近紅外H2S熒光探針研究進(jìn)展

宋江濤，袁躍華，朱永軍，王玉珍，田茂忠，馮 鋒

山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 大同 037009

引 言

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是活性硫家族的成員之一，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和其他參與人類健康和疾病的基本信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。比如H2S可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、 內(nèi)分泌、 神經(jīng)、 介導(dǎo)炎癥、 細(xì)胞凋亡、 血管擴(kuò)張和胃腸系統(tǒng)等，但其代謝異常又會(huì)導(dǎo)致許多疾?。喝绾嗤㈩D病，帕金森病和阿爾茨海默氏病等。內(nèi)源性H2S一般可在三種不同酶的作用下由L-半胱氨酸產(chǎn)生：胱硫醚β-合成酶(CBS)，胱硫醚γ-裂合酶(CSE)和3-巰基丙酮酸磺基轉(zhuǎn)移酶(3-MST)，酶的催化使得在不同組織和細(xì)胞中產(chǎn)生的H2S含量不同。H2S作為一種重要的信號(hào)分子，已引起人們對(duì)其與生理和病理相關(guān)的分子機(jī)制的關(guān)注，這也導(dǎo)致準(zhǔn)確檢測H2S濃度的迫切需求和重要性。目前，檢測硫化氫的主要方法有: 比色法、 電化學(xué)法、 氣相色譜、 金屬誘導(dǎo)硫沉淀法等，相比較而言，熒光分子探針及成像技術(shù)具有靈敏度高、 分辨率高、 非放射性、 價(jià)格低、 實(shí)時(shí)、 對(duì)生物體無損傷等優(yōu)點(diǎn)[1]。為了更好地檢測細(xì)胞和生物體內(nèi)H2S濃度，很多科學(xué)家開發(fā)了近紅外熒光探針(發(fā)射波長在650～1 700 nm)，與短波長激發(fā)的熒光探針相比，NIR熒光探針背景干擾少，可以穿透更深層次的組織，并且具有更高的信噪比，對(duì)細(xì)胞損傷也更小。

近年來，文獻(xiàn)報(bào)道的近紅外型H2S熒光探針主要識(shí)別機(jī)理[2]包括：(1)基于H2S親核取代反應(yīng)；(2)基于H2S還原反應(yīng)；(3)基于二硫鍵反應(yīng)；(4)基于加成反應(yīng)。本文綜述了近三年近紅外熒光探針對(duì)H2S的識(shí)別機(jī)理、 探針的性能及其在細(xì)胞或生物體中的熒光成像應(yīng)用，并展望了近紅外H2S熒光探針的發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景。

1 近紅外H2S熒光探針

1.1 基于親核取代反應(yīng)的近紅外H2S熒光探針

硫化氫(H2S)在水溶液中依次水解成HS-和S2-，在生理pH下主要以陰離子狀態(tài)存在。HS-和S2-是強(qiáng)親核試劑，這提供了選擇性檢測H2S的可能性?；谟H核取代反應(yīng)的H2S熒光探針的識(shí)別基團(tuán)多為強(qiáng)吸電子基團(tuán)，這些識(shí)別基團(tuán)具有易修飾，響應(yīng)快，選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，故被廣泛用于構(gòu)建近紅外H2S熒光探針。

1.1.1 基于2,4-二硝基苯醚(DNP)硫解的近紅外H2S熒光探針

2,4-二硝基苯本身帶有強(qiáng)吸電子的硝基，因此2,4-二硝基苯基探針一般呈猝滅熒光態(tài)，本身熒光量子產(chǎn)率低；但在和H2S反應(yīng)后，2,4-二硝基苯離去，探針熒光恢復(fù)?；谝子谥苽涞亩杌惙馉柾獰晒鈭F(tuán)，Qian等[3]設(shè)計(jì)合成了一種在生物系統(tǒng)中使用的鄰甲醛基輔助硫解DNP醚NIR熒光探針[圖1(a)]。此探針對(duì)H2S具有高靈敏度和選擇性，加入H2S后，熒光增強(qiáng)160倍，響應(yīng)時(shí)間15 min，檢測限(LOD)為58.797 nmol·L-1，斯托克斯位移(Stokes)為170 nm。該探針成功應(yīng)用于生物系統(tǒng)(活細(xì)胞、 組織和小鼠)中H2S熒光成像。

圖1 基于DNP的H2S熒光探針結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of DNP-based fluorescent probes for H2S

采用花菁染料，Lin等[4]研制出一種新型高水溶性硫化氫NIR熒光探針[圖1(b)]。此探針對(duì)H2S的快速響應(yīng)時(shí)間為2 min，在PBS緩沖水溶液中對(duì)H2S的LOD為11 nmol·L-1，具有大的斯托克斯位移(90 nm)，對(duì)H2S檢測具有高選擇性，無需有機(jī)溶劑或表面活性劑的輔助。當(dāng)和H2S反應(yīng)后，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)過程被阻斷，探針在680 nm處熒光增強(qiáng)了115倍。在純生物環(huán)境中此探針快速檢測有利于體內(nèi)和體外樣品中H2S的監(jiān)測。探針具有溶酶體靶向性，能夠檢測酶促/非酶促生物合成H2S。該探針已成功用于活體小鼠H2S檢測。

Zhao等[5]選擇具有良好化學(xué)穩(wěn)定性的長沙近紅外染料CS-OH作為熒光團(tuán)設(shè)計(jì)合成了一種新的線粒體靶向NIR硫化氫熒光探針[圖1(c)]。在PBS緩沖液(pH 7.4，包含1%DMSO作為溶劑)中加入H2S，探針在660 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的熒光發(fā)射峰；堿性條件下(670 nm激發(fā))，在720 nm處出現(xiàn)新的熒光發(fā)射峰，這分別歸因于CS-OH的酚形式和酚酸根離子形成。該探針化學(xué)穩(wěn)定性好，對(duì)H2S響應(yīng)快速，可高靈敏、 高選擇檢測H2S，LOD為89.3 nmol·L-1。此探針還成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)活HeLa細(xì)胞中外源性與內(nèi)源性H2S熒光成像。

亞氨基香豆素苯并噻唑(ICBT)熒光團(tuán)因其高光穩(wěn)定性和高熒光量子產(chǎn)率而備受關(guān)注，2020年，基于HS-引發(fā)的兩步串聯(lián)反應(yīng)(硫解和環(huán)化反應(yīng))形成ICBT骨架導(dǎo)致熒光增強(qiáng)機(jī)理，Zhong等[6]報(bào)道了一種NIR硫化氫熒光探針[圖1(d)]。在PBS和THF的混合溶液中(10 mmol·L-1，pH 7.4，30%THF)，探針本身不發(fā)熒光，當(dāng)加入10當(dāng)量的HS-時(shí)，用562 nm波長的光激發(fā)下，該探針發(fā)出紅色熒光，652 nm處熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了200倍。該探針具有大斯托克斯位移(126 nm)，對(duì)H2S表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性，其LOD為38.3 nmol·L-1。應(yīng)用研究表明，此探針可以靈敏地檢測紅酒、 天然水、 活細(xì)胞中的H2S，并且可以用于定性檢測H2S試紙條。

1.1.2 基于硝基苯并噁二唑(NBD)親核取代的近紅外H2S熒光探針

以NBD醚為反應(yīng)位點(diǎn)Gong等[7]設(shè)計(jì)合成了一種新型NIR硫化氫熒光探針[圖2(a)]，該探針在37 ℃的Tris-HCl緩沖液(含20%THF)中可以選擇性識(shí)別H2S，可對(duì)H2S快速響應(yīng)(小于3 min)，具有大Stokes位移(166 nm)和高靈敏度(LOD: 26 nmol·L-1)。隨著H2S的加入，探針在744 nm處形成一個(gè)新的熒光發(fā)射峰，熒光強(qiáng)度增大40倍。該探針已成功應(yīng)用于活細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性H2S的熒光成像以及活小鼠中H2S的快速成像。

基于雙氰基異佛爾酮Huang等[8]開發(fā)了一種NIR硫化氫熒光探針[圖2(b)]。H2S可以特異性誘導(dǎo)NBD胺鍵硫解，從探針上裂解NBD部分，從而釋放出雙氰基異佛爾酮基團(tuán)。在PBS溶液中，隨著Na2S濃度(0～100 μmol·L-1)的不斷增加，探針7在670 nm處的熒光明顯增強(qiáng)，斯托克斯位移為186 nm，對(duì)H2S的LOD為0.03 μmol·L-1。該探針對(duì)H2S具有很高的選擇性，已成功應(yīng)用于不同腫瘤細(xì)胞和肝組織中的內(nèi)源性H2S成像。

以香豆素類熒光團(tuán)為受體，4-氨基-硝基苯并噁二唑和1,8-萘二甲酰亞胺作為能量供體，Zhang等[9]報(bào)道了兩種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的比率H2S熒光探針[圖2(c, d)]。探針識(shí)別機(jī)理是HS-和酰亞胺碳的親核加成破壞了花菁熒光團(tuán)的大共軛體系，導(dǎo)致其近紅外吸收的急劇減弱，阻斷了FRET過程，綠色熒光增強(qiáng)。在PBS水溶液中，隨著NaHS量增加，探針[圖2(c)]在665 nm處的熒光強(qiáng)度明顯減弱，而530 nm處的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，當(dāng)H2S的濃度從0增加到200 μmol·L-1時(shí)，熒光強(qiáng)度比F530/F665從0.75增加到7.6，量子產(chǎn)率從0.6%增大到5.0%，該探針的LOD約為0.5 μmol·L-1，并已成功應(yīng)用于HepG-2細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性H2S的熒光成像。探針[圖2(d)]的FRET效率較低，LOD約為1.0 μmol·L-1，加入H2S后，F(xiàn)540/F660從2.6增加到7.8，量子產(chǎn)率從0.3%增大到1.5%。

2020年，基于亞甲藍(lán)熒光團(tuán)Wei等[10]開發(fā)了一種NIR硫化氫熒光探針[圖2(e)]。在C2H5OH∶PBS緩沖水溶液中，加入H2S后，NBD基團(tuán)裂解離去，684 nm處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，顯示出強(qiáng)紅色熒光，其熒光強(qiáng)度增大約60倍，檢測H2S的LOD為4.3×10-7mol·L-1。該探針可用于細(xì)胞熒光成像，還可作為解硫化物中毒的藥物。

1.1.3 基于2,4-二硝基苯磺酰(DNBS)的近紅外H2S熒光探針

使用BODIPY衍生的三苯胺作為熒光團(tuán)，Li等[11]構(gòu)建了一種用于H2S檢測的新型NIR熒光探針[圖3(a)]，該探針在THF和PBS緩沖液的混合溶液中，加入H2S后，探針在716 nm處熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。探針具有以下優(yōu)點(diǎn)：對(duì)H2S響應(yīng)迅速(<150 s)，靈敏度高(LOD為6.74 nmol·L-1)，近紅外發(fā)射(716 nm)，選擇性好。該探針已成功用于HCT116細(xì)胞內(nèi)源H2S的熒光成像。

基于具有優(yōu)異性能的二氰基異佛爾酮熒光染料，Hong等[12]設(shè)計(jì)合成了一種新型NIR硫化氫熒光探針[圖3(b)]，該探針引入DNBS，首次利用磺酰胺作為H2S的反應(yīng)位點(diǎn)，更重要的是它對(duì)H2S具有快速(響應(yīng)時(shí)間小于1 min)、 高選擇性和高靈敏度(LOD：6 nmol·L-1)響應(yīng)，具有明亮的近紅外熒光輸出(熒光增強(qiáng)大于130倍)，具有顯著的大Stokes位移(221 nm)。而且，它具有較低的細(xì)胞毒性，已成功用于活HeLa細(xì)胞和活鼠體內(nèi)H2S的跟蹤和成像。

基于四氫喹喔啉亞胺香豆素Feng等[13]開發(fā)了一種NIR硫化氫熒光探針[圖3(c)]。該探針具有快速、 明顯的近紅外熒光開啟檢測H2S的過程，具有很高的選擇性和靈敏度(LOD為10 nmol·L-1)。加入NaHS后，在2 min內(nèi)探針在652 nm處的熒光強(qiáng)度增大約35倍。此外，該探針具有顯著的大Stokes位移(128 nm)和低細(xì)胞毒性，已成功用于活HeLa細(xì)胞外源性H2S和活RAW264.7細(xì)胞內(nèi)源性H2S的熒光成像，同時(shí)，此探針也成功用于活鼠實(shí)時(shí)成像。

圖2 基于NBD的H2S熒光探針結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of NBD-based fluorescent probes for H2S

1.1.4 其他基于親核取代反應(yīng)的近紅外H2S熒光探針

可激活近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ)熒光探針在深層組織成像中應(yīng)用前景廣闊。Dou等[14]提出了一種靈活的策略來調(diào)節(jié)NIR-Ⅱ熒光探針的發(fā)射波長，基于D-π-A分子骨架設(shè)計(jì)合成了四種NIR-Ⅱ的H2S熒光探針[圖4(a—c)]。通過延長BODIPY熒光團(tuán)π共軛體系和增強(qiáng)供體的供電子能力，這些探針被H2S激活時(shí)的最大熒光發(fā)射峰可以從925 nm紅移至1 205 nm。經(jīng)過光物理性能評(píng)價(jià)，探針[圖4(c)]在H2S激活后表現(xiàn)出高靈敏度(LOD為51 nmol·L-1)和高選擇性，斯托克斯位移大(>215 nm)、 快速響應(yīng)和長波段NIR-Ⅱ熒光發(fā)射(最大熒光發(fā)射峰在1 140 nm)的理想組合，該探針已成功應(yīng)用于荷瘤小鼠內(nèi)源性H2S生成和波動(dòng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測。此外，通過熒光成像發(fā)現(xiàn)H2S濃度與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)。

圖4 其他基于親核反應(yīng)H2S熒光探針結(jié)構(gòu)Fig.4 Chemical structures of other H2S fluorescent probes based on nucleophilic attack

通過熒光成像和光聲成像優(yōu)勢互補(bǔ)，Chen等[15]報(bào)道了比率光學(xué)/PA雙模態(tài)H2S探針[圖4(e)]，該探針通過苯甲酰氯與中位羥基取代七甲川菁染料反應(yīng)合成，識(shí)別H2S是基于酮-烯醇異構(gòu)化傳感機(jī)理。在HEPES緩沖溶液中，探針的最大熒光發(fā)射峰在805 nm處，隨著H2S濃度的增加，其630 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，805 nm處的熒光強(qiáng)度隨之減弱，發(fā)射比F630/F805呈線性增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度增大183倍，對(duì)H2S的LOD為0.5 μmol·L-1，該探針選擇性好。通過光學(xué)/PA雙模成像證實(shí)了s-腺苷-甲硫氨酸刺激的內(nèi)源性H2S在肝臟中增強(qiáng)，證明比率光學(xué)/PA雙模成像是追蹤活鼠和組織中信號(hào)小分子濃度增大的有效方法，這將預(yù)示光學(xué)和PA成像結(jié)合起來具有廣闊的應(yīng)用前景。

Wang等[16]研制了一個(gè)由H2S激活熒光成像探針[圖4(f)]。在PBS緩沖液中，加入100 μmol·L-1H2S，500 nm處的吸收峰強(qiáng)度明顯下降，同時(shí)655 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，探針紅移155 nm，在712 nm處熒光增強(qiáng)137倍。該探針對(duì)H2S的檢測靈敏度高，NIR熒光隨H2S濃度(0～20 μmol·L-1)呈線性增加，LOD為21 nmol·L-1。所設(shè)計(jì)的探針具有H2S引發(fā)近紅外熒光點(diǎn)亮與有效生成1O2的優(yōu)點(diǎn)，能夠選擇性地可視化富含H2S的癌癥。這種可控的光動(dòng)力抗癌治療使治療效率最大化，副作用最小化。值得注意的是，納米封裝的設(shè)計(jì)加速了探針對(duì)于H2S的響應(yīng)反應(yīng)。報(bào)道說該項(xiàng)工作將促進(jìn)在癌癥的精確診斷和治療方面的明顯進(jìn)步。

2020年，Wang等[17]報(bào)道開發(fā)出對(duì)H2S聚集增強(qiáng)響應(yīng)的NIR小分子探針[圖4(g,h)]，其可用于體內(nèi)富含H2S癌癥的靶向成像。探針設(shè)計(jì)引入的N-乙基吡啶對(duì)親水性和親脂性平衡的微妙調(diào)節(jié)使這些探針具有在生理?xiàng)l件下自發(fā)自組裝成納米探針的能力。處于聚集態(tài)而不是分子溶解態(tài)的這種探針在H2S特異性激活時(shí)顯示近紅外熒光，光聲信號(hào)打開，根據(jù)體內(nèi)H2S含量差異實(shí)現(xiàn)癌癥的可視化和分化。在CH3CN/Tris-HCl緩沖體系中，加入H2S后，探針和H2S發(fā)生反應(yīng)，在718 nm處的熒光明顯增強(qiáng)，聚集態(tài)的探針[圖4(g)]對(duì)H2S的LOD為60 nmol·L-1，該探針已成功應(yīng)用于HCT116細(xì)胞和荷瘤小鼠中內(nèi)源性H2S的成像，且可用于區(qū)分癌癥細(xì)胞和正常細(xì)胞，此外，在對(duì)探針的識(shí)別機(jī)理探究中發(fā)現(xiàn)探針的正電荷密度對(duì)HS-富集有重要影響，它可以誘導(dǎo)和加快反應(yīng)速度。當(dāng)探針[圖4(h)]在FW(80%～100%)緩沖體系中時(shí)出現(xiàn)聚集狀態(tài)，該聚集態(tài)探針可對(duì)H2S進(jìn)行特異性識(shí)別，744 nm的NIR吸收峰明顯增強(qiáng)，探針在聚集態(tài)下對(duì)H2S的LOD為760 nmol·L-1。

1.2 基于還原反應(yīng)的近紅外H2S熒光探針

H2S是一種強(qiáng)的還原劑，疊氮基與硝基都會(huì)被H2S還原，還原成氨基后，其電子性質(zhì)有明顯不同，此外，熒光母體上易引入疊氮基與硝基官能團(tuán)，因此，一些基于還原反應(yīng)的近紅外H2S熒光探針已被成功構(gòu)建。

1.2.1 基于疊氮化物還原的近紅外H2S熒光探針

為了確定細(xì)胞內(nèi)Ca2+在H2S體內(nèi)平衡中的作用，Wen等[18]制備了一種NIR硫化氫熒光探針[圖5(a)]，該探針由4-氨基苯甲醇和NaN3合成了4-疊氮基苯甲醇，然后，利用4-疊氮基苯甲醇與亞甲基藍(lán)的氨基甲酰氯衍生物之間的縮合反應(yīng)獲得探針。5 μmol·L-1的探針在DMSO/PBS緩沖水溶液中沒有明顯的熒光。加入160 μmol·L-1Na2S后，探針在687 nm處的熒光明顯增強(qiáng)，與H2S反應(yīng)后，探針的熒光量子產(chǎn)率從0.02增加到0.13，探針對(duì)H2S的 LOD為0.32 μmol·L-1，響應(yīng)時(shí)間為60 min。使用該探針，他們對(duì)Ca2+觸發(fā)HeLa細(xì)胞中過量的H2S水平進(jìn)行了成像，并研究了它們之間的依賴效應(yīng)。此外，報(bào)道還提供了一個(gè)Ca2+介導(dǎo)的活細(xì)胞H2S濃度劇增的潛在途徑，為活細(xì)胞復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了新的見解。

用NIR花箐染料作為熒光團(tuán)Zhou等[19]設(shè)計(jì)合成了一種新的基于PET的線粒體靶向NIR硫化氫熒光探針[圖5(b)]。在HEPES/乙醇緩沖水溶液中，當(dāng)加入H2S后，探針在736 nm處發(fā)射強(qiáng)熒光，其熒光量子產(chǎn)率由0.002增大到0.05，LOD為20 nmol·L-1, 響應(yīng)時(shí)間為30min。在0～40 μmol·L-1范圍內(nèi)，736 nm處的熒光強(qiáng)度與Na2S濃度之間呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系。該探針不受各種氨基酸和陰離子的干擾，檢測H2S選擇性好。其具有較低的細(xì)胞毒性、 良好的膜通透性和近紅外發(fā)射優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于活細(xì)胞線粒體和體內(nèi)H2S的成像。

Yao[20]等制備了基于疊氮基的一種高靈敏度和高選擇性的NIR熒光探針[圖5(c)]，該探針具有良好的穩(wěn)定性、 低LOD和生物安全性。探針的疊氮基提供了HS-的識(shí)別位點(diǎn)，質(zhì)子進(jìn)一步誘導(dǎo)中間體分解生成熒光染料。在pH 7.4的PBS緩沖液中加入NaHS，625 nm處的吸收峰強(qiáng)度降低，而710 nm處的新吸收峰穩(wěn)步增強(qiáng)，溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)榫G色，同時(shí)，735 nm處的熒光強(qiáng)度增大。該探針735 nm處的熒光強(qiáng)度與NaHS濃度(1～14當(dāng)量)之間存在線性關(guān)系，LOD為26.0 nmol·L-1，響應(yīng)時(shí)間為30 min。重要的是，該探針能夠監(jiān)測藥物在活細(xì)胞和小動(dòng)物體內(nèi)釋放的H2S。

1.2.2 基于硝基還原為胺的近紅外H2S熒光探針

基于ICT機(jī)理，Wu等[21]制備了一種基于異佛爾酮的NIR比率H2S熒光探針[圖6(a)]。在pH 7.4的PBS緩沖溶液中加入H2S，探針在565 nm處的熒光強(qiáng)度減弱，650 nm處出現(xiàn)新的熒光發(fā)射峰且熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，溶液顏色由黃色變?yōu)榧t色。該探針檢測H2S的靈敏度高(LOD為1.08 nmol·L-1)和響應(yīng)速度快(<120 s)。此外，MTT結(jié)果顯示，該探針具有低毒性，其可以對(duì)活癌細(xì)胞中H2S進(jìn)行熒光成像且已成功應(yīng)用于小鼠成像。

Kumar等[22]設(shè)計(jì)并合成了含有NO2和丙炔氧基兩個(gè)不同識(shí)別官能團(tuán)的苝二酰亞胺類H2S和Pd0雙分析NIR熒光探針[圖6(b)]。此探針具有高靈敏度和高選擇性，對(duì)H2S的LOD為1.21 nmol·L-1(紫外)，6.6 nmol·L-1(熒光)。此外，該探針在血清、 尿液和活A(yù)549細(xì)胞中檢測H2S和Pd0的實(shí)際應(yīng)用已得到證實(shí)。

1.3 基于二硫鍵反應(yīng)的近紅外H2S熒光探針

當(dāng)H2S在硫中心發(fā)生親核進(jìn)攻之后，生成的中間體也是一種硫醇，這種硫醇可以進(jìn)行第二次親核加成。這種雙親核性質(zhì)是H2S所特有的，一些基于二硫鍵反應(yīng)的近紅外H2S熒光探針已被成功開發(fā)。

基于親核取代環(huán)化反應(yīng)Men等[23]制備了新型近紅外H2S熒光探針[圖7(a)]。在DMSO-PBS緩沖水溶液中，當(dāng)加入S2-的濃度為20 μmol·L-1時(shí)，探針的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，680 nm處的熒光強(qiáng)度與H2S濃度(0～10 μmol·L-1)呈線性關(guān)系，探針對(duì)H2S的LOD為1.1 nmol·L-1。此探針在沒有H2S存在下對(duì)pH不敏感(pH 5.0～10.0)。該探針生物相容性較好，已成功應(yīng)用于活HeLa細(xì)胞中H2S的熒光成像。

基于“連續(xù)”親核取代反應(yīng)Wang等[24]開發(fā)了新型近紅外H2S熒光探針[圖7(b)]。加入H2S，探針熒光強(qiáng)度增大22倍(639 nm)，對(duì)H2S的LOD為36 nmol·L-1。此探針可以用于靶向線粒體，可用于檢測HeLa細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性H2S含量，由于其信噪比高，也適用于小鼠H2S的熒光成像。

1.4 基于加成反應(yīng)近紅外H2S熒光探針

HS-作為良好的親核試劑，可以加成到熒光分子缺電的碳碳雙鍵上，導(dǎo)致探針分子的π共軛體系破壞，引起熒光發(fā)射波長位移，此方法已被用于近紅外H2S熒光探針的開發(fā)。

基于親核加成反應(yīng)Ma等[25]制備出具有優(yōu)異H2S傳感性能的新型NIR熒光探針[圖7(c)]。此探針對(duì)其他生物相關(guān)的陰離子、 陽離子、 活性硫和小分子具有很強(qiáng)的選擇性，加入S2-，在655 nm處熒光強(qiáng)度逐漸降低，伴隨產(chǎn)生一個(gè)新的、 中心在595 nm處熒光強(qiáng)度逐漸增加的發(fā)射帶，兩個(gè)發(fā)射帶的強(qiáng)度比F595/F655從0.37增加到3.43。對(duì)H2S有較低的LOD(7.33 nmol·L-1)。此外，探針對(duì)H2S響應(yīng)快(反應(yīng)在20 s內(nèi)完成)，裸眼觀察其顏色由深藍(lán)色變?yōu)闇\綠色。研究發(fā)現(xiàn)該探針具有線粒體靶向能力，對(duì)HeLa細(xì)胞具有較低的細(xì)胞毒性，并已成功用于活細(xì)胞和斑馬魚體內(nèi)的H2S熒光成像與檢測。

基于激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)理，Du等[26]設(shè)計(jì)合成了一種新型的近紅外線粒體靶向熒光探針[圖7(d)]。加入H2S后，探針和H2S發(fā)生親核加成反應(yīng)導(dǎo)致共軛骨架被破壞，最大發(fā)射峰從658 nm藍(lán)移至470 nm。該探針具有響應(yīng)快(<30 s)、 選擇性好和斯托克斯位移大(188 nm)等優(yōu)點(diǎn)。此探針已成功用于HepG2細(xì)胞線粒體中外源性H2S熒光成像。

圖7 基于二硫鍵反應(yīng)(a和b)與加成反應(yīng)(c和d)的H2S熒光探針結(jié)構(gòu)Fig.7 Chemical structures of H2S fluorescent probes based on disulfideexchange (a and b) and addition reaction (c and d)

1.5 納米近紅外H2S熒光探針

將有機(jī)染料小分子引入納米粒子內(nèi)，不僅大大提高了被包裹熒光染料的光穩(wěn)定性，而且可以防止染料泄露，降低對(duì)細(xì)胞的毒性，更重要的是，可實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)放大。基于此已成功設(shè)計(jì)開發(fā)了一些納米近紅外H2S熒光探針。

基于親核取代反應(yīng)Shi[27]等開發(fā)了一種腫瘤生物標(biāo)志物激活的光熱傳感器作為按需釋放藥物的納米探針(圖8)，其特點(diǎn)是硫化氫介導(dǎo)原位產(chǎn)生近紅外光熱劑，用于成像引導(dǎo)和光控藥物釋放。用熱敏性納米材料將染料InTBOD-Cl與藥物CPT-11封裝包裹起來。在CH3CN和PBS的混合溶液中，加入NaHS后，InTBOD-Cl和NaHS發(fā)生反應(yīng)，生成InTBOD-SH，在808 nm光激發(fā)下，InTBOD-SH產(chǎn)生明亮的NIR-Ⅱ熒光，而在592 nm處的熒光被猝滅，納米探針可以高靈敏、 高特異性識(shí)別H2S，對(duì)富含H2S癌癥是一種很有前途的診斷工具，納米探針的NIR-Ⅱ熒光強(qiáng)度與0～50 mmol·L-1范圍NaHS濃度具有好的線性關(guān)系，LOD為79 nmol·L-1。該探針已成功應(yīng)用于HCT116小鼠的腫瘤測試。

圖8 H2S納米探針(NPs@BOD/CPT)示意圖[27]Fig.8 Schematic illustration of nanoprobe (NPs@BOD/CPT) for H2S[28]

Li等[28]研制了一種基于酸激活策略的激發(fā)波長為980 nm比率上轉(zhuǎn)換發(fā)光(UCL)納米探針(圖9)，用于溶酶體輔助線粒體靶向H2S的檢測和生物成像。將菁染料衍生物探針(TPAMC)改性的上轉(zhuǎn)化納米熒光粉UCNP(NaYF4: 20% Yb, 2% Er, 0.2% Tm)作為靶標(biāo)和響應(yīng)組分，UCNPs和TPAMC之間的強(qiáng)烈發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(LRET)效應(yīng)使得可以通過比率UCL信號(hào)靈敏地檢測H2S。為提高納米探針在血液循環(huán)中的空間位阻穩(wěn)定性，用對(duì)pH敏感的聚乙二醇把TPAMC-UCNP包裹起來。此探針不僅成功用于活細(xì)胞中線粒體產(chǎn)生H2S的UCL比率成像，通過NIR-UCL成像定位HCT116(人結(jié)直腸癌細(xì)胞系)腫瘤，而且也可以用于監(jiān)測結(jié)腸癌小鼠模型中線粒體H2S水平。

基于電致變色材料Wu等[29]報(bào)道了一種基于有機(jī)π電子結(jié)構(gòu)的EM 12+作為H2S響應(yīng)發(fā)色團(tuán)，通過摻雜到半導(dǎo)體聚合物納米顆粒(SPNs)開發(fā)出H2S激活NIR熒光探針(圖10)。

在PBS緩沖液中，加入H2S，探針在830 nm處熒光明顯增強(qiáng)，LOD為0.7 μmol·L-1。探針在830 nm的近紅外熒光可以提供更深的成像穿透，提高了非侵入性實(shí)時(shí)檢測小鼠肝臟H2S水平的靈敏度，有助于研究H2S相關(guān)的體內(nèi)肝臟功能障礙。通過方便的熒光成像，提供了高靈敏度、 特異性和快速動(dòng)力學(xué)，可以準(zhǔn)確測量人血漿中內(nèi)源性H2S濃度，此外在小鼠體內(nèi)注射探針和近紅外光照射后，基于H2S相關(guān)腫瘤的熒光成像實(shí)現(xiàn)了可激活光動(dòng)力治療(PDT)，提高了腫瘤治療的特異性和療效。

Xu等[30]通過將H2S響應(yīng)的熒光探針ZX-NIR和一種內(nèi)參比惰性染料aza-BOD封裝到核殼硅納米復(fù)合材料的疏水內(nèi)部開發(fā)了H2S近紅外二區(qū)納米探針(圖11)。該探針具有H2S激活的比率熒光和900～1 300 nm的NIR-Ⅱ發(fā)光。在CH3CN/PBS緩沖液中，加入H2S，5 min內(nèi)600 nm處探針的熒光完全猝滅，但是，當(dāng)激發(fā)波長為780 nm時(shí)，H2S激活了一個(gè)新的NIR-Ⅱ發(fā)射峰，最大發(fā)射峰為900 nm。比率檢測H2S靈敏度高，LOD為37 nmol·L-1。探針通過雙色成像方式可以選擇性鑒定富含H2S的結(jié)腸癌細(xì)胞。此外，論文進(jìn)一步探索了H2S觸發(fā)的探針NIR-Ⅱ成像，顯示了增強(qiáng)的深層組織穿透和空間分辨率。

為了開發(fā)內(nèi)源性H2S激活的光學(xué)探針用于特異性診斷結(jié)直腸癌，Deng等[31]研發(fā)了一種基于Ag-雞蛋清(Ag-CEW)復(fù)合物的H2S可激活NIR-Ⅱ發(fā)射納米探針(圖12)。所設(shè)計(jì)的Ag-CEW配合物通過內(nèi)源性H2S誘導(dǎo)的原位化學(xué)反應(yīng)形成Ag2S量子點(diǎn)，在1 090 nm附近有一個(gè)很強(qiáng)的NIR-Ⅱ發(fā)射峰。通過檢測得到LOD為35 nmol·L-1。設(shè)計(jì)的Ag-CEW配合物具有良好的光穩(wěn)定性和生物相容性，通過內(nèi)源性H2S激活，成功用于NIR-Ⅱ成像引導(dǎo)下的HCT-116細(xì)胞熒光成像與結(jié)直腸癌特異性可視化和精確定位。

圖9 H2S納米探針(TPAMC-UCNPs@PEG)示意圖[28]Fig.9 Schematic illustration of nanoprobe (TPAMC-UCNPs@PEG) for H2S[28]

圖11 多波長H2S納米探針結(jié)構(gòu)示意圖[30]Fig.11 Schematic illustration of multi-wavelength nanoprobe for H2S[30]

2 結(jié)論與展望

H2S是一種具有重要生理功能的內(nèi)源性氣體，為了更好地探索H2S在生理和病理中的動(dòng)態(tài)作用，近紅外熒光探針技術(shù)發(fā)展迅速。本文綜述了近三年近紅外H2S熒光探針的研究進(jìn)展，文中例子證明其已取得了很大進(jìn)步。很多探針已能用于細(xì)胞和生物體內(nèi)H2S熒光成像，但由于細(xì)胞與生物體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，檢測時(shí)干擾因素多，開發(fā)高性能生物用近紅外H2S熒光探針仍具有很大挑戰(zhàn)。多數(shù)報(bào)道的近紅外H2S有機(jī)小分子熒光探針檢測H2S時(shí)都需要加入有機(jī)助劑，而且多數(shù)探針響應(yīng)H2S時(shí)間較長。為了實(shí)現(xiàn)近紅外探針在細(xì)胞與生物體內(nèi)對(duì)H2S的無毒、 實(shí)時(shí)檢測應(yīng)用，科學(xué)家開始研制納米近紅外探針。一般情況下H2S納米探針的水溶性好、 檢測速度快、 LOD低，具有更好光物理性質(zhì)和更高靶向性，更有利于在生物方面的應(yīng)用，因此開發(fā)對(duì)H2S具有優(yōu)異識(shí)別性能的NIR納米熒光探針也是目前研究的熱點(diǎn)課題之一。此外，生物體內(nèi)有很多其他物種，比如，生物硫醇、 其他氣體信號(hào)分子一氧化氮和一氧化碳等，很多生理與病理過程受到H2S與它們相互作用“crosstalk”的影響，所以，設(shè)計(jì)開發(fā)NIR熒光探針對(duì)它們相互作用進(jìn)行原位、 實(shí)時(shí)、 動(dòng)態(tài)的可視化檢測具有重要意義。期望此綜述將有助于設(shè)計(jì)高性能近紅外熒光探針來檢測活細(xì)胞與活體中的H2S。

圖12 Ag-CEW納米探針合成過程示意圖和內(nèi)源性H2S觸發(fā)的結(jié)腸癌高特異性可視化[31]