指紋圖譜結(jié)合一測多評法測定金銀花葉的化學(xué)成分

寧二娟， 張麗先， 陳 玲， 李智寧， 王 偉， 李 曉

（河南省科學(xué)院河南省納普生物技術(shù)有限公司，鄭州 450002）

金銀花是忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的花蕾或帶初開的花，和忍冬藤皆為我國傳統(tǒng)中藥. 金銀花葉為金銀花和忍冬藤的副產(chǎn)物，產(chǎn)量遠大于金銀花. 金銀花葉中富含環(huán)烯醚萜類、黃酮類、酚酸類等成分［1-3］，具有抗氧化、抑菌消炎、清熱解毒等藥理活性［4-6］.

目前，關(guān)于金銀花葉成分含量測定的研究多集中在酚酸類和黃酮類成分［7-8］，對環(huán)烯醚萜類成分的研究相對較少. 本研究將指紋圖譜和多指標(biāo)成分測定方法相結(jié)合，建立金銀花葉的高效液相指紋圖譜. 采用一測多評法（Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker，QAMS），選用綠原酸為參照物，并建立其與新綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C的相對校正因子，從一年12個月份中的金銀花葉中首次發(fā)現(xiàn)斷氧化馬錢苷酸，并對金銀花葉中的斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸和斷氧化馬錢子苷含量進行了測定，為金銀花葉的質(zhì)量控制以及采收期提供數(shù)據(jù)分析及理論依據(jù).

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相系統(tǒng)（PDA/UV）、Agilent 1290 型液相色譜-6460 型三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)（包括DAD）、Shimadzu LC-20AD 高效液相系統(tǒng)（UV）.

1.2 對照品

木犀草苷（批號111720-201810，質(zhì)量分數(shù)93.5%）、異綠原酸C（批號111894-202103，質(zhì)量分數(shù)95.2%）、綠原酸（批號110753-202018，質(zhì)量分數(shù)96.1%）、馬錢苷（批號111640-201707，質(zhì)量分數(shù)99.2%）、鞣花酸（批號111959-201903，質(zhì)量分數(shù)88.8%），購于中國食品藥品檢定研究院；斷氧化馬錢子苷（批號21061505，質(zhì)量分數(shù)98.16%），購于成都格利普生物科技公司；野漆樹苷（批號17061305，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、異綠原酸B（批號21012902，質(zhì)量分數(shù)98.68%），購于成都普菲德公司；新綠原酸（批號wkq18030107，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、異綠原酸A（批號wkq18090301，質(zhì)量分數(shù)≥98%），購于四川維克奇生物科技有限公司；斷馬錢子酸（批號CFS201802，質(zhì)量分數(shù)≥98%），購于武漢中標(biāo)科技公司；斷氧化馬錢苷酸（批號PRF21102243，質(zhì)量分數(shù)≥98%），購于成都普瑞法科技公司.

1.3 試劑

乙酸、甲醇、乙醇均為分析純；色譜乙腈，購于賽默飛世爾科技公司.

1.4 樣本

樣本采自河南封丘同一地塊的金銀花葉（一年中每個月采一次，分別標(biāo)記），于通風(fēng)處陰干；經(jīng)河南省科學(xué)院趙天增研究員鑒定確為忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的葉子（表1）.

表1 金銀花葉樣本Tab.1 12 batches of leaves of Lonicera japonica from Fengqiu area

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent色譜柱：型號Eclipse XDB-C18（250×4.6 mm，5 μm）.

流動相：乙腈（A）-0.1%乙酸水（B）. 梯度條件：0～20 min，A5%～17%，B95%～83%；20～26 min，A17%，B83%；26～35 min，A17%～21%，B83%～79%；35～40 min，A21%～25%，B79%～75%.

柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長240 nm，進樣體積10 μL.

2.2 混合對照品溶液的制備

稱取新綠原酸、綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C對照品于同一量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度處，搖勻，即得混合對照品儲備液. 吸取此儲備液適量于另一20 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，得混合對照品溶液.

2.3 樣品溶液的制備

陰干的金銀花葉研為細粉過3號篩. 取粉末狀金銀花葉0.5 g置三角瓶中，加入50%乙醇溶液50 mL并稱重；超聲30 min，放至室溫，再稱重，用50%乙醇溶液補重，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜，即得樣品溶液.

混合對照品溶液和樣品溶液的HPLC圖譜見圖1.

圖1 混合對照品和樣品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance solution and sample solution

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍考察

線性系列溶液：吸取混合對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1 mL，分別置于20、20、10、5 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，標(biāo)記為線性①、②、③、⑤溶液；以“2.2”項下的混合對照品溶液為線性④溶液.

吸取以上線性溶液進樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進樣濃度為橫坐標(biāo)（X），得回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表2.

表2 金銀花葉中12種成分的線性回歸方程Tab.2 Linear regression equations of 12 components in Lonicera japonica leaves

2.4.2 精密度試驗

取線性④溶液，連續(xù)進樣測定6次，結(jié)果12種成分對照品的RSD值依次為1.86%、0.74%、0.91%、1.02%、1.25%、1.90%、1.37%、1.77%、1.13%、1.30%、1.46%、1.55%，表明該儀器的精密度良好.

2.4.3 重復(fù)性試驗

取金銀花葉（S4），平行制得6份樣品溶液，進樣測定，用外標(biāo)法分別計算各指標(biāo)成分的含量. 得12種成分的質(zhì)量分數(shù)依次為0.045%、2.056%、1.770%、0.607%、0.033%、0.650%、0.016%、0.328%、0.355%、1.421%、0.236%、0.080%；RSD 值分別為2.63%、0.61%、0.77%、0.89%、1.95%、1.32%、2.54%、1.70%、1.58%、1.02%、1.83%、1.94%.

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取金銀花葉（S4）的同一個樣品溶液，分別于0、l、2、4、6、8、12 h 時進樣測定，計算各指標(biāo)成分峰面積的RSD 值，結(jié)果12 種成分的峰面積RSD 值依次為2.51%、0.95%、1.21%、1.36%、1.81%、1.07%、2.87%、1.71%、1.22%、2.06%、1.69%、1.44%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.4.5 加樣回收率試驗

稱取金銀花葉（S4）樣品6份，每份0.25 g，置于三角瓶中；分別加入各對照品（新綠原酸0.112 mg、綠原酸5.013 mg、斷氧化馬錢苷酸4.216 mg、斷馬錢子酸1.510 mg、馬錢苷0.080 mg、斷氧化馬錢子苷1.615 mg、鞣花酸0.042 mg、木犀草苷0.814 mg、異綠原酸B 0.890 mg、異綠原酸A 3.452 mg 野漆樹苷0.603 mg和異綠原酸C 0.198 mg），按“2.3項”（樣品溶液的制備）的方法制備溶液并進樣測定；計算各加樣對照品中12種成分的回收率，得結(jié)果依次為98.81%、99.54%、99.41%、98.92%、97.92%、99.18%、98.02%、99.33%、99.07%、99.18%、97.79%、98.96%；RSD 值分別為3.16%、1.11%、1.52%、2.57%、2.24%、1.60%、2.38%、2.52%、2.09%、1.82%、1.54%、1.93%；表明準(zhǔn)確度良好.

2.5 指紋圖譜的研究

分別稱取S1～S12樣品，按“2.3項”（樣品溶液的制備）的方法制備溶液并進樣測定，記錄色譜圖. 將12批樣品的色譜圖全譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”［9］，采用中位數(shù)法生成對照譜圖. 選取S4 作為參照圖譜（R），并進行色譜峰自動匹配及相似度分析，生成金銀花葉指紋圖譜的共有模式（圖2）. 最終確定圖譜中有16個共有峰，指認出其中的12個峰，分別為新綠原酸、綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C，12批金銀花葉色譜圖與對照指紋圖譜相似度分別為0.957、0.976、0.981、0.976、0.957、0.973、0.931、0.955、0.995、0.925、0.963、0.949.

圖2 12批金銀花葉樣品指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 12 batches of Lonicera japonica leaves

2.6 QAMS法測定12種成分含量

2.6.1 相對校正因子的計算

據(jù)線性溶液中各對照品的含量及對應(yīng)峰面積，以綠原酸為內(nèi)標(biāo)（S），分別計算得新綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C 11種成分的相對校正因子系數(shù). 結(jié)果見表3.

表3 金銀花葉中11種成分的相對校正因子系數(shù)Tab.3 Relative correction factor coefficients of 11 components in Lonicera japonica leaves

2.6.2 不同儀器時相對校正因子的考察

分別考察3種HPLC系統(tǒng)（Shimadzu LC-20AD、Agilent 1260-UV、Agilent 1260-DAD）的相對校正因子.結(jié)果顯示，3種HPLC系統(tǒng)中的新綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C與內(nèi)標(biāo)物綠原酸的相對校正因子RSD分別為4.25%、3.76%、1.60%、2.95%、3.72%、2.26%、3.07%、4.51%、3.18%、3.04%和2.96%，校正因子重現(xiàn)性良好.

2.6.3 不同色譜柱時相對校正因子的考察

用Agilent 1260 型HPLC 系統(tǒng)，分別考察3 種不同色譜柱（Agilent Eclipse XDB-C18、Agilent ZORBAX SB C18、Phenomenex Luna C18）的相對校正因子. 結(jié)果顯示，3 種色譜柱的新綠原酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、鞣花酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、野漆樹苷及異綠原酸C與內(nèi)標(biāo)物綠原酸的相對校正因子RSD分別為4.10%、3.54%、1.43%、2.17%、3.65%、1.85%、3.25%、4.77%、3.06%、2.94%和2.51%，校正因子重現(xiàn)性良好.

2.7 QAMS法和外標(biāo)法測定結(jié)果的比較

采取QAMS 法和外標(biāo)法（ESM）對12 批金銀花葉中的12 種成分含量進行測定（表4）. 兩種方法結(jié)果經(jīng)t檢驗無顯著性差異（P＞0.05）.

表4 金銀花葉中12種成分的含量（n=3，RSD＜2%）Tab.4 Contents of 12 components in Lonicera japonica leaves determinated by the methods of QAMS and ESM單位：%

3 討論

本研究對金銀花葉檢測的色譜條件進行了選擇和優(yōu)化，在前期金銀花葉研究的試驗基礎(chǔ)上［10］，采用乙腈-乙酸溶液為流動相，考察了不同乙酸濃度（0.1%、0.5%、1.0%）下的色譜圖. 結(jié)果顯示，在乙腈-0.1%乙酸水溶液梯度洗脫程序下，流動相滿足各色譜峰分離度要求，各峰峰型良好. 采用DAD對樣品溶液全波長掃描，發(fā)現(xiàn)斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、斷氧化馬錢子苷的最大吸收波長分別為234、244、240 nm；木犀草苷的最大吸收波長為348 nm和252 nm；有機酸類成分的最大吸收波長為327 nm，但是在220～240 nm處仍有較好吸收；為兼顧樣品中的所有成分，在同一波長下檢測實現(xiàn)多指標(biāo)成分的準(zhǔn)確定量測定，綜合考慮了目標(biāo)色譜峰響應(yīng)值和分離度，最終選擇240 nm 作為檢測波長. 色譜柱考察了Diamonsil Plus C18、Agilent Eclipse XDB-C18、Agilent ZORBAX SB-C18，最后選擇Agilent Eclipse XDB-C18柱，峰型、分離度均較好.

參考2020年《中華人民共和國藥典》金銀花項下金銀花藥材的檢測方法［11］，樣品選擇超聲提取，考察了水和30%、50%、70%、95%乙醇作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)用50%乙醇作為提取溶劑時，各成分提取率高.

本研究建立了HPLC法同時測定金銀花葉中新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、鞣花酸、斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸、馬錢苷、斷氧化馬錢子苷、木犀草苷及野漆樹苷12種成分，以綠原酸為參照物，采用一測多評法對其他11種成分同時測定，確定了其相對校正因子，且不同條件下相對校正因子重現(xiàn)性良好，對同一產(chǎn)地12個月采摘的金銀花葉進行測定，發(fā)現(xiàn)外標(biāo)法和QAMS法測定12種成分含量無明顯差異. 12批金銀花葉的指紋圖譜相似度＞0.925，得到16個共有峰.

經(jīng)本試驗提取、分析并定量測定的金銀花葉12 種成分，經(jīng)過HPLC-MS 檢測第4 個峰的分子質(zhì)量為390.0；通過參考文獻［12］和標(biāo)準(zhǔn)品驗證，發(fā)現(xiàn)此峰為斷氧化馬錢苷酸，為首次從金銀花葉分離得到. 綠原酸為有機酸類中的主要成分，其在金銀花葉中的含量1—4月呈上升趨勢，5月有所下降，6月達到一年中最高值. 經(jīng)分析，綠原酸的含量的這種變化可能與不同時期金銀花的生長存在密切聯(lián)系：封丘金銀花在5 月開花，綠原酸從葉向花中轉(zhuǎn)移，從而造成在葉子中含量降低；6月，由于光照時間長，光合作用增強，葉子中又生成大量的綠原酸，故出現(xiàn)這種現(xiàn)象. 斷氧化馬錢苷酸、斷馬錢子酸和斷氧化馬錢子苷屬環(huán)烯醚萜苷類，已有研究表明，環(huán)烯醚萜苷類具有良好的抗病毒活性［13-14］，其總量的變化與花中成分的轉(zhuǎn)移關(guān)系不大，推斷其總量主要受植物生長期的影響.

通過表4也可以看出，4—8月金銀花葉中各成分的含量較高，金銀花的剪枝多在每年的5—8月采花后，目的是促進形成多茬花，提高產(chǎn)量［15］. 因此，建議采摘金銀花葉的時間可以在每年的采花后進行，此時不但其葉片中各種有效成分含量高，還可以提高金銀花的產(chǎn)量.