刺梨的活性成分含量分布與光譜表征

陳家敏，李博巖*，胡 蕓，張 進，汪瑞敏，孫曉紅

1. 貴州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與健康學院/環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025 2. 貴州中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，貴州 貴陽 550009

引 言

刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)又名山王果、 木梨子，屬于薔薇科薔薇屬多年生落葉灌木，主要分布在我國云貴川高原地區(qū)，以貴州省資源最為豐富，年產(chǎn)量最高[1]。刺梨為藥食同源類植物，其果實富含維生素 C、 超氧化物歧化酶、 過氧化物酶、 多酚、 黃酮、 多糖、 三萜、 氨基酸以及微量元素等多種活性成分[2-3]。其中，多酚含量高達15.93 mg·g-1，黃酮含量平均約為6.80 mg·g-1，主要包括(表)沒食子兒茶素、 槲皮素、 山萘酚、 及其衍生物等。這些物質具有多種藥理活性，使得刺梨具有很高的食品與臨床藥用價值和良好的應用前景，也是植物化學的研究熱點[1, 4]。目前，刺梨產(chǎn)業(yè)是貴州全省重點發(fā)展產(chǎn)業(yè)之一。挖掘其潛在價值，助推脫貧攻堅，使刺梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展迎來新的浪潮。

近紅外光譜是一種綠色快速無損的檢測技術，已成功應用于食品藥品質量分析。三維熒光光譜能夠提供熒光強度隨激發(fā)或發(fā)射波長變化的圖譜信息，是一種較為成熟的分析技術，在食品安全、 環(huán)境檢測等方面得到了廣泛的應用。氣候、 水分、 土壤等環(huán)境生長條件以及種植方法對植物的活性成分有著重要的影響。產(chǎn)地不同的刺梨果活性成分含量不同，品質亦存在差異[5]。刺梨果中的很多活性成分具有熒光特征與近紅外區(qū)域的吸收。目前刺梨的光譜研究僅有紫外-可見、 紅外光譜的相關報道[3]。但有關的近紅外、 熒光光譜技術檢測多批次刺梨的應用研究仍處于空白。

通過測定刺梨果中總酚(total phenolic content, TPC)、 總黃酮(total flavonoid content, TFC)、 總三萜(total triterpenoid content, TTC)的活性成分含量，以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、 2,2’-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除率、 鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power, FRAP)，統(tǒng)計分析不同產(chǎn)地刺梨樣本的活性成分含量及抗氧化活性的差異，探討活性數(shù)據(jù)的分布特征。采用紫外-可見、 近紅外、 激發(fā)發(fā)射熒光光譜技術表征刺梨提取物樣本物質組成，并建立樣本差異性判別模型，實現(xiàn)不同產(chǎn)地不同批次刺梨樣本的快速溯源與品質鑒別，為刺梨的優(yōu)選、 培育提供借鑒與參考。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

原料：301個不同批次的成熟刺梨鮮果分別采摘或購買于貴州安順(AS)、 龍里(LL)、 六盤水(LPS)、 畢節(jié)(BJ)、 銅仁(TR)、 黔西(QX)、 貴定(GD)、 貴陽(GY)八個刺梨種植基地或產(chǎn)地(表1)。品種主要為貴農(nóng)5號刺梨，以及10個安順金刺梨(ASJ)樣本。

試劑：福林-酚試劑(北京索萊寶科技有限公司)；2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、 2，2’-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)(上海源葉生物科技有限公司)；水溶性維E(Trolox)(阿拉丁試劑有限公司)；沒食子酸、 蘆丁、 熊果酸(HPLC≥98%)(南京草本元生物科技有限公司)。

1.2 儀器

紫外-分光光度計(UV-1700pls，上海美析儀器有限公司)；熒光分光光度計(F97pro, 上海棱光技術有限公司)；近紅外光譜儀(IAS-3120，無錫迅杰光遠科技有限公司)；酶標儀(1510，芬蘭Thermo Fisher公司)；超聲波清洗器(KM-500DE，昆山美美超聲儀器有限公司)；榨汁機(MIUI，寧波采臣電器有限公司)。

表1 實驗所用的刺梨樣本信息Table 1 Sample information of RRT fruits used in this study

1.3 方法

1.3.1 樣本制備

刺梨鮮果樣本，洗凈、 風干、 去除不可食用部分，切碎混勻稱取100 g，用榨汁機打碎、 渣汁混勻備用。稱取刺梨勻漿樣本20 g，置于燒杯中，加入甲醇提取，超聲功率500 W、 30 ℃條件下提取60 min。用甲醇分別以料液比1∶2，1∶2，1∶1提取三次，合并提取液，得刺梨甲醇提取物樣本。刺梨提取液使用前過0.45 μm有機濾膜。

1.3.2 成分與活性測定

總酚含量測定：分別取50 μL九個濃度水平的沒食子酸標準液(0.00～0.20 mg·mL-1)以及提取物稀釋液，置于棕色EP管中，加入50 μL福林-酚試劑反應10 min，再與200 μL的20% NaCO3溶液反應20 min。取200 μL反應液置于酶標板上，以色譜純甲醇為空白，765 nm波長處測定吸光度[6]。沒食子酸計總酚的含量，以鮮重表示，單位為 mg·g-1FW。

總黃酮含量測定：分別取25 μL八個濃度水平的蘆丁標準液(0.00～1.00 mg·mL-1)以及樣品稀釋液置于棕色EP管中，加入110 μL 0.066 mol·L-1的NaNO2溶液混勻反應5 min，再加15 μL 0.75 mol·L-1的氯化鋁溶液反應6 min，加入100 μL 0.5 mol·L-1的NaOH溶液，靜置10 min后，取200 μL反應液置于酶標板上，以色譜純甲醇為空白，510 nm處測定吸光度[7]?？傸S酮含量以蘆丁計，以鮮重表示，單位為 mg·g-1FW。

總三萜含量測定：取50 μL的樣品稀釋液或梯度量(0，100，200，300，400，500和600 μL)熊果酸標準液(0.1 mg·mL-1)于棕色EP管中，90 ℃水浴揮發(fā)溶劑，60 ℃烘箱烘干試管，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、 0.6 mL高氯酸60 ℃水浴反應15 min，冷卻后加2.2 mL冰醋酸混勻，移取200 μL反應液于酶標板上，以甲醇溶液為空白，548 nm處測定吸光度[8]?？側扑岷恳孕芄嵊?，以鮮重表示，單位為 mg·g-1FW。

DPPH自由基清除能力測定[6]：制備0.00～0.08 mg·mL-1八個濃度水平的Trolox標準液與樣品稀釋液。分別取50 μL置于棕色EP管中，加入400 μL DPPH-甲醇溶液(100 μmol·L-1)，搖勻后在25 ℃條件下反應30 min。移取200 L反應液于酶標板上，517 nm處測量吸光度。

ABTS自由基清除能力測定：制備七個濃度水平的Trolox標準液與樣品稀釋液，分別取50 μL置于棕色EP管中，加入400 μL的ABTS·+工作液，充分混合后在室溫下避光反應30 min，在734 nm處測量吸光度[9]。

(1)

用式(1)分別計算樣品對DPPH，ABTS·+自由基的清除率。式(1)中Ai為樣品溶液加DPPH或ABTS·+工作液的吸光度；Aj為樣品溶液加甲醇的吸光度；Ac為甲醇加DPPH或ABTS·+工作液的吸光度。

FRAP測定[7]：制備九個濃度水平的Trolox標準液與樣品稀釋液，分別取30 μL置于棕色EP管中，加入900 mL新配置的FRAP試劑混勻，在室溫下避光孵育30 min后，在593 nm處測定反應混合物的吸光度，結果以鮮重表示，即mmol·L-1TE·g-1FW。

1.4 光譜測定

近紅外光譜：光譜儀預熱1 h后，以空白比色皿為參比扣除背景后，取適量提取液于1 mm石英比色皿中。光譜采集波長范圍900～1 700 nm；光學分辨率為12.87 nm；每個樣本掃描100次取平均光譜。

激發(fā)發(fā)射熒光光譜：激發(fā)波長240～750 nm，波長掃描間隔2 nm；發(fā)射波長260～750 nm，波長間隔10 nm。取提取液適量置于10 mm石英皿中，掃描熒光光譜。

紫外-可見光譜：光譜儀開機預熱15 min后，UV-Vis光譜采集波長范圍190～1 100 nm；掃描間距1 nm；精度50。以純甲醇為空白，10 mm石英比色皿測定提取液的紫外-可見光譜。

各樣本重復制樣3次，每次實驗分別測定其活性成分含量、 抗氧化活性、 近紅外、 紫外-可見及熒光光譜，取3次實驗所得數(shù)據(jù)平均值或平均光譜用于數(shù)據(jù)分析。

2 結果與討論

2.1 提取物成分含量與活性的分布特征

八個產(chǎn)地301個不同批次刺梨鮮果的甲醇提取物樣本中富含酚類、 黃酮類、 三萜類物質，其含量分別為9.23～37.45，8.80～27.96和6.91～22.62 mg·g-1FW(表1)。不同產(chǎn)地不同批次的樣本中活性成分含量差異較大，最高含量幾乎是最低含量的4倍。樣本的活性指標數(shù)據(jù)范圍寬、 變化大：DPPH自由基清除率的范圍是14.39%～83.19%，ABTS清除率為18.50%～68.45%，F(xiàn)RAP的當量范圍0.08～0.44 mmol·L-1TE·g-1FW(表1)。

采用Kolmogorov-Smirnov方法檢驗提取物樣本中總酚、 總黃酮、 總三萜含量和DPPH，ABTS，F(xiàn)RAP抗氧化活性指標數(shù)據(jù)的分布特征[10]。以總酚含量為例進行討論。剔除10個金刺梨和5個刺梨異常值樣本(采用正態(tài)分布四分位數(shù)法檢測異常值)，對余下的286個樣本的總酚含量進行正態(tài)性檢驗。總酚含量的檢驗統(tǒng)計量對應的P值為0.20，顯著大于0.05的水平，總酚含量的頻數(shù)直方圖與理論的正態(tài)分布曲線之間的Pearson相關系數(shù)(r)大于0.98，表明提取物樣本的總酚含量服從正態(tài)分布。286個樣本中的總酚含量的均值(mean)為18.99 mg·g-1FW，標準偏差(std)為3.51 mg·g-1FW，其相對變化程度達到18.46%，如表2。

表2 刺梨提取物樣本中活性成分及抗氧化活性的分布特征Table 2 Description of phytochemicals and antioxidant activities of RRT extracts in terms of distributing characteristics

實驗證實了刺梨鮮果是較好的植物酚類物質來源。檢驗其余5個指標數(shù)據(jù)的分布特征：各統(tǒng)計量對應的P值均大于0.05的顯著性水平，基本上都服從正態(tài)分布，它們的頻數(shù)分布直方圖均呈現(xiàn)出形狀較為規(guī)則的或者近似的正態(tài)分布曲線(r≥0.97)(表2)，表明實驗用的不同批次的刺梨樣本具有多樣性、 代表性、 隨機性。

實驗用刺梨鮮果主要來自貴州的五個種植基地：AS，BJ，GD，LL和LPS。檢驗五個不同產(chǎn)地的刺梨樣本提取物中活性成分含量與抗氧化活性的分布情況，發(fā)現(xiàn)每個產(chǎn)地樣本的每個指標數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，而且方差齊性。例如，五個產(chǎn)地的樣本中總黃酮的平均含量約為15.00～16.00 mg·g-1FW，其變化的偏差值不大，畢節(jié)、 貴定、 龍里的刺梨黃酮含量略高些。證明刺梨是較好的植物黃酮類物質來源。t檢驗和方差分析結果表明不同產(chǎn)地的刺梨果提取物中總酚、 總黃酮、 總三萜含量及DPPH、 ABTS、 FRAP活性都沒有統(tǒng)計學意義上的顯著性差異。即僅通過使用廣泛用于定量測定植物提取物的總酚、 總黃酮、 總三萜、 DPPH、 ABTS、 FRAP等幾個指標來衡量刺梨提取物的化學活性，是不客觀的，也不夠合適、 準確。

對301個樣本提取物的六個含量與活性指標量測數(shù)據(jù)進行主成分分析。5個主成分解釋了100%的數(shù)據(jù)方差，但主成分得分未能呈現(xiàn)出樣本與地域相關的差異趨勢，甚至不能區(qū)別開10個屬于不同品種的金刺梨樣本，即使它們的物質成分差異較大，驗證了這六個指標不能用于區(qū)別和判斷不同產(chǎn)地樣本的真實質量差別，不能用于樣本產(chǎn)地溯源分析。

總酚含量、 ABTS、 DPPH、 FRAP四個指標數(shù)據(jù)之間均有較大的相關性。其中，總酚含量與ABTS活性最相關(相關系數(shù)r=0.79)，ABTS與FRAP 活性較好地正相關(r=0.72)。總黃酮、 總三萜的含量與DPPH、 ABTS、 FRAP抗氧化活性的相關性不大。

理論上酚類物質含酚羥基數(shù)量越多，其抗氧化活性越強。研究認為物質的抗氧化活性取決于它們的整體結構，以及側基團的位置和類型[11]。DPPH活性測定受OH數(shù)量影響大，故福林酚法更適于測定抗氧化活性而并非總酚的含量，這解釋了福林酚法與抗氧化活性測定結果相關性較高的原因。福林酚法與ABTS法測定結果相關性最強，可能是由于ABTS與二氫查爾酮及黃烷酮也有良好的反應。

刺梨中富含(表)兒茶素、 槲皮素、 及山奈酚的衍生物等黃酮類成份。總黃酮的測定結果與抗氧化活性的關聯(lián)性不高(r≤0.26)，可能與總黃酮測定的影響因素有關。刺梨中含有的原花青素、 有機酸等化合物具有鄰苯二羥基，會和鋁離子絡合顯色影響測定結果；槲皮素及衍生物等與鋁離子絡合，在500 nm處沒有最大吸收，使測定結果偏小。因此，用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉對物質成分復雜的刺梨提取物樣本進行總黃酮含量測定，專屬性不強、 誤差較大。此外，抗氧化活性測定結果還受到溶劑、 pH、 及其他化合物干擾等多種因素影響，干擾過程復雜且具有不確定性，因此，難以評估真實的樣本抗氧化活性?？偡拥葴y定方法也不能客觀揭示樣本中相關化合物的真實含量。

2.2 光譜表征

刺梨提取物樣本的紫外-可見吸收光譜帶主要在190～390 nm區(qū)域，致使吸收強度超出儀器的量測范圍，出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，吸收光譜的選擇性差、 缺乏組份的特征性，如圖1(a)。故該區(qū)間的紫外-可見光譜不用作數(shù)據(jù)分析。相比而言，提取物的近紅外光譜具有多個吸收譜帶。1 150～1 250和1 400～1 500 nm分別是由化學物質的C—H官能團的二階倍頻、 N—H的一階倍頻振動所致。900～1 000和1 530～1 630 nm的吸收譜帶主要歸因于O—H官能團的一階倍頻、 C—H官能團的三階倍頻振動，以及R—OH，Ar—OH官能團的吸收[圖1(a)]。多酚、 黃酮類物質本身含有較多酚羥基結構，使得這些譜帶都有較強的光譜吸收。三萜類化合物中存在大量的C—H官能團，亦導致較強的光譜吸收。

由于提取液樣本的熒光光譜受到嚴重的一階(和二階)瑞利散射干擾[圖1(b)]，因此，在有效分析數(shù)據(jù)前使用平行因子法[12]消除瑞利散射的影響非常必要。熒光信號主要在370～690 nm的激發(fā)波長與650～750 nm的發(fā)射波長區(qū)域內(nèi)，并且強度大?？蓺w因于樣本中含有的多酚、 黃酮、 維生素、 氨基酸類具有熒光基團的化合物。但是，由于提取物原液中化學成分繁多而且濃度高，使其發(fā)生復雜的熒光內(nèi)濾效應。從原液稀釋50倍后測量的熒光光譜[圖1(b)的內(nèi)插圖]看出，熒光稀釋效應非常明顯：提取物原液在370～690 nm的激發(fā)波長與650～750 nm的發(fā)射波長區(qū)域內(nèi)的信號變?nèi)趸蛘呋鞠Р灰?，而熒光信號強度最大的譜峰卻在250～350 nm的激發(fā)波長與280～450 nm的發(fā)射波長區(qū)域內(nèi)。酚類化合物的激發(fā)波長約為275 nm，發(fā)射波長約為300 nm[13]；超氧化物歧化酶的激發(fā)與發(fā)射波長分別約為280和325 nm；維生素類的激發(fā)波長大致在300～350 nm，發(fā)射波長約為400 nm；氨基酸類化合物的激發(fā)波長范圍為230～290 nm，發(fā)射波長分別為280，330和445 nm。

圖1 (a)刺梨提取物樣本的紫外-可見與近紅外光譜融合數(shù)據(jù); (b)提取物原液及其稀釋50倍(內(nèi)插圖為扣除瑞利散射后的光譜)的激發(fā)發(fā)射熒光光譜

2.3 判別模型

2.3.1 紫外-可見與近紅外融合光譜

紫外-可見與近紅外光譜的融合數(shù)據(jù)(390～1 700 nm)可以提供更加豐富的樣本物質組成信息，對其進行穩(wěn)健主成分分析，有效剔除301個提取物中的30個異常量測樣本。剔除異常值后不同產(chǎn)地的樣本分別具有較好的均勻性與一致性。

由于環(huán)境、 溫度、 儀器狀態(tài)等因素影響樣本的光譜采集，導致不可避免的光譜噪聲、 散射效應、 以及基線漂移等干擾。為減少或消除這些干擾，應用二階導數(shù)預處理紫外-可見與近紅外光譜融合數(shù)據(jù)，并對所得的數(shù)據(jù)進行主判別變量(principal discriminant variate, PDV)分析，建立樣本的判別模型(圖2)。其中，用于優(yōu)化模型分類能力與穩(wěn)健性的關鍵參數(shù)λ設置為10-5。λ的取值減小，樣本類間距離增大而類內(nèi)距離減小，模型的分類能力增強；若λ的取值過小，模型則出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，穩(wěn)定性變差。從圖2中得分圖看出，(1)不同產(chǎn)地的刺梨樣本及金刺梨樣本彼此間能夠完全區(qū)分開，即不同產(chǎn)地樣本對應的判別變量得分類間方差足夠大，如51個AS樣本與45個BJ樣本的得分類間方差為1.58×10-5；(2)同一產(chǎn)地的不同批次樣本幾乎完全聚集在一起，即相同產(chǎn)地不同批次樣本間的類內(nèi)方差小，如放大的內(nèi)插圖為51個AS樣本的判別得分，橢球形表示95%的置信區(qū)域，其類內(nèi)方差是1.60×10-6，而45個BJ樣本的類內(nèi)方差是1.69×10-6；(3)不同產(chǎn)地樣本的類間方差遠大于相同產(chǎn)地不同批次樣本間的類內(nèi)方差，AS與BJ樣本判別得分的類間方差幾乎是其類內(nèi)方差的10倍。

圖2 紫外-可見-近紅外光譜數(shù)據(jù)的PDV模型得分圖, 內(nèi)插圖表示51個AS樣本的主判別得分

2.3.2 熒光光譜

由于金刺梨樣本與刺梨樣本的化學成分存在較大差異性，僅針對八個產(chǎn)地的257個刺梨樣本即可進行消除瑞利散射影響后的熒光光譜數(shù)據(jù)判別分析及樣本產(chǎn)地溯源。同時，比較中心化(mean-centering, MC)、 多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)、 二階導數(shù)(2ndDerivative)三種數(shù)據(jù)預處理對樣本判別分析的影響。在PDV方法中，參數(shù)λ設置為10-2時，計算樣本的主判別變量得分的類間方差(SSbetween)與類內(nèi)方差(SSwithin)的比值(ratio)，衡量不同產(chǎn)地樣本的分離效果(表3)。從中能夠觀察到：(1)種植基地LL的刺梨與GD，GY樣本的化學組成的熒光光譜信息更接近，其各自的類間方差與類內(nèi)方差的比值要小些，可能的原因是這三個地域相鄰、 刺梨生長環(huán)境因素相似；(2)AS與LPS的刺梨樣本差異性較大(類間方差與類內(nèi)方差的比值最大)，與BJ刺梨的區(qū)別也略為明顯；(3)多元散射校正與中心化(MSC+MC)處理熒光光譜數(shù)據(jù)導致最好的樣本判別分離效果，對應的AS與LPS樣本的類間方差與類內(nèi)方差的比值達到2.03×104?？梢?，熒光光譜經(jīng)過適當?shù)臄?shù)據(jù)預處理后，結合PDV模型，能夠有效識別不同產(chǎn)地來源的刺梨樣本的差異性。

表3 不同產(chǎn)地的刺梨提取物樣本的熒光光譜經(jīng)過不同的數(shù)據(jù)預處理后的類間方差與類內(nèi)方差分析Table 3 Analysis of SSbetween to SSwithin of two RRT extract sample sets from typicalregions resulted from the EEM spectra with different preprocessing

3 結 論

刺梨是貴州特色的具有農(nóng)業(yè)經(jīng)濟價值的藥食兩用植物，其化學物質成分因產(chǎn)地不同而存在差異性。通過化學方法測量該植物提取物的DPPH、 ABTS、 FRAP、 總酚、 總黃酮、 總三萜含量判斷其活性是不準確的。采用近紅外、 紫外-可見、 熒光光譜技術整體表征刺梨果提取物的化學組成是可行的，PDV光譜模型能夠對刺梨樣本進行產(chǎn)地溯源分析，為刺梨的質量評價以及選種工作等提供借鑒，為研究其他的藥食用植物提供方法學參考。