煙草五種土傳病原菌的多重PCR快速檢測

舒芳玲，范東升，張得平，藍達愉，林緯，盧燕回，袁高慶*

植物保護

煙草五種土傳病原菌的多重PCR快速檢測

舒芳玲1，范東升2，張得平2，藍達愉1，林緯1，盧燕回2，袁高慶1*

1 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；2 中國煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司，南寧 530022

【目的】建立一種可同時檢測煙草黑脛病菌（）、青枯病菌（）、立枯病菌（）、根腐病菌（）和根黑腐病菌（）5種煙草重要土傳病原菌的五重PCR快速檢測方法?！痉椒ā亢Y選5種病原菌的特異性引物組合，通過不同的引物濃度和退火溫度對多重PCR體系進行優(yōu)化，檢測體系的靈敏度，并對土壤和植株樣品進行測試，驗證其實用性。【結(jié)果】根據(jù)青枯病菌基因、立枯病菌基因、根腐病菌基因以及根黑腐病菌基因設(shè)計特異性引物，并結(jié)合已報道的黑脛病菌基因的特異性引物，成功建立5種煙草土傳病害的多重PCR檢測方法。反應(yīng)體系（25 μL）：Sf1/Sr1、Ff1/Fr1、Pf1/Pr1每條引物分別0.3 μL，Rf1/Rr1每條引物各1.8 μL，TBf1/TBr1每條引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，退火溫度為58℃，靈敏度可達到100 pg/μL?！窘Y(jié)論】本研究建立的多重PCR體系能夠同時快速檢測煙草黑脛病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌以及田間帶菌煙草病株和土壤，為田間煙草土傳病害的早期診斷提供依據(jù)。

煙草；土傳病害；分子檢測；五重PCR

煙草易受多種病害的威脅，其中土傳病害危害嚴重，導(dǎo)致煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴重影響我國煙草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。分布較廣的重要煙草土傳病害包括煙草疫霉（）引起的黑脛病[1]、茄科雷爾氏菌（）引起的青枯病[2]、立枯絲核菌（）引起的立枯病[3]、尖孢鐮刀菌（）引起的根腐病[4]以及基生根串珠霉（）引起的根黑腐病[5]等，這5種病害發(fā)病早期隱蔽性強，待癥狀顯現(xiàn)時多已難以救治。另外，土傳病害易發(fā)生復(fù)合侵染，增加病害診斷和防治的難度。因此，建立一種能在早期對多種煙草土傳病原菌進行快速、準確、高效的檢測方法，有助于降低煙草土傳病害帶來的嚴重損失。常規(guī)檢測方法主要是對病株進行分離鑒定，其分離難度大、靈敏度低、耗時長，難以滿足生產(chǎn)上的需求。血清學(xué)檢測易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)且一次只能檢測一種病原。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，已有很多PCR相關(guān)技術(shù)運用在植物病害的快速檢測方面。如Li等[6]利用環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)擴增實現(xiàn)了對茄科雷爾氏菌的快速分子鑒定。Tsai等[7]利用巢式PCR實現(xiàn)了對煙草疫霉的快速鑒定。Mette等[8]利用UP-PCR分子技術(shù)實現(xiàn)了對立枯絲核菌的快速鑒定。Ling等[9]利用比較基因組學(xué)的方法，建立了尖孢鐮刀菌的多重PCR檢測體系。Liu等[10]利用多重PCR技術(shù)實現(xiàn)了對煙草疫霉和煙草根腐病的快速檢測。田間煙草土傳病原菌種類較多，建立同時檢測更多病原菌種類的技術(shù)將提高檢測效率和應(yīng)用價值。本研究擬通過設(shè)計煙草黑脛病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌的特異性引物，優(yōu)化多重PCR擴增體系，驗證檢測方法的特異性、靈敏度和實用性，實現(xiàn)煙草重要土傳病害的五重PCR快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌：煙草疫霉（）、茄科雷爾氏菌（）、立枯絲核菌（）（AG-2）、灰葡萄孢（）、茄病鐮刀菌（）、終極腐霉（）、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（）、丁香假單胞菌（）由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供；尖孢鐮刀菌（）由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供；基生根串珠霉（）由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院提供。

試劑：PCR反應(yīng)液MasterMix（2×）購自南寧市拓普邦生物科技有限公司，DNA Marker B（100-600）、Ezup柱式細菌DNA抽提試劑盒購自上海生工生物工程（上海）股份有限公司。Biospin真菌DNA提取試劑盒、Biospin全能型植物DNA提取試劑盒以及BioFast土壤DNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖（PDB）培養(yǎng)液、燕麥瓊脂（OMA）培養(yǎng)基和V8汁瓊脂（V8）培養(yǎng)基[11]，以上培養(yǎng)基均調(diào)至pH7。

供試煙草品種為云煙87，由廣西壯族自治區(qū)煙草公司賀州市公司提供。

1.2 DNA的提取

將煙草立枯病菌和根腐病菌以及對照菌終極腐霉、灰葡萄孢和茄病鐮刀菌分別接種于PDA培養(yǎng)基上，煙草根黑腐病菌接種于V8培養(yǎng)基上，煙草黑脛病菌接種于OMA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d后，收集菌絲，按照真菌DNA提取試劑盒說明提取DNA；將煙草青枯病菌以及對照菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種和丁香假單胞菌接種于NB培養(yǎng)液28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，收集菌體，按照細菌DNA試劑盒說明提取DNA；植株和土壤樣品分別按照植株DNA提取試劑盒和土壤DNA提取試劑盒提取DNA；DNA濃度采用DeNOVIX儀器測定。

1.3 五種目標病原菌菌株的驗證

利用真菌通用引物ITS4和ITS5擴增煙草黑脛病菌、立枯病菌、根腐病菌以及根黑腐病菌的ITS序列；利用細菌通用引物16s-63F和16s-1387R擴增青枯病菌的16S rDNA序列，將所得到的PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI中進行同源性比較。煙草黑脛病菌、立枯病菌和根腐病菌分別接種于PDB培養(yǎng)液28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)10 d；煙草根黑腐病菌接種于V8培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d；煙草青枯病菌接種于NB培養(yǎng)液28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)1 d。將煙草黑脛病菌和立枯病菌的菌絲打碎，配成8 mg/mL的菌絲懸液；煙草根腐病菌和根黑腐病菌通過血球計數(shù)板配成107個孢子/mL的孢子懸浮液；煙草青枯病菌通過分光光度計配成2×108CFU/mL的菌液。培育煙草苗齡40 d，除用于煙草立枯病菌接種的煙草為莖基部刺傷處理外，其他4種病原菌接種的煙草為傷根處理，再通過灌根法分別接種，對5種目標病原菌菌株進行致病性測定。

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)煙草青枯病菌的基因（GenBank登錄號LC102464）、立枯病菌的基因（GenBank登錄號MT150070）、根腐病菌的基因（GenBank登錄號FJ590533）以及根黑腐病菌的基因（GenBank登錄號HM569628），應(yīng)用Primer 6.0設(shè)計引物，黑脛病菌采用基于基因設(shè)計的特異性引物[12]，引物由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成，引物序列如表1。本研究所使用的引物濃度均先稀釋為10 μmol/L，然后在PCR反應(yīng)體系中加入相應(yīng)體積的該濃度的引物。

表1 PCR特異性引物

Tab.1 PCR specific primers

1.5 單重PCR特異性檢測

以5種目標病原菌基因組DNA為模板，分別以常見的土傳病原菌終極腐霉、灰葡萄孢、茄病鐮刀菌、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種和丁香假單胞菌等非目標病菌基因組DNA及ddH2O為陰性對照，檢測設(shè)計的5對引物的特異性。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR Mix 12.5 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O補足25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃5 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃3 0 s；循環(huán)30次；72℃10 min。并利用Clone Manager對引物進行比對進一步驗證引物特異性。

1.6 多重PCR反應(yīng)體系的建立及條件優(yōu)化

在常規(guī)PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上，同時加入5種目標病原菌的基因組DNA和特異性引物，對影響多重PCR擴增的重要因素進行優(yōu)化。引物用量設(shè)置如表2，不同反應(yīng)體系中分別加入相應(yīng)體積的每條引物。退火溫度分別設(shè)置為52℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、62℃、64℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像儀進行拍照，篩選出最佳PCR體系。

表2 多重PCR反應(yīng)體系中引物體積及終濃度

Tab.2 Volume and concentration of primers used in multiplex PCR

1.7 多重PCR特異性驗證

采用設(shè)計的5對引物優(yōu)化的PCR體系，分別加入一種及多種目標病原菌DNA組合驗證多重PCR特異性。

1.8 多重PCR靈敏度檢測

煙草青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌、根黑腐病菌及黑脛病菌的基因組DNA提取物的濃度分別為114 ng/μL、159 ng/μL、172 ng/μL、129 ng/μL、183 ng/μL。使用DeNOVIX儀器將其濃度調(diào)至100 ng/μL，然后進行2～10倍梯度稀釋，共6個梯度（10 ng 、1 ng、500 pg、100 pg、10 pg、1 pg），以5種病原菌10 ng～1 pg范圍內(nèi)的基因組DNA作為模板，分別加入5種病原菌及其引物進行單重PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR Mix 12.5 μL，DNA模板 1 μL，引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。再以5種病原菌10 ng～1 pg范圍內(nèi)的基因組DNA為模板，每個反應(yīng)中加入5種病原菌的基因組DNA和5對引物，多重PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR Mix 12.5 μL，5種DNA模板各1 μL，引物Sf1/Sr1、Ff1/Fr1、Pf1/Pr1各0.3 μL、Rf1/Rr1各1.8 μL、TBf1/TBr1各1 μL，加ddH2O補足25 μL。按照優(yōu)化的PCR程序進行擴增。

1.9 帶菌土壤和植株樣品的多重PCR檢測

1.9.1 人工接種樣品的多重PCR檢測

在種植煙草的田塊采集土壤，置于121℃下濕熱滅菌30 min，分別將煙草黑脛病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌單獨和混合后加入土壤中，得到人工接種的陽性土壤樣品，滅菌后的田間土壤樣品為陰性土壤樣品。另外按照1.3中的方法將以上5種病菌分別接種至煙株上，待發(fā)病后將單獨采集的病組織和混合的病組織作為人工接種的陽性植株樣品，健康煙株組織為陰性植株樣品。采用土壤DNA提取試劑盒和植株DNA提取試劑盒分別提取土壤和植株樣品DNA。按照優(yōu)化PCR反應(yīng)體系進行多重擴增。

1.9.2 田間樣品的多重PCR檢測

從廣西賀州市、靖西市、廣西大學(xué)農(nóng)科基地隨機采集煙田根系周圍的土壤，并對表現(xiàn)局部或全株萎蔫的煙株，采集根莖部或莖基部或莖干維管束呈現(xiàn)褐變的組織，陰性對照為廣西大學(xué)玻璃溫室的健康煙株。對田間采集的9份煙田土壤和12份煙草病株樣品以及對照，采用土壤DNA提取試劑盒和植株DNA提取試劑盒分別提取煙田土壤和煙株DNA，采用本研究建立的多重PCR體系，對田間樣品進行五重PCR檢測。

2 結(jié)果和分析

2.1 目標菌株的驗證

ITS擴增的煙草黑脛病菌、根腐病菌、根黑腐病菌、立枯病菌與16S rDNA擴增青枯病菌的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后，在NCBI網(wǎng)站上的GenBank同源性比對結(jié)果顯示，其與相對應(yīng)病原菌的同源性都達到100%。致病性測定結(jié)果表明，這5種病原菌均可使煙草發(fā)生相應(yīng)病害。說明供檢測的目標病原菌鑒定無誤。

2.2 單重PCR特異性驗證結(jié)果

如圖1所示，以5種病原菌的DNA作為模板，用相應(yīng)的引物經(jīng)PCR擴增分別得到424 bp、316 bp、219 bp、139 bp、110 bp的特異性條帶，與預(yù)期片段一致，而在胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種、丁香假單胞菌、灰葡萄孢、茄病鐮刀菌、終極腐霉等非目標病菌和陰性對照中均未能擴增出條帶。說明引物特異性高，可用于多重PCR檢測。利用Clone Manager引物比對結(jié)果顯示設(shè)計的引物均只能在該病原菌全基因組上找到位點。

注：A-E：泳道1-10：依次為茄科雷爾氏菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、基生根串珠霉、煙草疫霉、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種、丁香假單胞菌、灰葡萄孢、茄病鐮刀菌和終極腐霉，A-E代表以上每種病原菌DNA模板中分別加入引物Sf1/Sr1、Rf1/Rr1、Ff1/Fr1、Tbf1/Tbr1和Pf1/Pr1；F：泳道1-5：ddH2O中分別加入引物Sf1/Sr1、Rf1/Rr1、Ff1/Fr1、Tbf1/Tbr1和Pf1/Pr1。

2.3 多重PCR反應(yīng)體系的建立及條件優(yōu)化結(jié)果

引物用量會影響多重PCR的擴增效率，如圖2的1泳道所示，當引物濃度一樣，立枯病菌和根黑腐病菌無目標條帶，通過逐漸降低青枯病菌、根腐病菌以及黑脛病菌的引物用量，同時增加立枯病菌引物用量，立枯病菌和根黑腐病菌條帶逐漸清晰，結(jié)果如圖2的8泳道所示，當Sf1/Sr1、Ff1/Fr1、Pf1/Pr1各0.3 μL，Rf1/Rr1各1.8 μL，TBf1/TBr1各1 μL時，能獲得5條清晰的條帶，應(yīng)為最佳引物濃度。此外，如圖3所示，退火溫度從52℃到62℃均可擴增出5條條帶，55℃到58℃時條帶清晰；當退火溫度≥64℃時，多重PCR已不能擴增出青枯病菌和根腐病菌的目的條帶。綜合引物特異性和條帶清晰度，本研究設(shè)定58℃為最佳退火溫度。

圖2 多重PCR引物濃度的優(yōu)化

注：泳道1-10：退火溫度：52℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、62℃、64℃。

2.4 多重PCR特異性驗證結(jié)果

如圖4所示，多重PCR反應(yīng)隨機擴增以及這5種病原菌，均能擴增得到與目標片段大小一致的條帶，說明這5對引物之間不會互相產(chǎn)生影響，檢測特異性強。

注：A：泳道1-5：依次為煙草疫霉、基生根串珠霉、尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和茄科雷爾氏菌；B：泳道1-3：兩種不同病原菌的組合；泳道4和5：三種不同病原菌的組合；泳道6和7：四種不同病原菌的組合；泳道8：5種不同病原菌的組合；N：ddH2O。

2.5 多重PCR靈敏度檢測結(jié)果

單重PCR靈敏度檢測結(jié)果如圖5A-E所示，煙草青枯病菌和根腐病菌的檢測極限為10 pg/μL，立枯病菌、根黑腐病菌和黑脛病菌的檢測極限為100 pg/μL。多重PCR靈敏度檢測結(jié)果如圖5F所示，與單重PCR相比，青枯病菌的檢測極限降低了一個數(shù)量級，立枯病菌、根腐病菌、根黑腐和黑脛病菌的檢測極限與單重PCR的一致，能夠同時檢測到5種病原菌的靈敏度為100 pg/μL。

注：A-E：單重PCR中對引物Sf1/Sr1、Rf1/Rr1、Ff1/Fr1、Tbf1/Tbr1和Pf1/Pr1進行單獨的靈敏度測定；F：多重PCR的靈敏度測定；A-C：泳道1-5：基因組濃度分別為10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL；D-F：泳道1-6：基因組濃度分別為10 ng/μL、1 ng/μL、500 pg/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL。

2.6 人工接種樣品的多重PCR檢測結(jié)果

人工接種土壤和植株樣品檢測結(jié)果如圖6所示，陽性土壤和植株樣品均能擴增出目的條帶，陰性土壤和植株樣品無條帶。表明本研究建立的多重PCR方法可應(yīng)用于后續(xù)田間樣品檢測。

注：A為人工接種的陽性土壤樣品，其中泳道1為五重陽性對照，泳道2為陰性土壤樣品，泳道3-8為陽性土壤樣品；B為人工接種的陽性植株樣品，其中泳道1為五重陽性對照，泳道2為健康煙草植株樣品，泳道3-8為陽性植株樣品。

2.7 田間樣品的多重PCR檢測結(jié)果

如圖7所示，在田間采集的9份土壤和12份發(fā)病煙株樣品中，6份土壤和8份病株樣品中檢測出青枯病菌，1份植株樣品中檢測出立枯病菌，1份土壤和7份病株樣品檢測出根腐病菌，1份土壤樣品中檢測出根黑腐病菌，3份病株樣品中檢測出黑脛病菌，2份土壤中未見目標菌，檢測結(jié)果與分離培養(yǎng)結(jié)果相吻合。通過檢測發(fā)現(xiàn)，田間存在2種甚至3種土傳病原菌復(fù)合侵染現(xiàn)象。因此，本研究建立的多重PCR體系可用于田間煙草青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌、根黑腐病菌以及黑脛病菌的快速檢測。

注：A：賀州市樣品；B：靖西市樣品；C：廣西大學(xué)農(nóng)科基地樣品；泳道1：五重陽性對照；泳道2：健康煙草植株；泳道3-5：土壤樣品；泳道6-9：植株樣品。

3 討論

多重PCR技術(shù)是在同一反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，其原理與常規(guī)PCR相同。在病害研究中，主要應(yīng)用于多種病原物的同步檢測。與常規(guī)PCR相比，多重PCR具有成本低、檢測效率高等優(yōu)點[13]。目前運用多重PCR檢測煙草病原菌的研究中，陸星星等報道了煙草黑脛病菌、根黑腐病菌和根腐病菌的多重PCR檢測[14]。劉萍花等開展了煙草黑脛病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌及立枯病菌的多重PCR檢測[15]。張麗芳等建立了能夠同步檢測煙草青枯病菌、黑脛病菌和猝倒病菌的多重PCR檢測[16]。但不同煙草種植區(qū)域病害種類有所不同，病原菌分布不一致，需要根據(jù)當?shù)夭『Πl(fā)生情況設(shè)計相應(yīng)病原菌組合的多重PCR體系。廣西高溫高濕的氣候特點有利于多種煙草土傳病害的發(fā)生，以黑脛病和青枯病為主，立枯病、根腐病、根黑腐病等在局部區(qū)域分布。本研究建立了一種同時檢測更多病原菌種類的多重PCR方法，能夠同時檢測田間病株和土壤中煙草黑脛病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌，進一步提高了檢測效率，并能更好地服務(wù)于當?shù)責煵蒉r(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

多重PCR分子檢測技術(shù)中，引物的特異性、引物濃度、反應(yīng)條件的退火溫度等都對多重PCR擴增結(jié)果有很大影響。為每個目的病原菌設(shè)計出特異性引物，保證各病原菌引物之間沒有交叉反應(yīng)是成功的關(guān)鍵[17]。引物的選擇不僅影響多重PCR擴增的特異性，還影響多重PCR檢測的靈敏度。應(yīng)選擇高度保守基因，保證所設(shè)計的引物具有種間特異性和種內(nèi)通用性的特點，避免因種內(nèi)不同菌株間變異引起的檢測難題。但由于物種之間的16S rDNA或ITS序列相似度能高達98%以上，因此相近物種之間可能會出現(xiàn)假陽性。茄科雷爾氏菌基因序列因其高度保守的特點，被廣泛應(yīng)用于土壤中青枯菌的檢測[18]。立枯絲核菌基因中的內(nèi)含子較少，在位置上也高度保守，與ITS相比具有更高的系統(tǒng)發(fā)育信息，曾被用來研究絲核菌屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[19]。尖孢鐮刀菌基因能夠很好保證種間特異性，又能兼具種間通用性，張陽等利用基因設(shè)計尖孢鐮刀菌特異性引物建立了草莓根腐病的多重PCR檢測體系[20]。根串珠霉基因及表達調(diào)控在不同物種間都具有高度保守性，曾被用來研究煙草根黑腐菌的遺傳多樣性分析[21]。煙草疫霉基因在進化上高度保守，潘明森等利用基因設(shè)計引物，實現(xiàn)了對土壤中煙草黑脛病菌的定量檢測[12]。其次，引物擴增片段的大小應(yīng)存在一定差異，便于區(qū)分。本研究通過對引物的篩選，最后根據(jù)煙草青枯病菌的基因、煙草立枯病菌的基因、煙草根腐病菌的基因、煙草根黑腐病菌的基因分別設(shè)計了引物，并結(jié)合潘明森等報道的煙草黑脛病菌基因的特異性引物，篩選出最適合多重PCR的引物組合。除引物設(shè)計外，引物濃度對多重PCR擴增也很重要，必須保證所有的引物具有相似的擴增效率[22]。本研究首先針對每對引物選定同樣的用量，后根據(jù)各對引物擴增的效率逐漸調(diào)整引物用量，最終使每對引物對各自目標具有同樣的擴增效率，成功建立煙草土傳病害的五重PCR體系。退火溫度對多重PCR擴增質(zhì)量影響也很大，合適的退火溫度可以保證引物的特異性以及條帶的清晰度，在條帶清晰的基礎(chǔ)上選擇較高的退火溫度，這樣只有匹配程度高的堿基才能結(jié)合到模板上，檢測特異性越強[23]。已報道煙草病菌四重和三重PCR體系中的退火溫度分別為56℃和61℃[15-16]，本文選擇的退火溫度為58℃。另外，本研究建立的多重PCR體系對混合DNA檢測的靈敏度達到了100 pg/μL，高于張麗芳等建立的煙草青枯病、黑脛病和猝倒病的多重PCR檢測體系的靈敏度（1.01 ng/μL）。本研究建立的煙草土傳病害的五重PCR體系降低了檢測的時間和成本，提高了檢測的靈敏性。

此外，本試驗建立的五重PCR體系還可用于土壤和煙株中這5種病原菌的同步檢測，克服了土壤和病害潛伏期及發(fā)病初期植株中含菌量低、多種非致病菌干擾等弊端，并且易于發(fā)現(xiàn)不同土傳病原菌的復(fù)合侵染情況，從而為煙草土傳病害以及同種病原菌引起的其他作物病害的快速診斷、早期監(jiān)測預(yù)警以及防控提供有力依據(jù)。

4 結(jié)論

通過引物設(shè)計、條件優(yōu)化和田間應(yīng)用檢驗，本研究建立了煙草土傳病害的五重PCR檢測體系。該體系能夠快速、準確地檢測田間病株和土壤中的黑脛病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌以及根黑腐病菌，為煙草土傳病害的早期診斷提供了依據(jù)。

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Rapid detection of five soil-borne pathogens in tobacco by multiplex PCR

SHU Fangling1, FAN Dongsheng2, ZHANG Deping2, LAN Dayu1, LIN Wei1, LU Yanhui2, YUAN Gaoqing1*

1 College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004;2 Guangxi Zhuang Autonomous Region Tobacco Company, Nanning 530022

[] The aim of this study was to develop a multiplex PCR assay for simultaneous detection of five important soil-borne pathogens in tobacco, including,,,and. [] Five pairs of specific primers were selected to analyze the influencing factors of five-plex PCR. The primer concentration and annealing temperature were optimized, and the sensitivity of the system was detected. Then the soil and plant samples were tested to verify the utility of the five-plex PCR detection system. [] The primers were designed based on thegene of, thegene of, thegene ofand thegene of. Combined with reported specific primer forgene of, a multiplex PCR detection methods of five soil-borne pathogens of tobacco were successfully established. The reaction system with total volume of 25 μL contained 0.3 μL of Sf1/Sr1, Ff1/Fr1, Pf1/Pr1, 1.8 μL of RF1/Rr1, 1 μL of TBf1/TBr1 respectively, 2×PCR Mix at 12.5 μL. The annealing temperature was 58℃, and the detection limitation was 100 pg/μL. [] The five-plex PCR detection system established in this study can quickly detect,,,,in the infected plant and soil, which provides a basis for early diagnosis and effective control of tobacco soil-borne diseases.

tobacco; soil-borne diseases; molecular detection; five-plex PCR

. Email：ygqtdc@sina.com

舒芳玲，范東升，張得平，等. 煙草五種土傳病原菌的多重PCR快速檢測[J]. 中國煙草學(xué)報，2022，28（5）.

SHU Fangling, FAN Dongsheng, ZHANG Deping, et al. Rapid detection of five soil-borne pathogens in tobacco by multiplex PCR[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(5).

10.16472/j.chinatobacco. 2022.T0023

中國煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司科技計劃項目“廣西煙草重要病害監(jiān)測及關(guān)鍵技術(shù)研究”（202045000020084）

舒芳玲（1996—），碩士研究生，主要研究方向：植物病害的綜合防治，Tel：18225839902，Email：2368238770@qq.com

袁高慶（1971—），副教授，Tel：0771-3235612，Email：ygqtdc@sina.com

2022-01-27；

2022-06-21