白藜蘆醇-表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯脂質(zhì)體的制備及體外透皮性質(zhì)研究

宋娟，于緒東，王棟

（大連市皮膚病醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

白藜蘆醇是一種天然非黃酮類的多酚化合物，有抗腫瘤、抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、抗病毒、保護(hù)心血管系統(tǒng)及免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用[1-4]。近年來(lái)，有研究報(bào)道白藜蘆醇能夠通過(guò)抑制多種炎性因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、IL-6 及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的表達(dá)，下調(diào)核因子-κB（NF-κB），而產(chǎn)生一定的銀屑病治療作用[5]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）是綠茶提取物茶多酚的主要活性成分，EGCG則能夠通過(guò)下調(diào)輔助性T細(xì)胞1（Th1）及Th17的特異性轉(zhuǎn)錄因子STAT1、STAT3及RORct，抑制新生血管形成、上調(diào)Caspase-14的表達(dá)，誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分化等來(lái)有效地治療銀屑病[6-7]。因此，聯(lián)合應(yīng)用白藜蘆醇與EGCG對(duì)銀屑病進(jìn)行治療將有廣泛的應(yīng)用前景，然而，白藜蘆醇及EGCG均存在化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易被氧化分解，生物利用度低的缺陷，且白藜蘆醇難溶于水、EGCG皮膚滲透性差等問(wèn)題進(jìn)一步限制了二者的臨床應(yīng)用。

脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙分子層組成閉合囊泡，脂質(zhì)體作為經(jīng)皮給藥的載體，能夠同時(shí)包載水溶性和脂溶性的藥物，提高藥物的穩(wěn)定性，增加難溶性藥物的生物利用度，改善藥物的滲透性，并有緩控釋的作用[8-10]。本文采用逆向蒸發(fā)法將白藜蘆醇及EGCG共同包載于脂質(zhì)體中制成白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體，并對(duì)其制劑學(xué)性質(zhì)及體外透皮性能進(jìn)行研究，為白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 儀器 UltiMate3000高效液相色譜儀（Ulti－Mate3000泵、UltiMate3000 UV檢測(cè)器、Chromeleon Console色譜工作站，Thermo Fisher Scientific公司）；TK-12A型透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；LP 220S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BS110S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；JY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝科器研究所）；Senco R型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）。

1.1.2 試藥 EGCG（杭州禾田生物科技有限公司，純度為98%）；白藜蘆醇（大連市皮膚病醫(yī)院劉之力主任饋贈(zèng)）；大豆卵磷脂（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；甲基叔丁基醚（阿拉丁試劑網(wǎng)）；膽固醇（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的制備 采用逆向蒸發(fā)法制備白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體。稱取300 mg大豆卵磷脂、10 mg膽固醇及15 mg白藜蘆醇溶解于6mL甲基叔丁基醚中，得到有機(jī)相；EGCG的水溶液即為水相；然后將水相與有機(jī)相混合（1∶3，V/V），采用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲分散（600W×20min），室溫減壓旋蒸，除去有機(jī)溶劑后，加入4 mL純化水作為水化介質(zhì)，在40℃水浴中充分水化，待除去殘存的甲基叔丁基醚后，將得到的水性混懸液超聲（200 W×1 min），過(guò)0.22 μm濾膜，即得白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體。

1.2.2 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體制劑學(xué)性質(zhì)表征

1.2.2.1 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的外觀 采用目測(cè)法，觀察白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的外觀。

1.2.2.2 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的粒徑 取白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體適量，以純化水作為稀釋介質(zhì)，稀釋10倍后采用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的粒度及其分布。

1.2.2.3 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的包封率 采用超濾-離心法測(cè)定白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中白藜蘆醇及EGCG的包封率。

游離藥物的測(cè)定：精密量取白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體加純化水對(duì)倍稀釋后，置濾膜截留分子質(zhì)量為50 000的超濾離心管中，13 000 r/min離心15 min，離心半徑為8.6 cm，精密量取超濾液0.2 mL 2份分別置10 mL量瓶中，一份加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，按照“1.2.2.4.2白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中白藜蘆醇含量測(cè)定”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定白藜蘆醇的濃度，即為游離藥物濃度（C游離），另一份加甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2稀釋至刻度，搖勻，參照前期報(bào)道的色譜條件[11]測(cè)定EGCG的濃度，即為游離EGCG濃度（C游離）。

總藥量的測(cè)定：精密量取白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體0.1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇5 mL超聲后，分別加甲醇和甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2 稀釋至刻度，搖勻，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜。按照“1.2.2.4.2白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中白藜蘆醇含量測(cè)定”項(xiàng)下色譜條件和文獻(xiàn)報(bào)道的色譜條件[11]測(cè)定白藜蘆醇和EGCG的濃度，即為總的藥物濃度（C），按如下公式計(jì)算白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中白藜蘆醇和EGCG的包封率。

1.2.2.4 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中藥物含量測(cè)定

1.2.2.4.1 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中EGCG含量測(cè)定 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中EGCG的含量參照文獻(xiàn)報(bào)道的色譜條件[11]進(jìn)行測(cè)定，精密量取0.1 mL白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體置10 mL量瓶中，加入甲醇5 mL超聲后，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜。精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另取EGCG對(duì)照品，精密稱定，采用流動(dòng)相定量稀釋成每1 mL約含20.0 μg EGCG的溶液，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

1.2.2.4.2 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中白藜蘆醇含量測(cè)定

①高效液相色譜（HPLC）條件 色譜柱為Elite-ODS 柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水=48∶52；柱溫為 30 ℃；流速為 1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為303 nm。

測(cè)定方法：精密量取0.1 mL白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體置10 mL量瓶中，加入甲醇5 mL超聲后，繼續(xù)加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜。精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另取白藜蘆醇對(duì)照品，精密稱定，采用甲醇定量稀釋成每1 mL約含20.0 μg白藜蘆醇的溶液，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

②專屬性考察 分別取對(duì)照溶液（“線性范圍”項(xiàng)下20.0 μg/mL溶液），空白脂質(zhì)體溶液及供試品溶液按“1.2.2.4.2白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中白藜蘆醇含量測(cè)定”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理后，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

③線性范圍 精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品10.0mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密移取 0.5、1.0、2.0、4.0及 8.0 mL 置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為5.0、10.0、20.0、40.0 及 80.0 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸。得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

④回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取0.1 mL不含白藜蘆醇的空白脂質(zhì)體溶液置10 mL量瓶中，分別加入1.0 mg/mL 的對(duì)照溶液 0.16 mL，0.2 mL，0.24 mL 配制成低、中、高3個(gè)濃度的供試品，每個(gè)濃度各3份，加甲醇5 mL超聲后，繼續(xù)加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜。精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算低、中、高3個(gè)濃度平均回收率。

⑤重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“1.2.2.4.2白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中白藜蘆醇含量測(cè)定”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液6份及對(duì)照品溶液，計(jì)算6份樣品含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)驗(yàn)證重復(fù)性。

⑥精密度實(shí)驗(yàn) 取“線性范圍”項(xiàng)下20.0 μg/mL溶液，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算白藜蘆醇峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。

1.2.3 大鼠體外經(jīng)皮滲透性及皮膚滯留量考察

1.2.3.1 體外經(jīng)皮滲透性實(shí)驗(yàn) 采用Franz擴(kuò)散法研究白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體及白藜蘆醇-EGCG乙醇溶液的體外透皮性質(zhì)。處理好的SD大鼠皮膚置于供給池與接受池之間，通過(guò)取樣管向接受池中注滿20%的乙醇溶液，接受池體積為7 mL，排凈皮膚真皮層與接受液之間的氣泡，然后將樣品緩緩加入供給池，擴(kuò)散裝置的溫度維持在（32.0±0.5）℃，磁力攪拌速度為 400 r/min。分別于 0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、12.0、24.0 h取出5 mL接受液，過(guò)濾，每次取樣后立即補(bǔ)加同溫同體積的新鮮接受液，采用HPLC法測(cè)定不同時(shí)間接受液中EGCG及白藜蘆醇的濃度，按如下公式計(jì)算單位面積累積透過(guò)量（Q）。以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，Q為縱坐標(biāo)作圖，分別得到EGCG及白藜蘆醇體外經(jīng)皮滲透曲線，對(duì)曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，所得直線的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率（Js，μg/cm2·h）

式中Q為t時(shí)間單位面積累積透過(guò)量（μg/cm2），Cn校為校正后接受液中藥物的濃度；Cn測(cè)為第n次取樣測(cè)得接受液中藥物的濃度；V和Vi分別為接受池中接受液的總體積和每次取樣體積；∑Cp為該取樣點(diǎn)前各點(diǎn)的測(cè)定濃度之和；A為有效透皮擴(kuò)散面積。

1.2.3.2 大鼠皮膚內(nèi)藥物滯留量實(shí)驗(yàn) 體外經(jīng)皮滲透性實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下鼠皮，用20%乙醇及蒸餾水反復(fù)清洗皮膚表面殘存的藥物，濾紙吸干皮膚表面的溶劑，并將多余的皮膚剪掉后稱重，用剪刀將皮膚剪碎，置于超聲管中，精密加入5 mL甲醇，用超聲波細(xì)胞破碎儀超聲5 min，取上清液移入至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，過(guò)0.22 μm濾膜，精密量取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定皮膚中白藜蘆醇的滯留量，另取續(xù)濾液加甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2 對(duì)倍稀釋，精密量取20 μL進(jìn)樣，測(cè)定皮膚中EGCG的滯留量。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體制劑學(xué)性質(zhì)表征

2.1.1 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的外觀 脂質(zhì)體外觀是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的一個(gè)直觀指標(biāo)，白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的外觀，肉眼觀察白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體為淡黃色的半透明乳狀液，見(jiàn)圖1。

圖1 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的外觀

2.1.2 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的粒徑 激光粒度測(cè)定儀測(cè)定白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的粒度及其分布，白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的粒徑為128.1 nm，其多分散指數(shù)（PDI）值為 0.115，見(jiàn)圖 2。

圖2 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的粒徑及分布

2.1.3 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體的包封率 采用逆向蒸發(fā)法制備的白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體，對(duì)脂質(zhì)體中的白藜蘆醇及EGCG的包封率進(jìn)行測(cè)定，白藜蘆醇的包封率高達(dá)（91.70±0.42）%，EGCG的包封率為（91.10±2.84）%，見(jiàn)表 1。

表1 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中藥物的包封率

2.1.4 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中藥物含量測(cè)定

2.1.4.1 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中EGCG含量測(cè)定 采用HPLC法對(duì)所制備的白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中EGCG含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中EGCG含量為（1.54±0.39）g/L。

2.1.4.2 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中白藜蘆醇含量測(cè)定

①專屬性考察 專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，白藜蘆醇的保留時(shí)間為5.993 min，空白脂質(zhì)體中的輔料對(duì)白藜蘆醇的測(cè)定無(wú)干擾，所有峰均能達(dá)到分離，見(jiàn)圖3。

圖3 A空白脂質(zhì)體的液相色譜圖；B標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖；C EGCG-PL的液相色譜圖

②線性范圍 以峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸，得到白藜蘆醇的回歸方程為A=1.333 6C+0.403 9，白藜蘆醇在濃度為 5.0～80.0 μg/mL范圍內(nèi)，色譜峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

③回收率實(shí)驗(yàn) 通過(guò)計(jì)算得到白藜蘆醇低、中、高3個(gè)濃度平均回收率分別為（100.85±0.59）%、（101.31±0.39）%、（100.77±0.02）%（n＝3），RSD 分別為0.59%、0.39%、0.02%，回收率均符合要求。

④重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照檢驗(yàn)方法所述，制備供試品溶液6份及對(duì)照品溶液，計(jì)算6份樣品含量的RSD來(lái)驗(yàn)證重復(fù)性，得到6份供試品的RSD為1.33%，證實(shí)該方法重復(fù)性符合要求。

⑤精密度實(shí)驗(yàn) 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇峰面積的RSD為0.13%，表明該方法精密度良好。

⑥白藜蘆醇含量測(cè)定 采用上述驗(yàn)證的HPLC法對(duì)所制備的白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中的白藜蘆醇的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明樣品中白藜蘆醇的含量為（2.53±0.11）g/L。

2.2 大鼠體外經(jīng)皮滲透性及皮膚滯留量考察

2.2.1 體外經(jīng)皮滲透性實(shí)驗(yàn) 體外經(jīng)皮滲透曲線與白藜蘆醇-EGCG乙醇溶液組相比，白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中的白藜蘆醇和EGCG更容易透過(guò)大鼠皮膚滲透至接受液中，見(jiàn)圖4。白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體組中白藜蘆醇24 h累積透過(guò)量（22.85±0.88）μg/cm2，EGCG 24 h 累積透過(guò)量（51.91±20.56）μg/cm2分別是白藜蘆醇-EGCG乙醇溶液組的5.40倍和3.85倍。對(duì)曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，計(jì)算不同制劑中白藜蘆醇及EGCG的Js，白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體及白藜蘆醇-EGCG乙醇溶液中白藜蘆醇的Js分別為0.983 0 μg/（cm2·h）和0.203 7 μg/（cm2·h），2種制劑中EGCG的Js分別為2.207 3 μg/（cm2·h）和0.584 3 μg/（cm2·h），其滲透均符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，見(jiàn)表2。

圖4 A白藜蘆醇-EGCG 2種制劑中白藜蘆醇的大鼠經(jīng)皮滲透曲線；B白藜蘆醇-EGCG 2種制劑中EGCG的大鼠經(jīng)皮滲透曲線

表2 白藜蘆醇-EGCG 2種制劑中藥物的滲透方程及滲透參數(shù)

2.2.2 大鼠皮膚內(nèi)藥物滯留量實(shí)驗(yàn) 白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體組的大鼠皮膚內(nèi)白藜蘆醇及EGCG的滯留量分別為（695.07±130.29）μg/g及（473.14±93.02）μg/g要明顯的高于白藜蘆醇-EGCG乙醇溶液組（P＜0.01），見(jiàn)表 3。

表3 白藜蘆醇-EGCG 2種制劑中單位面積皮內(nèi)藥物滯留量 μg/g

3 討論

白藜蘆醇為難溶性藥物且對(duì)光熱均不穩(wěn)定，白藜蘆醇的水中溶解度僅為0.03 g/L，致使其很難在體內(nèi)發(fā)揮良好的生物學(xué)效應(yīng)。且有研究報(bào)道白藜蘆醇在光照條件下放置0.5 h吸收度下降52%，因此，白藜蘆醇需要進(jìn)行避光保存。本研究證實(shí)將白藜蘆醇包載于脂質(zhì)體中能夠有效地提高藥物的溶解度及穩(wěn)定性，白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中白藜蘆醇的含量為（2.53±0.11）g/L，同時(shí)在前期的研究中發(fā)現(xiàn)該制劑在沒(méi)有避光的條件下放置20 d，白藜蘆醇的含量無(wú)明顯變化，放置20 d后白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中白藜蘆醇的含量為（2.51±0.10）g/L。

白藜蘆醇的水溶性較差，為了增加白藜蘆醇在供給池與接受池中的濃度，保證漏槽條件，本研究采用了20%的乙醇溶液作為接受介質(zhì)，并以白藜蘆醇-EGCG乙醇溶液作為對(duì)照組進(jìn)行后續(xù)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇-EGCG脂質(zhì)體中EGCG的包封率為（91.10±2.84）%，而未加白藜蘆醇的普通EGCG脂質(zhì)體的包封率僅為（63.32±3.21）%。該結(jié)果證實(shí)白藜蘆醇能在一定程度上提高EGCG的包封率，分析其可能的原因?yàn)橐环矫姘邹继J醇能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)雙分子層的流動(dòng)性，降低磷脂雙分子層的滲透性，從而提高水溶性藥物EGCG的包封率，另一方面白藜蘆醇分子中的羥基可能與EGCG中的羥基形成分子間作用力從而提高EGCG的包封率。