香花油茶無性系苗期炭疽病調(diào)查及病菌致病力分化

廖旺姣，鐘雅婷，韋 維，鄒東霞，羅 輯

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西林業(yè)有害生物天敵繁育工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530002）

香花油茶（Camellia osmantha）為山茶屬短柱茶組新物種，具有早熟、果量多、出籽率高和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，樹型美觀，花帶香氣，具有獨(dú)特的表型性狀[1]。2012年，在廣西南寧發(fā)現(xiàn)該物種，之后逐步在廣西推廣種植。目前，香花油茶的研究主要集中在苗木快速繁育[2-4]、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)[5]、栽培[6]、生理[7-8]及葉片和果殼的綜合利用[9-11]等方面，針對(duì)病蟲害的報(bào)道較少。已報(bào)道的香花油茶苗期炭疽病病菌為Col?letotrichum fructicola[12]。單一作物連片種植易引發(fā)病害流行[13]。炭疽病是危害香花油茶葉片的主要病害之一，尤其是在苗期；苗期植株間距小，苗圃濕度大，通風(fēng)透氣性差。炭疽病病菌存在明顯的致病力分化現(xiàn)象[14-15]，同一地區(qū)不同炭疽病菌株的致病力存在一定差異，不同地區(qū)同一炭疽病菌株的致病力也存在一定差異[16]。油茶炭疽病病菌也存在類似現(xiàn)象。李揚(yáng)等[17]研究顯示，炭疽病原Colletotrichum ca?melliae對(duì)湘林1 號(hào)、湘林69 號(hào)和湘林89 號(hào)等12 個(gè)油茶（Camellia oleifera）品系葉片的致病力存在差異。不同香花油茶無性系炭疽病病菌的致病力還未見報(bào)道。本研究以27個(gè)香花油茶無性系為材料，采用平行線取樣法，對(duì)其苗期的炭疽病進(jìn)行調(diào)查與統(tǒng)計(jì)，采用形態(tài)特征和分子系統(tǒng)學(xué)分析法，對(duì)各無性系的炭疽病病菌進(jìn)行鑒定，并采用離體葉片接種法對(duì)所獲菌株進(jìn)行致病性及致病力測(cè)定，明確各菌株的致病力等級(jí)，以期為香花油茶抗病育種及炭疽病防治提供更為科學(xué)和可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的27 株感病香花油茶無性系苗木均由廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院油茶所提供，定植于苗圃；炭疽病樣品采集于感病葉片。

1.2 炭疽病調(diào)查與分級(jí)

1.2.1 炭疽病調(diào)查

2019—2021年的每年7月，采用平行線取樣法調(diào)查27個(gè)香花油茶無性系的炭疽病發(fā)生情況，每個(gè)無性系調(diào)查30 株；從苗木東、南、西、北和中5 個(gè)方向頂端展開的葉片開始，向下隨機(jī)調(diào)查5張葉片，每株記錄25 張葉片的發(fā)病情況。根據(jù)炭疽病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)調(diào)查葉片進(jìn)行分級(jí)，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)[18]。

1.2.2 炭疽病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

參考彭邵峰等[19]的方法，略作修改，制定香花油茶苗期炭疽病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。0級(jí)：無病斑；1級(jí)：病斑面積占葉面積1/4 以下；2 級(jí)：病斑面積占葉面積1/4 ≤～ 1/2；3 級(jí)：病斑面積占葉面積1/2 ≤～ 3/4；4級(jí)：病斑面積占葉面積3/4以上。

1.3 病菌鑒定

根據(jù)苗期葉片炭疽病發(fā)病癥狀，采集典型病害樣品進(jìn)行組織分離，統(tǒng)計(jì)不同無性系炭疽病病菌分離頻率；依據(jù)柯赫氏法則，測(cè)定炭疽病病菌致病性；參考相關(guān)資料，對(duì)致病病菌進(jìn)行形態(tài)特征鑒定，確定致病病菌的種類[20-21]。

進(jìn)行病菌基因序列測(cè)定及多基因序列分析。參考植物基因組試劑盒說明，提取病菌基因組DNA，參考廣西普通油茶炭疽病病菌序列測(cè)定方法[22]，測(cè)定病菌的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、肌動(dòng)蛋白（ACT）、幾丁質(zhì)合成酶（CHS1）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（GPDH）基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定病菌分類地位。

1.4 菌株致病性及致病力分化測(cè)定

1.4.1 接種體準(zhǔn)備

將27個(gè)無性系炭疽病菌株接種至新的PDA（馬鈴薯200 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂粉20.00 g和水1 000 mL）平板培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)，產(chǎn)生分生孢子后，挑取分生孢子液，用滅菌水配置成6.00 ×106個(gè)孢子/mL的分生孢子液。

1.4.2 致病性測(cè)定

采用傷口接種法測(cè)定致病性。采集27 個(gè)無性系健康成熟葉片帶回實(shí)驗(yàn)室，清水沖洗干凈，用75%酒精進(jìn)行表面消毒，再用滅菌水沖洗3次；用濾紙吸干表面水分后，將葉片放入鋪有濾紙的28 cm×20 cm × 3 cm 透明塑料盒中（葉片背面朝上），葉片基部用脫脂棉蘸無菌水保濕，每個(gè)塑料盒中擺放10張葉片。用滅菌接種針在近葉尖處和對(duì)角線近葉基處，分別創(chuàng)造1 個(gè)3 mm×3 mm 傷口，分別接種菌餅和20 μL 分生孢子液至傷口上，以接種滅菌水為對(duì)照；各處理及對(duì)照均接種10張葉片。接種后蓋上盒蓋，置于28 ℃室溫生化培養(yǎng)箱中，8 h/16 h 光暗交替培養(yǎng)，10天后計(jì)算發(fā)病率，并測(cè)量病斑大小[18]。

1.4.3 致病力分化測(cè)定

采用傷口接種法進(jìn)行致病力分化測(cè)定。采集香花油茶1 號(hào)無性系健康成熟葉片，葉片處理和接種方法與1.3.2 相同；27 個(gè)炭疽病菌株各接種20 張葉片，對(duì)照接種10 張葉片，培養(yǎng)條件與1.3.2 相同。參考杧果（Mangifera indica）炭疽病病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[23]，結(jié)合試驗(yàn)，制定香花油茶炭疽病病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。0 級(jí)：無病斑；1 級(jí)：病斑直徑≤3.00 mm；3級(jí)：3.00<病斑直徑≤9.00 mm；5 級(jí)：9.00<病斑直徑≤15.00 mm；7級(jí)：15.00<病斑直徑≤25.00 mm；9級(jí)：病斑直徑>25.00 mm。菌株致病類型劃分標(biāo)準(zhǔn)參考咖啡（Coffea arabica）炭疽病病菌致病力劃分標(biāo)準(zhǔn)[24]。強(qiáng)致病力類型的病情指數(shù)為40<～100；中致病力類型的病情指數(shù)為20<～40；弱致病類型的病情指數(shù)為0<～20；無致病類型的病情指數(shù)為0。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 和DPS 13.01 軟件整理和分析數(shù)據(jù)；采用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 炭疽病發(fā)病癥狀

炭疽病主要危害香花油茶的葉片和嫩芽。多從葉尖或葉緣開始感??；感病初期，葉片上出現(xiàn)褐色小圓點(diǎn)，之后逐漸擴(kuò)大；葉尖感病葉片的病斑由葉尖向葉基呈“V”字形擴(kuò)展，枯死面積逐漸增加；感病嫩葉上的病斑呈向葉片背面或向上卷曲狀態(tài)（圖1）。嫩芽感病后，呈褐色枯死狀，向嫩枝方向逐漸枯死。

圖1 部分香花油茶無性系炭疽病危害癥狀Fig.1 Damage symptoms of anthracnose in some C.osmantha clones

2.2 不同年份炭疽病發(fā)生情況

2019 — 2021年，各無性系炭疽病的發(fā)病率和病情指數(shù)均逐漸升高；平均發(fā)病率分別為9.50%、16.02%和18.84%；平均病情指數(shù)分別為3.47、6.96和8.97（表1）。2019年，發(fā)病率為3.12% ～ 18.04%；其中，21號(hào)無性系發(fā)病率最低，1號(hào)無性系發(fā)病率最高。2020年，發(fā)病率為9.67%～25.33%；其中，24 號(hào)無性系發(fā)病率最低，1 號(hào)無性系發(fā)病率最高。2021年，發(fā)病率為12.67% ～ 27.50%；其中，24 號(hào)無性系發(fā)病率最低，1 和8 號(hào)無性系發(fā)病率最高。2019年，病情指數(shù)為0.90～8.42；其中，21號(hào)無性系病情指數(shù)最低，4號(hào)無性系病情指數(shù)最高。2020年，病情指數(shù)為4.58 ～ 10.92；其中，14 號(hào)無性系病情指數(shù)最低，8號(hào)無性系病情指數(shù)最高。2021年，病情指數(shù)為6.21～12.75；其中，24 號(hào)無性系病情指數(shù)最低，8 號(hào)無性系病情指數(shù)最高。

表1 不同年份香花油茶無性系炭疽病調(diào)查結(jié)果Tab.1 Investigation results of anthracnose of C.osmantha clones in different years

續(xù)表1 Continued

2019 — 2021年，各無性系炭疽病的發(fā)病率增長(zhǎng)率和病情指數(shù)增長(zhǎng)率均呈降低趨勢(shì)，均表現(xiàn)為2019 — 2020年較高，2020 — 2021年較低（表2）。2019 — 2020年，發(fā)病率增長(zhǎng)率為14.06% ～73.26%，平均增長(zhǎng)率為43.12%；其中，18號(hào)無性系增長(zhǎng)率最低，21號(hào)無性系最高。2020—2021年，發(fā)病率增長(zhǎng)率為7.89% ～ 25.92%，平均增長(zhǎng)率為15.93%；其中，1 號(hào)無性系增長(zhǎng)率最低，23 號(hào)無性系最高。2019—2020年，病情指數(shù)增長(zhǎng)率為14.77%～82.85%，平均增長(zhǎng)率為52.75%；其中，4 號(hào)無性系增長(zhǎng)率最低，21號(hào)無性系最高。2020—2021年，病情指數(shù)增長(zhǎng)率為11.37% ～ 34.94%，平均增長(zhǎng)率為21.23%；其中，2 號(hào)無性系增長(zhǎng)率最低，14 號(hào)無性系最高。

表2 不同年份香花油茶無性系炭疽病發(fā)病率及病情指數(shù)變化情況Tab.2 Changes of disease incidences and disease indexes of anthracnose of C.osmantha clones in different years(%)

續(xù)表2 Continued

2.3 不同無性系炭疽病病菌分離頻率

2019 — 2021年，各無性系炭疽病病菌的分離頻率均逐漸升高，平均分離頻率分別為34.22%、40.74% 和58.81%（表3）。2019年，分離頻率為12% ～ 64%；分離頻率大于50%的無性系有4 個(gè)，分別為1、7、17和22號(hào)無性系；分離頻率為30%～50%的無性系有10 個(gè)，分別為5、6、8、11、12、14、16、20、21 和27 號(hào)無性系；其他無性系的分離頻率均低于30%。2020年，分離頻率為20%～68%；除2和26號(hào)無性系與2019年相同外，其他無性系的分離頻率均增加；分離頻率低于30%的無性系有4 個(gè)，分別為2 、9、18 和26 號(hào)；分離頻率大于50%的無性系有5個(gè)，分別為1、7、17、21和22號(hào)無性系；其他無性系的分離頻率均為30% ～ 50%。2021年，分離頻率為28%～92%；除8 號(hào)無性系與2020年相同外，其他無性系的分離頻率均增加；分離頻率低于30%的無性系僅1 個(gè)（26 號(hào)無性系）；分離頻率為30% ～ 50%的無性系有5 個(gè)，分別為2、8、9、10 和18 號(hào)無性系；其他無性系的分離頻率均大于50%。

表3 不同年份香花油茶無性系炭疽病病菌分離頻率Tab.3 Isolation frequencies of anthracnose bacteria of C.osmantha clones in different years(%)

2.4 炭疽病病菌鑒定

從27 個(gè)無性系獲得的炭疽病菌株培養(yǎng)形狀相似，代表菌株YJ1506②、CZ1608①和CZ1611①在PDA 平板培養(yǎng)基上的菌絲呈灰白色至深灰色，先端菌絲色淺，菌落中心色深；氣生菌絲茂盛，菌落呈圓形，邊緣完整（圖2 a～c）。培養(yǎng)后期，菌落中心產(chǎn)生橘紅色分生孢子堆，背面產(chǎn)生黑色色素。菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，25 ℃培養(yǎng)7天，平均菌落直徑為82.16 ～ 86.30 mm，平均生長(zhǎng)速率為11.74 ～12.33 mm/d。分生孢子單孢，無色，光滑，圓柱狀，頂端鈍圓或略尖，基部平截，多數(shù)具有1 個(gè)油球，少數(shù)具有2 個(gè)油球，大小為（13.99 ～ 16.99）μm ×（4.93 ～5.67）μm（圖2 d～f）。分生孢子附著胞呈淺褐色至褐色，圓形或近圓形，邊緣完整，少數(shù)呈不規(guī)則形狀，單個(gè)或多個(gè)，大小為（6.50～10.69）μm×（5.17～9.50）μm（圖2 g～h）。菌株形態(tài)特征與核果炭疽菌（C.fructicola）一致[12，25]。

圖2 部分香花油茶無性系炭疽病病菌形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of anthracnose bacteria in some C.osmantha clones

通過多基因序列分析，獲得代表菌株YJ1506②、CZ1608①和CZ1611①的ITS、ACT、CHS1 和GPDH序列，在GenBank 上進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)，代表菌株與目標(biāo)菌株同源性高達(dá)99%～100%，下載其他炭疽病病菌序列，用Mega 6.0 的鄰接法構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，YJ1506②、CZ1608 ①和CZ1611 ①菌株與C.fructicola（菌株CSSX7、CMTJ18 和BL30）聚在同一分支上，與其它炭疽病病菌形成獨(dú)立分支，支持率為99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定YJ1506②、CZ1608①和CZ1611①病菌為C.fructicola。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree

2.5 致病性測(cè)定結(jié)果

從27 個(gè)無性系感病葉片上共分離出374 株炭疽病病菌，每個(gè)無性系分離獲得的菌株為7～23株，每個(gè)無性系挑選1個(gè)代表菌株進(jìn)行致病性測(cè)定。接種3天后，接種點(diǎn)呈褐色至黑褐色，隨時(shí)間推移病斑逐漸擴(kuò)展；接種10天后，接種葉片均發(fā)病，病斑大小有差異，平均直徑為4.00～11.96 mm（表4，圖4）。病斑直徑最大的為從6號(hào)無性系獲得的菌株YJ1506②（11.96 mm），與其他菌株差異顯著（P< 0.05）；其次為從12 號(hào)無性系獲得的菌株YJ1614 ①（7.57 mm）；病斑直徑最小的為14號(hào)無性系獲得的菌株YJ1617①（4.00 mm）。對(duì)照的接種點(diǎn)變褐色，但未擴(kuò)展。對(duì)感病葉片進(jìn)行再次分離，獲得的菌株與接種菌株形態(tài)特征一致；對(duì)對(duì)照葉片進(jìn)行再次分離，未獲得任何菌株。確定接種的27 個(gè)炭疽病菌株均為香花油茶無性系炭疽病致病菌株。

圖4 部分香花油茶無性系致病性測(cè)定感病癥狀Fig.4 Susceptible symptoms of some C.osmantha clones in virulence determination

表4 不同香花油茶無性系炭疽病菌株致病性測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination results of virulence of anthracnose strains from different C.osmantha clones

2.6 炭疽病病菌致病力分化

不同無性系中獲得的炭疽病菌株致病力差異顯著（P< 0.05）（表5）。從6 號(hào)無性系獲得的YJ1506②菌株病斑直徑最大（12.75 mm），與從其他無性系獲得的菌株差異顯著（P< 0.05）；其次為從12 號(hào)無性系獲得的YJ1614①菌株（9.70 mm）；從14號(hào)無性系獲得的YJ1617①菌株病斑直徑最?。?.60 mm）。YJ1506②菌株病情指數(shù)最高（51.11），其次為YJ1614①菌株（42.22），病情指數(shù)最低的為從4 號(hào)無性系獲得的YJ1504②菌株（26.66）。依據(jù)菌株致病類型劃分標(biāo)準(zhǔn)，27 個(gè)炭疽病菌株中，YJ1506②和YJ1614 ①菌株為強(qiáng)致病力菌株，占供試菌株的7.41%；其他25個(gè)菌株為中等致病菌株，占供試菌株的92.59%；說明香花油茶苗期炭疽病病菌C.fructic?ola以中等致病力菌株為優(yōu)勢(shì)群體。

表5 不同香花油茶無性系炭疽病病菌致病力分析Tab.5 Analysis on pathogenicity of anthracnose bacteria from different C.osmantha clones

3 討論與結(jié)論

本研究調(diào)查2019 — 2021年27 個(gè)香花油茶無性系苗期炭疽病發(fā)生情況。結(jié)果顯示，不同無性系發(fā)病率、病情指數(shù)和炭疽病菌分離頻率略有差異，且整體呈上升趨勢(shì)，可能與香花油茶無性系不同來源、寄主抗病性和病原菌積累有關(guān)。

本研究通過病原菌形態(tài)特征鑒定，并結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)，分析病原菌核糖體ITS、ACT、CHS1 和GPDH 多基因分子系統(tǒng)發(fā)育樹，確定從香花油茶無性系苗期獲得的炭疽病病菌為C.fructicola，與2016年報(bào)道的香花油茶苗期炭疽病病菌相同[12]，但與報(bào)道的普通油茶炭疽病病菌膠孢炭疽菌（C.gloeospori?oides）[22]、山茶炭疽菌（C.camelliae）不同[26]，可能與寄主不同有關(guān)。

從27 個(gè)香花油茶無性系中獲得的炭疽病菌株培養(yǎng)性狀相同或相似，為同一類型炭疽病病菌，菌落淺灰色至深灰色，邊緣色淺，菌落中央色深，與楊友聯(lián)等[25]報(bào)道的棉花（Gossypium hirsutum）炭疽病病原之一的C.fructicola及李河等[21]報(bào)道的湖南油茶炭疽病病原之一的C.fructicola菌落形態(tài)相同；菌落背面產(chǎn)生黑色色素，與李河等[21]報(bào)道相同，與楊友聯(lián)等[25]報(bào)道的C.fructicola菌落背面微黃色不同，可能與菌株不同寄主來源有關(guān)，與劉文魁[27]報(bào)道的不同寄主上的C.fructicola在地理和生物學(xué)方面存在較大差異的研究結(jié)果相符。

不同香花油茶無性系獲得的炭疽病菌株C.fructicola均有致病性，但致病力存在差異，與劉文魁[27]報(bào)道的C.fructicola不同菌株致病力存在明顯差異的結(jié)論相符。本研究結(jié)果表明，27 個(gè)香花油茶無性系來源的C.fructicola致病力分化明顯，其中2 個(gè)菌株為強(qiáng)致病力菌株，其他25個(gè)菌株為中等致病力菌株，以中等致病力菌株為優(yōu)勢(shì)群體，與王薇等[28]報(bào)道的蘋果（Malus pumila）炭疽葉枯病菌C.fructicola種內(nèi)存在致病力明顯分化現(xiàn)象和彭宇鴻等[29]報(bào)道的導(dǎo)致南方梨（Pyrusspp.）早期落葉的的果生炭疽菌C.fructicola致病力有明顯分化的結(jié)果相似。少數(shù)強(qiáng)致病力菌株可作為香花油茶無性系抗病選育、病原物與寄主互作等研究的菌種資源，研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究該病菌群體間致病力的變化動(dòng)態(tài)及香花油茶抗性無性系篩選和綜合防治有重要意義。