桉樹枝癭姬小蜂與寄主及寄生蜂體內(nèi)細(xì)菌相似性研究

郭春暉，王蕊蕊，馬洪軒，彭 欣，王瀚棠，周 靜，丁芷柔，王 雪，楊振德

(1 廣西大學(xué) 林學(xué)院 廣西高校林業(yè)科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；2 廣西國有高峰林場，廣西 南寧 530000)

桉樹枝癭姬小蜂(LeptocybeinvasaFisher & LaSalle)屬膜翅目(Hymenoptera)小蜂總科(Chalcidoidea)姬小蜂科(Eulophidae)，是一種嚴(yán)重危害多種桉樹的入侵性致癭害蟲[1-3]。桉樹枝癭姬小蜂取食桉樹嫩葉汁液，并產(chǎn)卵在桉樹的嫩枝及葉柄處危害桉樹生長，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致桉樹死亡[1-3]。桉樹枝癭姬小蜂起源于澳大利亞，于2000年首次發(fā)現(xiàn)于中東和地中海地區(qū)，隨后在亞洲、歐洲、非洲、大洋洲和美洲等45個(gè)國家和地區(qū)相繼報(bào)道該害蟲[1-3]。隨著氣候的不斷變暖以及人類活動(dòng)的加劇，桉樹枝癭姬小蜂還有繼續(xù)擴(kuò)散的趨勢[1-6]。在中國，桉樹枝癭姬小蜂首次發(fā)現(xiàn)于中越交界處的廣西壯族自治區(qū)東興市，隨后該蟲迅速擴(kuò)散入侵到包括廣西，海南，臺灣，廣東，福建，江西，四川，云南和湖南等多個(gè)地區(qū)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5,7-13]。目前，關(guān)于桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)的微生物已經(jīng)有了一些研究，如Guo等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同性別桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同，立克次氏體(Rickettsia)為雌蟲的優(yōu)勢菌；Nugnes等[15]研究發(fā)現(xiàn)，桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)存在兩個(gè)不同種的立克次氏體，主要位于雌蟲卵巢處，并認(rèn)為與桉樹枝癭姬小蜂的繁殖有關(guān)；王蕊蕊等[12-13]利用傳統(tǒng)分離方法發(fā)現(xiàn)，桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)的細(xì)菌會受到季節(jié)的影響，夏季可以分離出更多的細(xì)菌。此外，桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)的細(xì)菌還能夠降解桉樹的次生代謝物質(zhì)，有助于其順利入侵定殖[16]。

昆蟲體內(nèi)包含大量的微生物，包括真菌、細(xì)菌和病毒等[17-19]。在長期協(xié)同進(jìn)化過程中，許多微生物與宿主昆蟲形成密切關(guān)系，并對宿主的繁殖、生存、群落相互作用、以及抵御捕食性和寄生性天敵的能力產(chǎn)生了巨大影響[20-23]。鑒于微生物的重要功能，昆蟲與其體內(nèi)微生物之間的關(guān)系成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)之一。外界環(huán)境中的微生物能夠隨著食物進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，比如中華按蚊(Anophelessinensis)體內(nèi)的細(xì)菌主要來源于生存的水體環(huán)境[24]；取食相同食物的舞毒蛾(Lymantriadispar)體內(nèi)細(xì)菌結(jié)構(gòu)具有高度的相似性，而取食不同食物時(shí)其體內(nèi)細(xì)菌群落組成就會明顯不同[25]。

為此，本研究利用高通量測序技術(shù)，對寄主桉樹、桉樹枝癭姬小蜂及其寄生蜂孟氏胯姬小蜂體內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)行研究，分析其內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和群落構(gòu)成，并比較三者體內(nèi)細(xì)菌組成的相似性，旨在為后續(xù)深入研究桉樹枝癭姬小蜂、寄主桉樹及其天敵孟氏胯姬小蜂三級營養(yǎng)關(guān)系，以及其體內(nèi)細(xì)菌的傳遞模式、協(xié)同進(jìn)化關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

桉樹葉柄和主脈、無羽化孔蟲癭組織、桉樹枝癭姬小蜂幼蟲和雌成蟲(南寧種群)，均采自廣西大學(xué)林學(xué)院校內(nèi)教學(xué)實(shí)踐基地(22°51′ N，108°17′ E)種植的巨園桉DH201-2(Eucalyptusgrandis×E.tereticornis)；桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲(四川種群)和天敵孟氏胯姬小蜂成蟲，采自攀枝花仁和鎮(zhèn)(26°49′ N，101°75′ E)巨園桉DH201-2。每個(gè)樣本的桉樹葉柄和主脈、無羽化孔蟲癭組織各0.6 g。桉樹枝癭姬小蜂幼蟲在無菌室中通過解剖無羽化孔的蟲癭組織獲得。桉樹枝癭姬小蜂幼蟲、剛羽化的雌成蟲(南寧種群和四川種群)和天敵孟氏胯姬小蜂成蟲進(jìn)行饑餓處理6 h后，各選取50頭大小一致、生長健康的個(gè)體作為一組樣本，先用無菌水沖洗掉蟲體表面雜質(zhì)，再用75%酒精消毒1 min，隨后用無菌水沖洗1 min，重復(fù)3次。

1.2 試劑與儀器

試劑：PowerSoil?DNA Isolation kit (MO BIO，12888-100)、Qubit?dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher，Q32854)、MinElute?PCR Purification Kit (Qiagen，28004)等，均購自南寧國拓生物科技有限公司。

儀器：電泳儀電源(DYY-4C)和水平電泳儀(DYCP-31CN)，北京六一生物科技有限公司；微量核酸蛋白測定儀(NanoDrop One)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；PCR儀(EASYCYCLER 96)，德國耶拿分析儀器股份公司；凝膠成像系統(tǒng)(CHEMIDOC XRS)，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3 細(xì)菌基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增

將1.1節(jié)準(zhǔn)備的各個(gè)樣本采用PowerSoil?DNA Isolation kit (MO BIO，12888-100)試劑盒進(jìn)行內(nèi)生菌基因組DNA提取，具體方法參考試劑盒說明書的步驟進(jìn)行。采用微量核酸蛋白測定儀測定總DNA的濃度和純度，檢測合格后的樣本保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

以提取的DNA為模板，采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3-V4區(qū)。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增體系：DNA模板2 μL，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.2 μL，正反向引物各1.5 μL，dNTP 1 μL，10×Buffer和High GC Enhancer各10 μL，用ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.4 細(xì)菌基因組DNA文庫的構(gòu)建和測序

利用Qubit?dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher，Q32854)對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，用1.8%瓊脂糖凝膠電泳切取目的片段，利用MinElute?PCR Purification Kit (Qiagen，28004)回收目的片段。使用Qubit 3.0熒光定量儀對按照建庫說明構(gòu)建好的小片段文庫進(jìn)行濃度檢測，采用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測其片段范圍，Illumina HiSeq 2500進(jìn)行雙末端測序(北京百邁克生物科技有限公司)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Overlap對測試得到的原始標(biāo)簽進(jìn)行過濾，拼接并去除嵌合體，得到高質(zhì)量的有效序列(effective Tags)。首先使用FLASH v1.2.11軟件對每個(gè)樣本的reads進(jìn)行PE reads拼接，得原始Tags序列；再使用Trimmomatic v0.33軟件進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的clean Tags序列；最后使用UCHIME v4.2軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到有效序列，并計(jì)算其堿基質(zhì)量值。堿基質(zhì)量值是衡量測序質(zhì)量的重要指標(biāo)，其計(jì)算公式為Q=-10lgP，其中Q為堿基質(zhì)量值，P為概率；堿基質(zhì)量值(Q)越高表明堿基被測錯(cuò)的概率(P)越小，Q20和Q30分別代表堿基識別正確率大于99%和99.9%，其值越大，說明測序結(jié)果越好。

使用QIIME v1.8.0軟件對這些序列進(jìn)行聚類，相似性大于97% 的序列歸為一個(gè)分類單元，即一個(gè)OTU(operational taxonomic unit)。使用Mothur v1.30(http://www.mothur.org/)軟件與SILVA數(shù)據(jù)庫(http://www. arb-silva.de/)PyNAST算法和RDP Classifier貝葉斯算法對OTU進(jìn)行分類學(xué)分析及Alpha 多樣性分析。利用QIIME軟件和R語言制作物種豐度表和群落結(jié)構(gòu)圖。采用主成分分析(principal component analysis，PCA)和非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)分析不同樣本中細(xì)菌群落的整體相似性和差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂體內(nèi)細(xì)菌高通量測序結(jié)果

經(jīng)過高通量測序，本研究共獲得864 135條有效序列，平均長度均大于400 bp，有效率均高于80%，Q20和Q30值均大于90%(表1)。以97 %相似水平對有效序列進(jìn)行聚類，共獲得1 102個(gè)OTU，其中南寧桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲(NLI)、四川桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲(SLI)、四川孟氏胯姬小蜂成蟲(SQM)、桉樹枝癭姬小蜂幼蟲(YC)、巨園桉DH201-2葉柄和主脈(ZW)及無羽化孔蟲癭內(nèi)部組織(ZZ)樣本分別有246，238，414，390，736，594個(gè)OTU；其中有96個(gè)OTU為ZW、ZZ、YC和NLI樣本所共有，說明桉樹枝癭姬小蜂幼蟲和成蟲體內(nèi)的細(xì)菌與所取食植物和蟲癭組織體內(nèi)的細(xì)菌具有一定程度的相似性，表明桉樹枝癭姬小蜂可能通過取食從寄主植物獲取一定的細(xì)菌；有133個(gè)OTU為YC(占34.10%)和NLI(占54.07%)樣本所共有，表明桉樹枝癭姬小蜂幼蟲和成蟲體內(nèi)的細(xì)菌具有一定的相似性；有168個(gè)OTU為NLI和SLI樣本所共有，說明桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)共有細(xì)菌很多；有211個(gè)OTU為SQM(占50.97%)和SLI(占88.66%)樣本所共有，表明桉樹枝癭姬小蜂與其天敵孟氏胯姬小蜂體內(nèi)細(xì)菌具有一定的相似性(圖1)。

表1 桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂6個(gè)樣本內(nèi)生細(xì)菌高通量測序結(jié)果Table 1 Sequencing statistics of 6 samples among eucalyptus,L.invasa and Q.mendeli

2.2 桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂體內(nèi)細(xì)菌群落組成分析

基于OTU的注釋結(jié)果可知，桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂體內(nèi)細(xì)菌多樣性差異明顯，6個(gè)樣本(NLI、SLI、SQM、YC、ZW和ZZ)共獲得24個(gè)門，55個(gè)綱，126個(gè)目，225個(gè)科，497個(gè)屬的細(xì)菌，其中ZW樣本體內(nèi)細(xì)菌在各分類水平上獲得的個(gè)數(shù)最多，而SLI樣本體內(nèi)細(xì)菌在各分類水平上獲得的個(gè)數(shù)最少(表2)。

表2 桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂6個(gè)樣本內(nèi)生細(xì)菌不同分類水平的數(shù)量Table 2 Number of species at each classification level of 6 samples among eucalyptus,L.invasa and Q.mendeli

由圖2-A可知，在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)在所有樣本中均存在，其中變形菌門(Proteobacteria)是所有樣本的優(yōu)勢菌門，在SLI、NLI、YC、SQM樣本中相對豐度分別達(dá)到了98.22%，95.43%，86.25%，67.77%。在ZW和ZZ樣本中，厚壁菌門為次優(yōu)勢菌門，其相對豐度分別達(dá)到31.39%和31.05%。在YC樣本中，厚壁菌門相對豐度為8.09%。在SQM樣本中，厚壁菌門相對豐度為9.29%，擬桿菌門相對豐度為11.10%，放線菌門相對豐度為6.27%。

由圖2-B可知，在屬水平上，ZW樣本體內(nèi)菌群中優(yōu)勢菌為甲基桿菌屬(Methylbacillus)，相對豐度為13.01%，次優(yōu)勢菌為埃希氏菌屬(Escherichia-Shigella)，相對豐度為8.31%；ZZ樣本體內(nèi)優(yōu)勢菌群為鏈球菌屬(Streptococcus)和擬桿菌屬(Bacteroides)，相對豐度分別為7.71%和6.55%。桉樹枝癭姬小蜂的幼蟲(YC)、成蟲(NLI和SLI)以及天敵孟氏胯姬小蜂(SQM)的優(yōu)勢菌均為立克次氏體屬(Rickettsia)，而立克次氏體屬在ZW和ZZ樣本中相對豐度很低，但在YC、NLI、SLI和SQM樣本中的相對豐度分別為81.49%，93.39%，91.92%和39.73%。此外，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)是SQM樣本中的次優(yōu)勢菌，相對豐度為20.37%。

2.3 桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂體內(nèi)細(xì)菌群落組成相似性分析

主成分分析結(jié)果表明，南寧地區(qū)桉樹枝癭姬小蜂幼蟲、南寧和四川地區(qū)桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)類似；巨園桉DH201-2葉脈和葉柄與無羽化孔蟲癭組織距離較近，說明彼此之間的細(xì)菌群落組成有一定的相似性(圖3)。

聚類分析結(jié)果表明，ZW和ZZ聚為一分支，而NLI、SLI、YC和SQM聚在另一分支上，說明桉樹枝癭姬小蜂幼蟲、成蟲與孟氏胯姬小蜂體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和豐度存在一定的相似性(圖4)。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂三者體內(nèi)細(xì)菌具有一定的相似性。昆蟲體內(nèi)的細(xì)菌可以從外界環(huán)境中獲取，比如翟小戰(zhàn)[24]研究發(fā)現(xiàn),中華按蚊(Anophelessinensis)體內(nèi)細(xì)菌主要來自于所生活的水體環(huán)境中。此外，通過取食昆蟲也可以獲得一些微生物，比如棉鈴蟲體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)菌與所取食葉片內(nèi)的細(xì)菌具有高度相似性[26-27]。煙粉虱可將體內(nèi)的沃爾巴克氏體傳遞給其寄生蜂，而寄生蜂從煙粉虱體內(nèi)獲得的沃爾巴克氏體也可以傳遞給煙粉虱[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，巨園桉DH201-2、無羽化孔蟲癭組織、桉樹枝癭姬小蜂幼蟲和成蟲體內(nèi)細(xì)菌共有96個(gè)相同的屬，同時(shí)巨園桉DH201-2和桉樹枝癭姬小蜂成蟲體內(nèi)細(xì)菌有133個(gè)相同的屬，彼此之間具有一定的相似性，推測桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細(xì)菌可能是通過取食巨園桉DH201-2獲得的，但還需進(jìn)一步試驗(yàn)證明。本研究結(jié)果顯示，四川和南寧地區(qū)的桉樹枝癭姬小蜂雌成蟲體內(nèi)細(xì)菌有168個(gè)相同的屬，四川桉樹枝癭姬小蜂和孟氏胯姬小蜂體內(nèi)細(xì)菌共同享有211個(gè)屬，且這3個(gè)樣本在UPGMA聚類圖上集聚在一個(gè)大分支上，由此可推測南寧地區(qū)的桉樹枝癭姬小蜂和孟氏胯姬小蜂體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)組成具有一定的相似性。昆蟲體內(nèi)的細(xì)菌還可能通過繁殖垂直傳遞給下一代。Knorr等[31]報(bào)道了紅粉甲蟲(Triboliumcastaneum)體內(nèi)的假單胞菌(Pseudomonas)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)等可通過母體垂直傳遞給子代。Koch等[32]在分析歐洲蜜蜂(Bombusterrestris)體內(nèi)細(xì)菌多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)菌來自母本體內(nèi)。Yukuhiro等[33]發(fā)現(xiàn)，褐粉虱(Nilaparvatalugens)體內(nèi)的共生菌與母本卵巢內(nèi)共生菌相似，說明昆蟲體內(nèi)的細(xì)菌還可通過卵巢進(jìn)行傳遞。本研究發(fā)現(xiàn)，桉樹枝癭姬小蜂幼蟲和成蟲體內(nèi)細(xì)菌有11個(gè)相同的門、96個(gè)相同的屬，主要菌群組成相對豐度較高并且極為相似，說明桉樹枝癭姬小蜂體內(nèi)細(xì)菌可能是通過母體進(jìn)行傳遞的，后續(xù)還需通過對其卵、卵巢及各發(fā)育階段進(jìn)行定量PCR、熒光原位雜交等試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

本研究還發(fā)現(xiàn)立克次氏體(Rickettsia)在南寧地區(qū)的桉樹枝癭姬小蜂幼蟲、成蟲和四川地區(qū)的桉樹枝癭姬小蜂成蟲、孟氏胯姬小蜂體內(nèi)細(xì)菌中相對豐度較高，說明立克次氏體能穩(wěn)定存在于昆蟲體內(nèi)，并可能是垂直傳遞的。而其在蟲癭組織體內(nèi)細(xì)菌中僅占3.48%。這可能是由于桉樹枝癭姬小蜂取食時(shí)將體內(nèi)的立克次氏體傳遞給植物，也可能是幼蟲在蟲癭內(nèi)生長過程中將體內(nèi)的立克次氏體傳遞給植物所造成的。不過目前還沒有證據(jù)表明桉樹枝癭姬小蜂和孟氏胯姬小蜂體內(nèi)立克次氏體能夠進(jìn)行水平傳遞，還需要進(jìn)一步研究[34]。已有研究表明，立克次氏體是一種廣泛分布于節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的母系遺傳共生細(xì)菌，能夠在親代和子代之間垂直傳遞，并調(diào)控諸多宿主昆蟲的生殖行為，誘導(dǎo)孤雌生殖[35-37]和殺雄等現(xiàn)象[38-39]。立克次氏體主要存在于桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲體內(nèi)，可能是造成桉樹枝癭姬小蜂孤雌生殖的原因[14-15]。通過飼喂抗生素來消除雌性體內(nèi)立克次氏體應(yīng)該可以增加雄性后代的比例，Giorgini等[35]研究發(fā)現(xiàn)含有立克次氏體的寄生蜂 (Pnigaliosoemius)僅產(chǎn)生雌蟲后代，用質(zhì)量濃度20 mg/mL的利福平處理24 h消除立克次氏體后，幾乎全部為雄性后代。Hagimori等[36]報(bào)道了立克次氏體與潛葉蠅類害蟲的優(yōu)勢寄生性天敵昆蟲芙新姬小蜂(Neochrysocharisformosa)的孤雌生殖有關(guān)，四環(huán)素處理后出現(xiàn)了大量雄性后代。因此，未來應(yīng)用抗生素處理去除其體內(nèi)的立克次氏體，進(jìn)一步明確立克次氏體是否參與操縱桉樹枝癭姬小蜂繁殖。除此之外，立克次氏體還可以影響宿主的適合度和抵御環(huán)境的能力[40-44]。比如對感染立克次氏體和未感染立克次氏體的兩個(gè)B型煙粉虱(BemisiatabaciB-biotype)種群的生物學(xué)特性研究后發(fā)現(xiàn)，感染立克次氏體的煙粉虱在卵至成蟲的階段發(fā)育速度更快[41]。Himler[42]研究發(fā)現(xiàn)，感染立克次氏體還可以提高宿主B 型煙粉虱的產(chǎn)卵量、存活率及后代雌蟲的比例，縮短發(fā)育歷期。

4 結(jié) 論

本研究首次詳細(xì)比較了桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-孟氏胯姬小蜂內(nèi)生細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)三者體內(nèi)細(xì)菌有密切聯(lián)系，且具有一定的相似性。該結(jié)果有助于了解桉樹-桉樹枝癭姬小蜂-天敵昆蟲之間的相互作用，進(jìn)而從共生菌新角度探討桉樹枝癭姬小蜂入侵與爆發(fā)機(jī)制，為桉樹枝癭姬小蜂的“共生入侵”假說提供佐證。