皂白散對(duì)家兔創(chuàng)面愈合模型創(chuàng)面愈合效果和皮膚微生態(tài)的影響

閆小寧 ，馮澤海 ，拓興偉 ，李文彬 ，閆雋 ，郭蛟 ，楊志波

（1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)天寧制藥有限責(zé)任公司，陜西 榆林 718000；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

創(chuàng)面是正常皮膚由于外力、化學(xué)物質(zhì)及局部血液供應(yīng)障礙等因素導(dǎo)致的損傷，伴有皮膚的功能及完整性受損。由于感染、殘留壞死組織及異物等原因，創(chuàng)面超過2個(gè)月仍然無法愈合，稱為難愈性創(chuàng)面。難愈性創(chuàng)面發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療周期長、治療費(fèi)用高，對(duì)患者及社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。因此，臨床上亟需尋找促進(jìn)創(chuàng)面愈合的有效方法。

皂白散根據(jù)祖國醫(yī)學(xué)理論自主研發(fā)的產(chǎn)品，課題組前期針對(duì)清熱燥濕、殺蟲止癢這一治療理念，將皂白散用于治療手足癬中，可有助于改善皮膚損傷的面積及臨床癥狀[2-3]，進(jìn)而推測，皂白散可能在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面存在重要作用。人體皮膚作為一個(gè)獨(dú)特多變的生態(tài)系統(tǒng)，一旦這一平衡生態(tài)系統(tǒng)被打破，可能會(huì)引起皮膚創(chuàng)面愈合困難的情況出現(xiàn)。因此，本研究擬應(yīng)用家兔創(chuàng)面愈合模型，觀察皂白散對(duì)其愈合效果和皮膚微生態(tài)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 大耳白家兔，10只，雄性，體質(zhì)量2～2.5 kg。遵循國家動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則飼養(yǎng)10 d。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物 皂白散（30 g/袋，陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)天寧制藥有限責(zé)任公司）。

皂白散溶液配制：稱取30 g皂白散粉末放入煮沸的300 mL去離子水中，攪拌溶解充分，冷卻分裝；皂白散溶液濃度按照人體用量5倍計(jì)算。

1.1.3 試劑 HE染色試劑盒、多聚甲醛購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒、顯色試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司；基因組提取試劑盒、定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）產(chǎn)物純化試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于德國QIAGEN公司；放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解液、Bradford蛋白檢測試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建動(dòng)物模型 本項(xiàng)目參考此前陜西省中醫(yī)醫(yī)院發(fā)表的《皂白散治療足癬效果以及安全性的基礎(chǔ)研究》[3]中應(yīng)用的家兔創(chuàng)面愈合模型。分別剪去家兔雙耳直徑約1 cm皮膚，造成皮膚表面糜爛。

1.2.2 藥物干預(yù)方法 將家兔左右耳分為模型組和實(shí)驗(yàn)組。模型組（右耳）造模后不做任何處理。實(shí)驗(yàn)組（左耳）造模后涂抹60%皂白散浸液，0.1 mL/次，1 次/d，共干預(yù) 14 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 家兔創(chuàng)面愈合情況 肉眼觀察創(chuàng)面的愈合情況：滲出物、創(chuàng)緣皮膚收縮程度、結(jié)痂情況及皮膚顏色的變化。用HVviewin98.0圖像分析軟件測定創(chuàng)面面積，計(jì)算第4、7、14天創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（初始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）／初始創(chuàng)面面積×100%。

1.3.2 HE染色 造模14 d后，處死實(shí)驗(yàn)家兔。取家兔雙耳背部創(chuàng)面組織，置于4%甲醛中固定24 h，使用生理鹽水沖洗后在磷酸鹽緩沖液（PBS）中浸泡12 h。梯度乙醇常規(guī)脫水、包埋制成石蠟切片，將切片烤干，使用二甲苯透明后脫蠟。使用蘇木精染液染色5 min，鹽酸酒精分化后水沖洗30 min。伊紅染色3 min后，再次進(jìn)行脫蠟、透明，之后封片，鏡下觀察創(chuàng)面組織病理學(xué)變化。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色 取家兔雙耳背部創(chuàng)傷組織制作切片，脫蠟水化，進(jìn)行熱修復(fù)抗原。滴入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液封閉。滴加1∶200的增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）單克隆抗體（或CD34單克隆抗體），4℃條件下孵育過夜，PBS洗滌。滴加二抗，37℃條件下孵育30 min，PBS洗滌。使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒進(jìn)行切片顯色。蘇木精復(fù)染2 min脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4 qPCR檢測 通過Trizol試劑提取兔耳組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度及純度，使用OD260/OD280在1.7～2.0之間的樣本。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后，將產(chǎn)物進(jìn)行電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），以 2-ΔΔCT法計(jì)算腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、IL-8、IL-10mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物信息表見表1。

表1 qPCR引物信息

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblotting，WB）檢測 使用RIPA裂解液從樣本中提取總蛋白，使用BCA試劑盒定量，在100℃沸水中孵育10 min進(jìn)行變性處理，SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜成功后，使用脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗孵育過夜。取出充分洗膜后，轉(zhuǎn)移至稀釋過的二抗室溫孵育2 h。ECL電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，GAPDH作為內(nèi)參蛋白對(duì)照。Image J軟件分析條帶的灰度值。

1.3.6 宏基因組測序 隨機(jī)收集4只家兔左右耳皮膚樣本，委托上海偉寰公司進(jìn)行宏基因組測序，檢測合格的DNA樣品，進(jìn)行文庫構(gòu)建及檢測，檢測合格的文庫將采用Illumina PE150進(jìn)行測序，測序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)（Raw Data）將用于后期信息分析。

1.3.7 生物信息學(xué)分析 采用fastP（v0.20.1）軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，對(duì)低質(zhì)量堿基，接頭序列進(jìn)行剪切。采用KneadData（v0.7.4）軟件對(duì)質(zhì)控后數(shù)據(jù)去宿主（基于Bowtie2）。使用MetaPhlAn3對(duì)所有樣品的全部有效序列進(jìn)行注釋分類，HUMAnN3（v0.11.2）軟件將各個(gè)樣本的讀數(shù)比對(duì)到數(shù)據(jù)庫UniRef90，根據(jù)UniRef90身份標(biāo)識(shí)號(hào)（ID）和各個(gè)數(shù)據(jù)庫的對(duì)應(yīng)關(guān)系，獲得各個(gè)功能數(shù)據(jù)庫的注釋信息和相對(duì)豐度表并進(jìn)行豐度聚類分析、主成分分析PCoA和非度量多維尺度分析（NMDS）降維分析。尋找樣本或分組之間的特有和共有物種（種水平），對(duì)分組較少（2～4個(gè)）的方案采用韋恩圖分析。韋恩圖直觀展示樣本分組間物種組成相似性及重疊情況。根據(jù)各樣本在不同水平下（門、綱、目、科、屬、種）Top20的物種分布繪制柱狀堆積圖及聚類熱圖，直觀顯示優(yōu)勢類群在樣本中的分布情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最終數(shù)據(jù)由3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。統(tǒng)計(jì)顯著性采用 LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皂白散對(duì)家兔創(chuàng)面愈合率影響 構(gòu)建家兔創(chuàng)面愈合模型，在干預(yù)第4、7、14天觀察創(chuàng)面愈合情況，并比較創(chuàng)面愈合率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組第4、7、14天創(chuàng)面愈合率均顯著升高，見圖1。

2.2 HE染色法檢測創(chuàng)面新生肉芽組織 涂藥后14 d，通過HE染色檢測皂白散對(duì)家兔創(chuàng)面愈合的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組家兔肉芽組織增加不明顯。實(shí)驗(yàn)組家兔肉芽組織生長良好，毛細(xì)血管數(shù)量增多，創(chuàng)面明顯收縮，見圖2。

圖2 2組創(chuàng)面新生肉芽組織（HE染色×40）

2.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測創(chuàng)面新生肉芽組織成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞顯著多于模型組（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量多于模型組（P＜0.05），見圖3。

圖3 2組創(chuàng)面新生肉芽組織成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管數(shù)量

2.4 皂白散對(duì)家兔干預(yù)后 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10的水平變化 qPCR和WB檢測TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 mRNA及蛋白水平的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組家兔 TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10 mRNA 及蛋白水平均下降（P＜0.05），見圖 4。

圖4 皂白散干預(yù)后家兔TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10的水平變化

2.5 家兔雙耳皮膚樣本的分類操作單元（OTU）豐度及優(yōu)勢菌群 根據(jù)OTUs的物種注釋結(jié)果，見圖5A，檢測家兔雙耳皮膚樣本中的菌群組成。層次聚類熱圖中顯示前20種差異菌群，見圖5B，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組家兔皮膚大腸埃希菌、肺炎克雷柏菌豐度顯著減少，而K.rhaeticus豐度顯著升高。柱狀圖中進(jìn)一步驗(yàn)證了家兔雙耳皮膚樣本的相對(duì)豐度存在差異，見圖5C。

圖5 家兔雙耳皮膚樣本的OTU豐度及優(yōu)勢菌群

3 討論

皂白散中白礬、皂礬、皂角均有解毒殺蟲、燥濕止癢的功效[4-5]。地皮骨有涼血解熱、抑菌抗炎之功效[6]。黃精可制約白礬、皂礬、皂角之燥性，也有抗炎和抗感染的作用[7]，該方劑在修復(fù)手足癬創(chuàng)面中的應(yīng)用價(jià)值已被證實(shí)。在創(chuàng)面修復(fù)過程中，肉芽組織形成通過保護(hù)創(chuàng)面、填補(bǔ)創(chuàng)口及機(jī)化、包裹創(chuàng)口異物促進(jìn)愈合，而存在于皮膚損傷中的炎性反應(yīng)，則延遲創(chuàng)面愈合。因此，本研究通過構(gòu)建家兔創(chuàng)面愈合模型，使用不同干預(yù)方法，觀察創(chuàng)面愈合情況、病理情況、肉芽組織生長情況及炎性因子水平，發(fā)現(xiàn)皂白散可減輕病理損傷及炎性反應(yīng)，并促進(jìn)肉芽組織生長及創(chuàng)面愈合。即皂白散可通過促進(jìn)肉芽組織生長，緩解皮損部位炎性反應(yīng)以有效治愈家兔皮膚損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，定植在皮膚表面的微生物在環(huán)境的影響下產(chǎn)生各類分泌物，可形成穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境，防治有害物質(zhì)入侵并抑制炎性反應(yīng)，以保護(hù)皮膚的健康[8]。皮膚微生態(tài)與皮膚健康和疾病之間密切相關(guān)，共生微生物群可通過參與皮膚傷口愈合的多種細(xì)胞類型之間的相互作用，以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并促進(jìn)屏障恢復(fù)[9]。在一項(xiàng)糖尿病足潰瘍的研究中觀察到葡萄球菌、鏈球菌、棒狀桿菌、假單胞菌等菌群豐度發(fā)生變化，且皮膚共生微生物表皮葡萄球菌，可以調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞并誘導(dǎo)穿孔素-2（Perforin-2）表達(dá)，進(jìn)而破壞皮膚中的金黃色葡萄球菌，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[10]。Wu等[11]通過16S rRNA測序分析35例創(chuàng)面樣本中藥治療前后的菌群差異，發(fā)現(xiàn)中藥治療通過調(diào)節(jié)創(chuàng)面微生物群可促進(jìn)傷口愈合。在受損的皮膚中，角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生腎上腺素，通過激活β2-腎上腺素能受體抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，從而延緩傷口愈合，而皮膚菌群產(chǎn)生的微量胺可消除腎上腺素的作用，加速創(chuàng)面愈合[12]。上述研究均表明，皮膚菌群在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮巨大作用。

因此，本研究進(jìn)一步通過隨機(jī)收集4只家兔雙耳皮膚樣本進(jìn)行宏基因組學(xué)測序，以驗(yàn)證皮膚菌群在創(chuàng)傷修復(fù)中的功能作用及皂白散通過調(diào)節(jié)失衡的皮膚微生態(tài)以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。測序結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組家兔皮膚大腸埃希菌、肺炎克雷柏菌豐度顯著減少，而K.rhaeticus豐度顯著升高。大腸埃希菌是一種腸道革蘭陰性細(xì)菌，屬于γ-變形菌綱，已被證明與腸道感染以外的多種疾病有關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌可能通過影響創(chuàng)面肉芽組織中的蛋白含量及膠原合成，從而導(dǎo)致感染性創(chuàng)面愈合延緩[14]。而抑制大腸埃希菌的生長和繁殖可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增加，加速肉芽組織的形成，促進(jìn)傷口的愈合[15]。肺炎克雷伯菌是革蘭陰性桿菌，同屬于γ-變形菌綱，常會(huì)引起壞死性肺炎、肝膿腫等嚴(yán)重的感染[16]，當(dāng)皮膚受損時(shí)，肺炎克雷伯菌侵入會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的傷口感染，不利于皮膚損傷的愈合[17]。K.rhaeticus是可產(chǎn)生細(xì)菌纖維素的菌群[18-20]，而細(xì)菌纖維素可進(jìn)一步促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與毛細(xì)血管的生長及創(chuàng)面的愈合。盛高銘等[21]建立兔耳皮膚創(chuàng)面愈合模型，使用不同方法干預(yù)后對(duì)比創(chuàng)面愈合的形態(tài)學(xué)及組織學(xué)變化，細(xì)菌纖維素有助于肉芽組織的生成，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。上述研究提示，皮膚創(chuàng)面損傷可導(dǎo)致皮膚菌群的失衡，皂白散可通過改善皮膚菌群失衡狀態(tài)促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

綜上所述，皂白散通過調(diào)節(jié)皮膚微生態(tài)平衡以發(fā)揮藥理作用，能夠有效促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合。