納米抗體分子影像探針的研究進展

張友 黃鋼 魏偉軍 劉建軍

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床核醫(yī)學(xué)研究所，上海 200127

大多數(shù)哺乳動物體內(nèi)的單克隆抗體由2 條重鏈和2 條輕鏈組成，分子量約150 kDa。1993 年，比利時科學(xué)家Hamers-Casterman 等[1]在鯊魚和駱駝中發(fā)現(xiàn)了沒有輕鏈、只有重鏈的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G，并基于此IgG 進一步開發(fā)了單域抗體（single domain antibody，sdAb），也稱之為納米抗體（nanobody）[2]。納米抗體相較于單克隆抗體，具有分子量小（約15 kDa）、溶解性好、穩(wěn)定性高、組織穿透能力強且可快速從血液中清除并經(jīng)腎臟排泄等諸多優(yōu)點。此外，納米抗體可通過生物工程技術(shù)在細菌、酵母或哺乳動物細胞中大規(guī)模生產(chǎn)，制備成本較低，從而有效促進其臨床應(yīng)用。納米抗體作為構(gòu)筑分子影像探針的新型靶向分子，經(jīng)放射性核素標記后，具有短期內(nèi)獲取高質(zhì)量圖像、對疾病進行全面評估及指導(dǎo)個體化精準治療等優(yōu)勢[3]。迄今為止，已經(jīng)涌現(xiàn)出多種針對不同分子靶標的納米抗體分子影像探針（簡稱納米抗體探針）[4]，并在腫瘤早期靶點特異性診斷方面發(fā)揮了重要作用。我們旨在綜述納米抗體探針領(lǐng)域的最新研究進展，并對該領(lǐng)域的未來發(fā)展作相應(yīng)的展望。

1 納米抗體探針在腫瘤中的應(yīng)用

納米抗體可應(yīng)用于多種分子影像學(xué)成像技術(shù)，如PET/CT、SPECT/CT、光學(xué)成像和超聲成像等。目前納米抗體探針的主要靶點包括腫瘤膜抗原及腫瘤微環(huán)境中的靶點等，主要包括但不限于表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、人表皮生長因子受體（human epidermal growth factor receptor，HER）2、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）、細胞分化抗原（cell differentiation，CD）、程序性細胞死亡蛋白-1（PD-1）、程序性細胞死亡配體-1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）、淋巴細胞激活基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）等。表1 中列舉了部分已應(yīng)用于臨床試驗的納米抗體探針。

表1 臨床級別的納米抗體分子影像探針及其靶點Table1 Clinical-grade nanobody-based molecular imaging probes and their targets

1.1 PET/CT 顯像納米抗體探針

使用放射性核素68Ga、18F 等標記納米抗體，可制備短半衰期PET/CT 分子影像探針。目前，PET/CT 顯像納米抗體探針的靶點主要包括HER2 和CD38 等。

1.1.1 HER2

HER2 是乳腺癌經(jīng)典的生物標志物之一?？笻ER2 治療可顯著延長HER2 陽性乳腺癌患者的生存期?；诩{米抗體的免疫PET 顯像（immunoPET）有望實現(xiàn)HER2 異質(zhì)性表達的無創(chuàng)可視化。Vaidyanathan 等[7]構(gòu)建了靶向HER2 的納米抗體探針18F-RL-I-5F7，證明了該探針可有效評估體內(nèi)HER2 的表達情況。2016 年Keyaerts 等[5]制備了68Ga-HER2-Nanobody，并在一項納入了20 例乳腺癌患者的臨床試驗中評估了該探針的診斷效能，結(jié)果顯示，與周圍正常組織相比，HER2 陽性乳腺癌病灶中的示蹤劑攝取明顯增高，這充分證實了68Ga-HER2-Nanobody 是一種極具臨床應(yīng)用價值的探針。目前該團隊正在開展另一項臨床試驗，研究該探針對于乳腺癌腦轉(zhuǎn)移灶的檢出能力（NCT03331601）。

1.1.2 CD38

CD38 是一種在多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）及多種實體瘤細胞中顯著高表達的跨膜蛋白。靶向CD38 的抗體達雷木單抗（daratumumab）已獲批臨床，用于MM 的治療。最近，我們團隊開發(fā)了首個靶向CD38 的納米抗體探針68Ga[Ga]-NOTA-Nb1053（NOTA:1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸，1,4,7-triacyclononane-1,4,7-tracetic acid），研究結(jié)果顯示，該探針可特異性可視化皮下及原位骨髓瘤模型中漿細胞表面CD38 的表達水平，進而實現(xiàn)MM 的無創(chuàng)、靶點特異性精準診斷[8]。該探針的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用將有望為MM 的早期診斷、靶向治療患者的篩選及治療后療效評價提供全新的路徑。關(guān)于該探針的臨床轉(zhuǎn)化前景，可見最新的述評[9]。

1.1.3 腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）

TAM 是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，具有多種促腫瘤活性。在腫瘤缺氧部位，具有較強促血管生成作用的TAM 高度表達巨噬細胞甘露糖受體（macrophage mannose receptor，MMR）[10]。Blykers 等[11]制備了納米抗體探針18F-anti-MMR sdAb，基于該探針的免疫PET 顯像成功實現(xiàn)了腫瘤基質(zhì)中促癌巨噬細胞亞群的無創(chuàng)可視化。Xavier 等[12]利用68Ga 標記的靶向MMR 的納米抗體探針進一步實現(xiàn)了其臨床轉(zhuǎn)化。目前一項臨床實驗（NCT04168528）的研究者正在研究68Ga-NOTA-Anti-MMR-VHH2（VHH: 重鏈抗體可變區(qū)，variable domains of heavy chain-only antibodies）免疫PET 顯像在乳腺癌、頭頸部惡性腫瘤或黑色素瘤中的診斷價值。

1.1.4 PD-L1

靶向免疫檢查點的免疫治療正在逐漸改變腫瘤治療的現(xiàn)狀，PD-L1 是經(jīng)典的免疫檢查點之一[13]。然而，病灶內(nèi)PD-L1 是否表達及表達程度將直接影響免疫治療的效果。Nature Medicine雜志刊登的一項臨床試驗初步報道了PD-L1特異性單克隆抗體免疫PET 顯像探針可視化PD-L1 異質(zhì)性表達、預(yù)測PD-L1 特異性免疫治療療效的價值[14]。近期，國內(nèi)研究者構(gòu)建了一種靶向PD-L1 的納米抗體探針68Ga-NOTA-Nb109，該探針可以利用PET/CT 顯像無創(chuàng)顯示腫瘤PD-L1 的表達情況并且及時準確評估免疫檢查點靶向治療的效果[15-16]。

1.1.5 細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）

ECM 對于促進腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展、增殖及遷移等具有重要的影響[17]。纖維連接蛋白（fibronectin）是一種糖蛋白，是構(gòu)成腫瘤細胞外基質(zhì)和新生血管的主要成分。Jailkhani等[18]從靶向ECM 蛋白的納米抗體文庫中篩選出了一種靶向纖維連接蛋白剪接體EIIIB 的納米抗體NJB2，通過64Cu標記構(gòu)建了64Cu-labeled-NJB2，最后通過免疫PET 顯像證明了該探針在檢測腫瘤原發(fā)灶、腫瘤轉(zhuǎn)移灶、纖維化病變及以ECM 沉積為特征的疾病中具有良好的特異度和靈敏度。

1.1.6 免疫細胞

腫瘤浸潤的CD8 陽性（CD8+）T 淋巴細胞在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起著重要作用。目前多項臨床試驗正在評估靶向CD8+T 淋巴細胞分子探針（89Zr-Df-IAB22M2C）的臨床應(yīng)用價值[19-21]。Rashidian 等[22]及我們團隊[23]分別構(gòu)建了靶向CD8+T 細 胞 的 納 米 抗 體 探 針89Zr-PEGylated-VHH-X118 及68Ga-NOTA-SNA006a，上述探針在CD8+T 細胞的可視化及免疫治療療效的監(jiān)測方面展現(xiàn)出了一定的價值，其臨床應(yīng)用價值有待進一步研究。

1.1.7 其他靶點特異性納米抗體探針

除了上述的靶點之外，還有多種針對其他不同靶點的納米抗體探針處于臨床前研究階段，如前列腺特異性膜抗原（PSMA）[24-25]、MM 細胞的表面標志物M 蛋白[26]和癌胚抗原（CEA）[27]等。

1.2 SPECT/CT 顯像納米抗體探針

使用發(fā)射γ 射線的放射性同位素（如99Tcm、111In 等）標記納米抗體可進行SPECT/CT 顯像。EGFR 是酪氨酸激酶受體家族的跨膜蛋白，其過度表達與多種惡性腫瘤的總體生存率和復(fù)發(fā)率相關(guān)。7D12 是第1 個被應(yīng)用于分子影像的靶向EGFR 的納米抗體[28]。Renard 等[29]合成了111In-labeled DTPA-IRDye700DX-7D12 ，該探針可進行SPECT/CT 及熒光雙模態(tài)顯像，準確可視化腫瘤細胞EGFR 的表達情況，有望篩選可從EGFR 靶向治療中獲益的患者。趙晉華團隊首次將99Tcm標記的抗PD-L1 納米抗體（NM-01）探針應(yīng)用于非小細胞肺癌患者的SPECT/CT 顯像，研究結(jié)果顯示，99Tcm-NM-01 SPECT/CT 顯像安全無不良反應(yīng)，且在注射后2 h 顯示出良好的T、NT，腫瘤的攝取水平與組織活檢所示PD-L1 的表達情況具有良好的一致性[6]。近期，Lecocq 等[30]報道了一種靶向免疫檢查點LAG-3 的納米抗體探針99Tcmlabeled nanobody 3132，利用SPECT/CT 顯像可以無創(chuàng)監(jiān)測腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）表面LAG-3 的動態(tài)演變，從而有望預(yù)測腫瘤患者的免疫治療效果及遠期預(yù)后。

1.3 光學(xué)成像納米抗體探針

活體光學(xué)成像包括生物發(fā)光技術(shù)和熒光技術(shù)。生物發(fā)光技術(shù)是采用熒光素酶基因（luciferase）轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株，進而通過光學(xué)成像進行生物發(fā)光；而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團標記相應(yīng)靶點進行顯像。近期，Nix 等[31]通過細胞表面蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了CD72 是預(yù)后不良的KMT2A/MLL1（賴氨酸甲基輕移酶2A基因易位的混合譜系白血病，Lysine methyltransferase 2A translocations of the mixed lineage leukemia)重組急性B 淋巴細胞白血病的潛在靶標，并構(gòu)建了靶向CD72 的納米抗體NbD4，制備了基于NbD4 主動靶向的嵌合抗原受體T 細胞NbD4-CAR-T，進一步通過生物發(fā)光顯像技術(shù)無創(chuàng)評估了NbD4-CAR-T 對于KMT2A/MLL1 重組急性B 淋巴細胞白血病的治療效果。其研究結(jié)果顯示， CD72-CAR-T 可延長CD19-CAR-T 治療失敗的KMT2A/MLL1 重組急性B 淋巴細胞白血病患者的生存期；此外，將靶向HER2 的納米抗體11A4 與近紅外熒光團IRDye 800CW 偶聯(lián)后可特異性地定位于HER2 陽性異種移植小鼠的腫瘤部位。因此，利用近紅外熒光成像進行圖像引導(dǎo)手術(shù)，可精準切除HER2 陽性腫瘤[32]。

1.4 超聲分子成像納米抗體探針

超聲分子成像是一種新穎的腫瘤診斷方法，將攜帶靶向特異性的抗體或配體的超聲造影劑注射入體內(nèi)，通過血液循環(huán)聚集于腫瘤部位，進而進行超聲分子成像。碳酸酐酶Ⅸ（CAⅨ）在包括腎細胞腎癌在內(nèi)的多種惡性實體瘤細胞膜高度表達，是構(gòu)建分子影像探針的良好靶標。Zhu 等[33]構(gòu)建了一種帶有CAⅨ多肽的靶向納米氣泡，體內(nèi)外研究結(jié)果顯示，該氣泡具有良好的穿透能力和特異性，可進行多種腫瘤的超聲分子成像。

2 提高顯像質(zhì)量及促進臨床轉(zhuǎn)化

納米抗體探針由于分子量小、循環(huán)時間短，導(dǎo)致其在體內(nèi)迅速經(jīng)過腎臟代謝并在腎臟內(nèi)滯留。盡管在短時間內(nèi)高親和力的納米抗體探針在腫瘤部位已有較高攝取，可勉強滿足腫瘤診斷的需求，但是仍需對其藥代動力學(xué)性質(zhì)進一步優(yōu)化，從而提高T、NT，促進其臨床轉(zhuǎn)化。此外，腎臟的持久高攝取及體內(nèi)較短的循環(huán)時間還阻礙了納米抗體探針在腫瘤治療方面的應(yīng)用。以下就目前推動納米抗體探針臨床轉(zhuǎn)化所采取的相應(yīng)策略展開簡要介紹。

2.1 提高靶向親和力

Rashidian 等[34]通過對納米抗體的位點特異性修飾，合成了雙特異性納米抗體探針，其在荷瘤小鼠中顯示了更強的親和力。相較于單靶點納米抗體探針，雙特異性納米抗體探針不僅增強了靶向特異性，還提高了靶向親和力，實現(xiàn)了“1+1＞2”的效果。雙特異性納米抗體探針已在多項動物實驗中應(yīng)用于放射性核素標記的顯像、熒光成像和MRI 等[35]。HuNb1-IgG4 是一種新型的抗CD47 納米抗體，具有較高的靶向親和力和特異性。Ⅱ期臨床試驗（NCT02216409）證實了其在體內(nèi)較強的抗卵巢癌和抗淋巴瘤活性[36]。在此基礎(chǔ)上，Ma 等[37]合成了一種由HuNb1-IgG4 和利妥昔單抗（Rituximab）組成的抗CD47/CD20 雙特異性抗體（BsAb），結(jié)果表明，其具有更強的選擇性結(jié)合及抗腫瘤活性。此外，通過在納米抗體末端引入特定標簽，從而實現(xiàn)核素的定點標記，避免了隨機標記破壞納米抗體抗原結(jié)合位點的可能，這同樣可提高納米抗體探針的靶向親和力[38]。

2.2 降低腎臟攝取

納米抗體探針在腎臟攝取較高主要是由放射性核素標記的探針經(jīng)腎小球濾過、近曲小管重吸收后被溶酶體降解所產(chǎn)生的放射性代謝產(chǎn)物在腎臟內(nèi)長時間滯留所致。因此，降低腎臟攝取的主要方法可分為三個方面，一是減少腎小球濾過；二是抑制腎小管重吸收；三是在放射性核素標記的納米抗體探針中引入代謝鍵來改變其在體內(nèi)的代謝途徑[39]。最近，Zhou 等[40-41]利用點擊化學(xué)在納米抗體探針中引入連接子GK，其可被腎近曲小管中的腎刷狀緣酶選擇性剪切，從而使放射性核素標記的基團隨尿液排出，結(jié)果顯示，在注射該探針3 h 后，幾乎無法檢測到腎臟攝取。此外，Wang 等[8]的研究結(jié)果表明， 在注射探針前5 min 注射馬來酸鈉或果糖，可通過抑制腎近曲小管細胞產(chǎn)生ATP 的方式，顯著降低納米抗體探針在腎臟的滯留。降低納米抗體探針在腎臟的滯留不僅有助于提高圖像質(zhì)量，還可為納米抗體介導(dǎo)的核素治療及抗體偶聯(lián)藥物的發(fā)展提供可能。

2.3 延長體內(nèi)循環(huán)時間

Hong 等[42]利用分選酶技術(shù)在靶向人EGFR 的納米抗體7D12 的羧基末端引入二硝基苯基半抗原（DNP），修飾后的抗體可與內(nèi)源性抗體結(jié)合形成原位免疫復(fù)合物，從而減慢其在腎臟的代謝，顯著延長了其在小鼠體內(nèi)的循環(huán)時間。Xenaki 等[43]將白蛋白結(jié)合域（ABD）引入納米抗體，構(gòu)建納米抗體融合蛋白，其可與體內(nèi)白蛋白結(jié)合從而不再經(jīng)過腎小球濾過，體內(nèi)外實驗結(jié)果表明，其循環(huán)時間較納米抗體延長了14.8 倍。此外，還可通過在納米抗體中引入聚乙二醇鏈[44]、富含脯氨酸/丙氨酸的序列（PASylation）[45]等方式延長納米抗體在體內(nèi)的循環(huán)時間，增加腫瘤部位的攝取，從而提高顯像質(zhì)量，進一步協(xié)助對腫瘤的診斷及治療。

3 小結(jié)與展望

隨著免疫PET 顯像技術(shù)的逐步興起[46]，納米抗體探針也以其獨特的優(yōu)勢迅速發(fā)展。除上述的靶點外，尚有其他靶點特異性納米抗體探針在多項臨床前研究中展現(xiàn)出了較好的診斷效果。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷迭代和對腫瘤病理生理過程的不斷深入認知，越來越多的關(guān)鍵靶點將可用于納米抗體探針的研發(fā)。為進一步有效推進納米抗體探針的臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用，我們強調(diào)必須首先在符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）的條件下生產(chǎn)納米抗體，并用于探針的構(gòu)建，從而有效減輕藥物所致的不良反應(yīng)，保障患者的安全。我們認為，腫瘤靶點特異性診斷應(yīng)服務(wù)于腫瘤靶點特異性治療。雖然小分子藥物、抗體類藥物及細胞治療等均可實現(xiàn)腫瘤的靶向治療，但發(fā)展靶點特異性納米抗體放射免疫治療藥物，優(yōu)化其藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)性質(zhì)，或?qū)⑦M一步助力實現(xiàn)腫瘤的精準診療[43,47-48]。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明張友負責(zé)綜述的撰寫與修改；黃鋼、魏偉軍、劉建軍負責(zé)綜述的審閱與最終版本的修訂