乳酸菌發(fā)酵鐵皮石斛活性成分與抗氧化功能動態(tài)分析

黃 慶，林華嗣，王國鑫，胡曉波

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西九草鐵皮石斛科技協(xié)同創(chuàng)新有限公司，江西 鷹潭 335000)

鐵皮石斛是一種蘭科石斛屬草本植物，主要分布于我國云南、廣西、貴州、浙江、江西等地的山區(qū)[1]，并享有“救命仙草”的美譽。許多研究表明，鐵皮石斛含有多糖、礦物質、氨基酸、石斛堿、多酚、黃酮等營養(yǎng)成分[1-3]，具有降血糖、調節(jié)腸道菌群、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力等多種活性功能。鐵皮石斛作為一種食藥同源品種，主要被加工成鐵皮楓斗，或浸酒、燉湯。隨著人工種植技術的突破，鐵皮石斛的產量不斷增加，如何對鐵皮石斛進行現代化加工成為迫切需要解決的問題。

發(fā)酵作為一種傳統(tǒng)的食品加工方法，通過微生物的作用可降解抗營養(yǎng)因子，生成生物活性物質，增加活性成分的生物利用度[4,5]。例如，酵母菌發(fā)酵鐵皮石斛水提液能降低多糖的分子量，提高石斛發(fā)酵液的生理活性[6]。通過發(fā)酵得到的鐵皮石斛多糖具有良好的自由基清除能力，以及出色的金屬螯合活性[7]。在芒果皮的發(fā)酵中，乳酸菌作為活性發(fā)酵劑能提高發(fā)酵液中的總酚含量[8]。王丹等[9]研究發(fā)現采用乳酸菌、霉菌等不同菌種發(fā)酵鐵皮石斛粗多糖水提液，能提高其抗氧化活性和降血糖活性。有研究發(fā)現混菌發(fā)酵通過多菌種協(xié)同發(fā)酵作用，使發(fā)酵液具有更豐富的風味和柔和的口感，含更多的活性功能成分，同時還可以使產品保持較高的貯藏品質[10]。

鐵皮石斛為開發(fā)健康食品提供了良好的來源，如鐵皮石斛酸奶[11]、鐵皮石斛紅棗復合功能性果汁[12]等。實驗以鐵皮石斛鮮條為原料，乳酸菌為發(fā)酵菌種，對鐵皮石斛汁發(fā)酵過程中的活性成分以及抗氧化能力進行動態(tài)分析。目的在于分析乳酸菌在發(fā)酵過程中對鐵皮石斛品質的影響以及了解鐵皮石斛乳酸菌發(fā)酵飲品的潛在營養(yǎng)價值，為開發(fā)高活性乳酸菌飲料提供一定的可行性分析和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛：江西軒斛生物科技有限公司提供。

植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌：山東中科嘉億生物工程有限公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、福林酚、沒食子酸、瓊脂購自北京索萊寶科技有限公司；2,2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、水楊酸購自阿拉丁；蘆丁(上海源葉生物科技有限公司)，其他藥品試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

SW-CJ雙人凈化工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；PHS-2F型數字pH計，上海精密儀器有限公司；ZQTY-70E振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；BSP-100生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TU-1810DAPC紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；TGL216G高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JS-THERMO多功能酶標儀，美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菌種的活化

將植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌接種于100 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后進行二次傳代，菌種充分活化后的種子菌液放4 ℃冰箱保存。

1.3.2 鐵皮石斛發(fā)酵原液的制備

將洗凈的鐵皮石斛切斷，沸水滅酶2～3 min，將燙漂好的鐵皮石斛段與蒸餾水按照料液比1:10打汁，置于250 mL無菌錐形瓶85 ℃，20 min滅菌。

1.3.3 接種與發(fā)酵

選擇植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌(植+嗜)，植物乳桿菌+副干酪乳桿菌(植+副)，嗜酸乳桿菌+副干酪乳桿菌(嗜+副)3種混菌發(fā)酵以1:1的比例接種2%(v/v)的活化菌液，在37 ℃恒溫發(fā)酵72 h。發(fā)酵過程中在12，24，36，48，72 h進行取樣，于4 ℃冰箱保存。

1.3.4 測定指標及方法

1.3.4.1 乳酸菌活菌數的測定

根據GB4789.35-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》進行測定。

1.3.4.2 pH的測定

使用pH計對發(fā)酵過程中pH值的變化進行測定。

1.3.4.3 總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[13]進行測定，略有改動。取25 μL發(fā)酵液至25 mL具塞試管中用蒸餾水補足至1 mL，在通風櫥中依次加入5%苯酚試劑1 mL，濃硫酸5 mL，混合均勻，沸水浴20 min后立刻冰水浴5 min，488 nm處測量吸光值。線性回歸方程：y=48.75x+03557，R2=0.9994。

1.3.4.4 總酚含量的測定

采用福林酚法[14]進行測定，略有改動。取0.8 mL發(fā)酵液至25 mL具塞試管中，依次加入0.3 mL福林酚試劑，1.5 mL 7%碳酸鈉溶液后用蒸餾水補足至10 mL，避光反應20 min后測量760 nm處的吸光度。線性回歸方程：y=0.0986x+00606，R2=0.9995。

1.3.5 抗氧化能力的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考文獻[15]并加以改進，取100 μL的發(fā)酵液，100 μL,0.1 mmol·L-1的DPPH-95%乙醇溶液加入96孔板中，37 ℃避光反應30 min，用去離子水做參比，在517 nm下測定吸光值。空白組將去離子水替代發(fā)酵液，對照組將95%乙醇替代DPPH-95%乙醇溶液。

1.3.5.2 羥基自由基清除能力的測定

參考文獻[16]并加以改進，向96孔板依次加入9 mmol·L-1FeSO450 μL，9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液30 μL，發(fā)酵液20 μL，8.8 mmol·L-1H2O240 μL和50 μL去離子水，充分混勻，37 ℃避光反應15 min，510 nm處測定吸光值，用去離子水做參比?？瞻捉M將去離子水替代發(fā)酵液，對照組用無水乙醇替代水楊酸-乙醇溶液。

1.3.5.3 ABTS自由基清除能力的測定

參考文獻[17]并加以改進，取5 mL、7 mmol·L-1的ABTS溶液，加入88 μL 140 mmol·L-1的過硫酸鉀溶液混合均勻，室溫下過夜避光反應，得到ABTS工作母液。用去離子水對其進行適當的稀釋，使其在734 nm處的吸光值為0.7±0.02，得到最終的ABTS工作液。取30 μL發(fā)酵液，200 μL ABTS工作液加入到96孔板中充分混勻后37 ℃避光反應6 min，在734 nm下測得吸光值?？瞻捉M將去離子水替代發(fā)酵液，對照組用去離子水替代ABTS工作液。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵液中活菌數的變化

由圖1可知，3種乳酸菌混菌發(fā)酵液的活菌數有相同的變化趨勢。在發(fā)酵前期均沒有出現明顯的滯后期，說明鐵皮石斛是乳酸菌生長繁殖的良好底物。在發(fā)酵前中期活菌數呈現指數性增長，并在24 h處達到最大值8.72 lg(CFU/mL)，隨后發(fā)酵進入衰亡期，活菌數出現不同程度的下降并最終保持穩(wěn)定。在紅甜菜和枸杞汁的研究中乳酸菌活菌數也有相同的變化過程[18,19]。發(fā)酵進入衰亡期的原因主要與發(fā)酵基質以及發(fā)酵環(huán)境有關，未額外添加碳源會導致營養(yǎng)物質快速消耗，pH的不斷下降也制約著乳酸菌的繁殖[20]。在整個發(fā)酵周期中，3種混菌發(fā)酵液的活菌數均能達到8.00 lg(CFU/mL)，顯著高于起始值，且直到發(fā)酵終點仍保留有7.00 lg(CFU/mL)的活菌數目，能發(fā)揮一定的益生作用。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)圖1 鐵皮石斛發(fā)酵過程中活菌數的變化Fig.1 Change of viable bacteria count during dendrobium officinale fermentation

2.2 發(fā)酵過程中pH的變化

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵液的pH值呈現出不斷下降的變化，這是因為在發(fā)酵過程中乳酸菌產生了各種有機酸，比如檸檬酸、蘋果酸和乳酸等[21]。結果顯示pH在乳酸菌的指數生長期快速下降，說明產酸能力強，這與前人的研究一致[22]。在發(fā)酵過程中，植+嗜的pH下降速率低于其他兩組，造成結果的原因可能是乳酸菌產酸能力的差異，每一種乳酸菌都有不同的代謝酶系，有機酸的產生和轉化主要與乳酸菌的糖酵解代謝和半乳糖代謝途徑有關[23]。與發(fā)酵初始值相比，發(fā)酵后的pH顯著下降，最低可達3.15。試驗選擇的乳酸菌在鐵皮石斛汁中都能發(fā)揮較強的產酸能力。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)圖2 鐵皮石斛發(fā)酵過程中pH的變化Fig 2 Change of pH during Dendrobium officinale fermentation

2.3 發(fā)酵過程中活性成分的變化

2.3.1 總糖含量的變化

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的增加總糖含量不斷下降。在整個發(fā)酵周期總糖含量整體上是呈下降趨勢的，在發(fā)酵后期趨于平緩。發(fā)酵72 h后發(fā)酵液(植+嗜)和發(fā)酵液(植+副)總糖含量分別降低了42.31%和40.72%，而發(fā)酵液(嗜+副)只降低了24.89%。下降的原因是隨著乳酸菌的不斷增長，發(fā)酵液中的糖類被微生物利用[5]。從結果可以看出，3種混菌發(fā)酵對總糖的影響程度各不相同，這是因為不同的菌有不同的代謝途徑。多糖含量是鐵皮石斛功能活性的考察指標之一，在發(fā)酵過程中可以嘗試通過補加碳源作為底物，以抑制多糖含量的降低。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)圖3 鐵皮石斛發(fā)酵過程中總糖含量的變化Fig 3 Change of total sugar content in Dendrobium officinale during fermentation

2.3.2 總酚含量的變化

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的增加，鐵皮石斛發(fā)酵樣液中的總酚含量不斷增加，在24 h處達到最大值，分別達到34.00(植+嗜)，34.32(植+副)，35.32 mg·L-1(嗜+副)，隨后開始下降，發(fā)酵結束總酚含量仍然高于未發(fā)酵的鐵皮石斛汁。由此可見，乳酸菌發(fā)酵能明顯提高鐵皮石斛汁中的總酚含量。其原因可能是乳酸菌在代謝過程中通過解聚或者相關酶的作用影響著多酚類物質含量[24,25]。在發(fā)酵后期，總酚不斷下降可能的原因是乳酸菌進入衰亡期，代謝活動減弱導致多酚的增加量減少，以及與一些大分子物質發(fā)生相互作用，產生沉淀以及被氧化，導致多酚物質的損失[9]。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)圖4 鐵皮石斛發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig 4 Change of total phenolic content in Dendrobium officinale during fermentation

2.4 發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化

2.4.1 DPPH自由基清除能力的變化

由圖5可知，經過乳酸菌的發(fā)酵可以顯著提高鐵皮石斛汁的DPPH自由基清除能力，在0～72 h過程中發(fā)酵液的清除能力總體呈現先增加后保持穩(wěn)定或略有下降。植+嗜、植+副、嗜+副發(fā)酵液分別在48，36和24 h達到最大值，其中嗜+副對DPPH自由基的清除能力在發(fā)酵24 h處達62.84%，比發(fā)酵前提高了90.60%。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。圖5 鐵皮石斛發(fā)酵液DPPH自由基清除能力Fig 5 DPPH free radical scavenging capacity of fermented Dendrobium officinale

不同的菌有不同的發(fā)酵特性，從而導致最佳的發(fā)酵時間清除能力有所不同。研究表明DPPH自由基的清除能力與咖啡酸、蘆丁和肉桂酸的含量呈顯著正相關[26]。乳酸菌發(fā)酵提高了鐵皮石斛發(fā)酵液的多酚，可能是其清除DPPH自由基能力提高的原因之一；但同時活性多糖含量、分子量下降[27]也會影響其抗氧化效果，所以活性多糖含量和分子量的變化對其抗氧化能力的影響，還需深入研究。

2.4.2 羥基自由基清除能力的變化

由圖6可知，乳酸菌發(fā)酵能提高鐵皮石斛汁的羥基自由基清除能力，在整個發(fā)酵過程中其變化趨勢與DPPH自由基清除能力類似。發(fā)酵樣液植+副和嗜+副在24 h處達到最大值分別為64.24%和68.21%，而植+嗜在36 h達到最大值66.22%，其中增幅最高的是嗜+副32.73%。不同發(fā)酵液的羥基自由基清除能力不同，自由基的清除能力不僅僅與多酚含量有關，可能還與多酚的組成不同有關[28]。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。圖6 鐵皮石斛發(fā)酵液羥基自由基清除能力Fig 6 Hydroxyl free radical scavenging capacity of fermented Dendrobium officinale

2.4.3 ABTS自由基清除能力的變化

由圖7可知，鐵皮石斛發(fā)酵液的ABTS自由基清除能力變化情況與DPPH自由基和羥基自由基相似，其中增幅最高可達41.42%(植+副)。同樣的ABTS自由基清除能力的提高可能和多酚有關，相關研究中得出發(fā)酵后的多酚提取物能顯著提高ABTS自由基的清除率[29]。3種混菌對自由基清除的影響具有顯著性差異，這可能是發(fā)酵液中多酚組成的影響，以及每種多酚化合物對自由基清除能力的貢獻具有差異性[30]。

t/h注：不同的小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。圖7 鐵皮石斛發(fā)酵液ABTS自由基清除能力Fig 7 ABTS free radical scavenging capacity of fermented Dendrobium officinale

2.5 發(fā)酵鐵皮石斛汁活性成分與抗氧化能力相關性分析

由表1可知，發(fā)酵液(植+副)的總酚含量與羥基自由基清除率和ABTS自由基清除率呈顯著正相關性，發(fā)酵液(嗜+副)的總酚含量與羥基自由基清除率呈顯著正相關性(p<0.05)；發(fā)酵液(植+副)的總糖含量與DPPH自由基清除率呈極顯著負相關性(p<0.05)，(嗜+副)的總糖含量與ABTS自由基清除率呈顯著負相關性，其他自由基清除率與總糖含量無明顯相關性。有研究[31]發(fā)現抗氧化活性主要與酚酸和黃酮含量密切相關；黃凱偉等[32]的研究推測多糖含量與抗氧化活性無相關性的原因是由于鐵皮石斛水溶性多糖抗氧化活性差造成的。從相關性分析結果來看酚類物質在提高發(fā)酵液抗氧化能力中起重要作用。

表1 發(fā)酵液活性成分與抗氧化能力相關性分析Tab 1 Correlation analysis between active components and antioxidant capacity

3 結論與討論

研究采用3個混菌組發(fā)酵鐵皮石斛汁，結果表明3個混菌組中的乳酸菌均能在鐵皮石斛汁中良好生長，在整個發(fā)酵過程中(0～72 h)，pH下降明顯；總糖含量呈現不同的下降趨勢，其中嗜+副的總糖消耗最少；同時，嗜+副發(fā)酵后活菌數、總酚、對DPPH自由基的清除能力和羥基自由基的清除能力提高最多。后續(xù)試驗可以通過額外添加碳源，減少乳酸菌對總糖的消耗，提高乳酸菌的生物轉化效率，進一步提升鐵皮石斛的開發(fā)品質。

在體外抗氧化能力中，發(fā)酵液對DPPH自由基的清除能力的增幅要高于羥基自由基清除能力和ABTS自由基清除能力，不同的混菌發(fā)酵有不同的提升效果，且最佳發(fā)酵時間也各不相同。經過乳酸菌的發(fā)酵，鐵皮石斛汁的抗氧化能力有不同程度的增大，可能與多酚類物質的增加和組成有關；有研究表明乳酸菌發(fā)酵將大分子多糖轉化成活性更強的小分子多糖也可能提高其抗氧化能力，乳酸菌產生的胞外多糖也具有一定程度的抗氧化活性。發(fā)酵過程中，活性多糖和多酚對其抗氧化能力的影響，還需深入研究。

綜上所述，3種乳酸菌混菌發(fā)酵均能在不同程度上改善鐵皮石斛汁的品質，不同的混菌發(fā)酵有不同的最佳發(fā)酵時間，且發(fā)酵12～36 h是比較適宜的。乳酸菌發(fā)酵鐵皮石斛不僅能顯著改善鐵皮石斛汁的品質，也賦予鐵皮石斛汁獨特的功能活性。此外，由于整個發(fā)酵過程沒有使用食品添加劑，試驗可為開發(fā)鐵皮石斛乳酸菌發(fā)酵清潔標簽食品提供一定的數據支持和理論依據。發(fā)酵可作為增強鐵皮石斛功能和開發(fā)鐵皮石斛健康品的重要手段之一。