喬松素抑制人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS增殖、遷移和侵襲

李 洵，付曉霞，樊麗偉，汪景坤，張東姣，趙炎煥，張 磊，趙玉紅

(中國(guó)人民解放軍陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院 消化內(nèi)科, 河北 保定 071000)

胃癌(gastric cancer)是全球最常見的惡性腫瘤。中藥有效成分在腫瘤輔助治療中具有明顯的治療效果，有較好療效[1-2]。開發(fā)新的治療胃癌的有效中藥成分是防治胃癌的重要途徑。喬松素(pinocembrin)是一種黃酮化合物，且抗炎、抗腫瘤等作用明顯[3-4]。喬松素通過下調(diào)N-cadherin和GABAB受體的mRNA水平來抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移并促進(jìn)其凋亡[5]。喬松素可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并抑制黑色素瘤的自噬[6]。說明喬松素具有抗癌作用，但其對(duì)胃癌的影響及作用機(jī)制尚不清楚。研究表明miR-34a-5p高表達(dá)促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞凋亡[7]。KLF5和MYC調(diào)節(jié)的LINC00346通過調(diào)控miR-34a-5p促進(jìn)胃癌的進(jìn)展并顯示不良預(yù)后[8]。然而喬松素影響胃癌進(jìn)展的作用是否涉及miR-34a-5p仍然未知。因此，本研究重點(diǎn)考察喬松素是否通過miR-34a-5p影響胃癌細(xì)胞的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 主要材料

RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS(ATCC公司)； 喬松素(純度: HPLC≥98%，上海聯(lián)祖生物科技有限公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；蛋白提取試劑盒(Invent公司)；MMP2、MMP9、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT多克隆抗體(巴傲得生物科技有限公司)；山羊抗兔IgG-HRP(AAT Bioquest公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組: 將AGS細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，分別用50、100、200、400 μmol/L的喬松素處理AGS細(xì)胞，不作任何處理的細(xì)胞作為NC組(normal control)；將miR-34a-5p抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞后用200 μmol/L的喬松素處理，記為200 μmol/L pinocembrin +anti-miR-NC組、200 μmol/L pinocembrin +anti-miR-34a-5p組。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：分別收集1.2.1中各組AGS細(xì)胞接種至96孔板， 2×103個(gè)/孔，并保持48 h。之后與的CCK-8溶液10 μL反應(yīng)，吸光度(A)值在450 nm處酶標(biāo)儀讀取。

1.2.3 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：各組AGS細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩次，加入預(yù)冷70%乙醇，于4 ℃固定過夜，4 ℃避光環(huán)境中加入500 μL PBS(含50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.2% Triton X-100)，并保持30 min。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析各周期變化。

1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲和遷移：分別收集各組AGS細(xì)胞，于無血清的培養(yǎng)液中饑餓培養(yǎng)12 h，吸去培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL。在小室中添加100 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗細(xì)胞，加甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色，20 min后PBS清洗。侵襲：Matrigel包被小室底部膜的上室，按遷移實(shí)驗(yàn)操作。遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)均在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)：分別收集各組AGS細(xì)胞，利用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)后進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜。膜封閉1 h后依次加入一抗(1∶1 000，4 ℃)、二抗(1∶2 000，室溫)分別孵育12 h、2 h。用ECL顯影，以目的條帶/內(nèi)參β-actin條帶的吸光度值之比來分析蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平。其中一抗為MMP2、MMP9、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT、β-actin。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)AGS細(xì)胞miR-34a-5p表達(dá):Tizol法提取各組AGS細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(模板)在95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算miR-34a-5p表達(dá)水平。其中miR-34a-5p上游引物5′-TGGCAGTGTCTT AGCTGGTTGT-3′，下游引物5′-GCGAGCACAGAATT AATACGAC-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCA CATATACTAA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAA TTTGCGT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 喬松素抑制AGS細(xì)胞增殖

與NC組比較，喬松素各濃度組AGS細(xì)胞增殖活性和S期細(xì)胞比例降低，G0/G1期細(xì)胞比例升高(P<0.05)(圖1，表1)。

表1 不同濃度喬松素對(duì)AGS細(xì)胞增殖活性及周期的影響

圖1 不同濃度喬松素對(duì)AGS細(xì)胞周期的影響

2.2 喬松素對(duì)AGS細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用

不同濃度喬松素處理后AGS細(xì)胞后，MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)水平低于NC組，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量低于NC組(P<0.05)(圖2，表2)。

表2 喬松素對(duì)AGS細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用

A.Transwell chamber assay detected cell migration and invasion(×200)；B.Western blot detected the inhibitory effect of pinocembrin on MMP2 and MMP9 protein expression in AGS cells

2.3 喬松素對(duì)miR-34a-5p表達(dá)的影響

不同濃度喬松素處理后AGS細(xì)胞后，與NC組比較，miR-34a-5p的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)(表3)。

表3 喬松素對(duì)miR-34a-5p表達(dá)的影響

2.4 anti-miR-34a-5p可以減輕喬松素對(duì)AGS細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的影響

與200 μmol/L pinocembrin +anti-miR-NC組比較，200 μmol/L pinocembrin +anti-miR-34a-5p組AGS細(xì)胞中miR-34a-5p的表達(dá)水平、G0/G1期細(xì)胞比例降低，MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量以及S期細(xì)胞比例升高(P<0.05)(圖3，表4)。

表4 Anti-miR-34a-5p可以減輕喬松素對(duì)胃癌細(xì)胞AGS增殖、遷移和侵襲以及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

A.flow cytometry to detect cell cycle; B.Transwell chamber assay detected cell migration and invasion(×200); C.Western blot determined the roles of pinocembrin and anti-miR-34a-5p on MMP2 and MMP9 protein expression in AGS cells

2.5 PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況

與NC組比較，200 μmol/L pinocembrin組p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)；與200 μmol/L pinocembrin+anti-miR-NC組比較，200 μmol/L pinocembrin+anti-miR-34a-5p組p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖4，表5)。

表5 PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況

圖4 Western blot檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)

3 討論

研究表明，黃酮類化合物具有抗腫瘤作用，如從墨脫大苞鞘花分離出的黃酮類化合物喬松素可通過失活MAPK途徑來誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯并觸發(fā)凋亡[9]；還誘導(dǎo)了大腸癌細(xì)胞系HCT 116的凋亡[10]。喬松素可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞Y-79的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[11]。以上研究均提示喬松素在多種惡性腫瘤發(fā)揮抗癌作用。為研究其對(duì)胃癌的作用，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的喬松素對(duì)AGS細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的喬松素處理后，AGS細(xì)胞的增殖活性、S期細(xì)胞比例、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平以及遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量均降低，G0/G1期細(xì)胞比例升高，提示喬松素抑制了胃癌AGS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

研究報(bào)道m(xù)iR-34a-5p在胃癌中下調(diào)表達(dá)[12]。且研究表明miR-34a-5p高表達(dá)促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞凋亡[7]。以上研究表明miR-34a-5p參與胃癌的進(jìn)展過程，且可能起抑癌作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的喬松素處理的胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中miR-34a-5p的表達(dá)水平升高；喬松素抑制AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的效果在anti-miR-34a-5p處理得以改善。因此，上調(diào)miR-34a-5p表達(dá)可能是喬松素影響胃癌進(jìn)展的重要途徑之一，然后喬松素是對(duì)miR-34a-5p表達(dá)的影響是直接或間接尚不清楚。

研究報(bào)道激活 PI3K/AKT通路可上調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2、MMP9，進(jìn)而促進(jìn)AGS細(xì)胞的侵襲和遷移[13]，說明PI3K/AKT通路影響胃癌進(jìn)展。此外，研究報(bào)道m(xù)iR-34a-5p通過下調(diào)CDK6并使PI3K/AKT通路失活[14]。喬松素通過抑制PI3K/AKT/mTOR途徑激活自噬可減輕糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡[15]，說明miR-34a-5p和喬松素可調(diào)控PI3K/AKT通路。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，喬松素可降低p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)水平；而抑制miR-34a-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了喬松素對(duì)p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)的影響。

綜上所述，喬松素可能抑制胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，這種抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)miR-34a-5p或PI3K/AKT通路實(shí)現(xiàn)的。