(fā)現(xiàn)SOCS6 局限于前列腺基底細(xì)胞中表達(dá)。隨后，應(yīng)用慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)SOCS6的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和LNCaP。LNCaP是從人前列腺癌患者左鎖骨上淋巴結(jié)細(xì)針穿刺的活體組織中分離建立的雄激素依賴的生長的細(xì)胞系，而PC3是從人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中分離的雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系[22]。本實驗在體外構(gòu)建了動物移植瘤模型，通過HE染色發(fā)現(xiàn)：在PC3細(xì)胞株中腫瘤主要呈現(xiàn)低分化或中分化，通過上調(diào)SOCS6的表達(dá)水平可促進(jìn)腫瘤分化，腫瘤組織內(nèi)可見較多的腺腔，部分新生腺體的形成，腫瘤中有較多的間質(zhì)生成，部分腫瘤細(xì)胞呈高分化，細(xì)胞形態(tài)趨于正?；?。而在LNCaP細(xì)胞中腫瘤均已影響到腎臟組織，實驗組與對照組腫瘤多有壞死，腫瘤為實質(zhì)性腫瘤，無腺腔，呈低分化。因此，推測SOCS6可能促進(jìn)雄激素非依賴性前列腺癌的分化。

在食管鱗狀細(xì)胞癌中，SOCS6 可以通過 c-Kit 的泛素化和降解來促進(jìn)癌細(xì)胞的放射敏感性并降低它們的干細(xì)胞性[23]。在肝臟腫瘤起始細(xì)胞中， SOCS6 的表達(dá)降低，而SOCS6 的過表達(dá)下調(diào)了腫瘤起始細(xì)胞的自我更新和致瘤能力[24]。在膀胱癌中，SOCS6的上調(diào)可以抑制癌細(xì)胞的惡性程度[25]。由此可見，在腫瘤中，SOCS6可促進(jìn)腫瘤的分化，減少其惡性程度。楊林等證明miR24-3p過表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，而miR-24-3p 是 SOCS6 的轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)節(jié)因子[26]，因此根據(jù)本研究移植瘤的分化結(jié)果，猜測在前列腺癌中，miR-24-3p可能抑制了SOCS6的表達(dá)，使腫瘤的惡性程度增加，而過表達(dá)SOCS6會促進(jìn)腫瘤的分化，降低其惡性程度，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在前列腺癌中SOCS 6的表達(dá)與腫瘤分化、病理分期、預(yù)后密切相關(guān)。SOCS 6的表達(dá)水平越高，腫瘤分化程度越高，惡性程度越低，臨床預(yù)后越好。因此，SOCS 6有望成為前列腺癌具有前景的治療目標(biāo)。