Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝及其UPLC-QTOF-MS成分分析*

趙麗沙 董 宇 沈蕓捷

1 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

2 浙江省中藥新藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 杭州 310007

3 浙江大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)研究中心 浙江 杭州 310058

桑黃又稱桑耳、桑臣和胡孫眼，是擔(dān)子菌門Basid‐iomycota，傘菌綱 Agaricomycetes，銹革孔菌目 Hy‐menochaetales，銹革孔菌科Hymenochaetaceae，桑黃孔菌屬Sanghuangporus Sheng H.Wu,L.W.Zhou&Y.C.Dai的一類大型藥用真菌[1]。在《藥性論》《本草綱目》和《神農(nóng)本草經(jīng)》等歷代本草著作中均有桑黃及其藥效的明確記載，傳統(tǒng)多用于治療痢疾、盜汗、血崩、血淋、臍腹?jié)?、脫肛瀉血、帶下、閉經(jīng)等癥[2-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明桑黃具有抗腫瘤、保肝、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、防衰老和降糖降脂等20多種藥理活性[5-7]。由于其多樣的藥理活性及顯著的抗腫瘤作用，桑黃在中國(guó)、韓國(guó)和日本等東南亞國(guó)家具有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。目前，我國(guó)桑黃銷售主要分為兩類，一類是桑黃子實(shí)體，售價(jià)極高，另一類是桑黃粗加工產(chǎn)品，包括桑黃活性多糖膠囊、桑黃扶正膠囊、桑黃精、桑黃口服液和桑黃抗癌湯劑等。這些桑黃制劑多采用水煎煮，濃縮加工而成，但由于制備工藝不一、桑黃物種不清以及質(zhì)量控制缺失等原因，導(dǎo)致桑黃產(chǎn)品市場(chǎng)混亂，嚴(yán)重制約了桑黃的現(xiàn)代化開發(fā)和利用。因此，有必要建立桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝，并明確桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的主要化學(xué)成分，以期為桑黃的深度開發(fā)提供技術(shù)支持。

本研究以楊樹桑黃（Sanghuangporus vaninii(Ljub.)L.W.Zhou&Y.C.Dai）為研究對(duì)象，以臨床湯劑制法為標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝參數(shù)依據(jù)，采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法對(duì)桑黃湯劑煎煮工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，采用Design-Expert 10軟件對(duì)桑黃湯劑中紫琪酮提取率進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得出關(guān)鍵參數(shù)料液比、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)的量化值；采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS）技術(shù)，對(duì)桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行化學(xué)成分研究，構(gòu)建較為全面的化學(xué)成分譜，為桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑有效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器：ExionLC AD高效液相色譜儀和SCIEX X-500R四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；Sorvall ST 40R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)賽默飛公司）；IKA微型渦旋混合儀（德國(guó)艾卡公司）；AMW220D電子天平（日本島津公司）。

1.2 藥材及試劑：楊樹桑黃子實(shí)體切片由浙江康脈有限公司提供并鑒定。甲醇、乙腈（色譜純），甲酸（質(zhì)譜純）；實(shí)驗(yàn)用水（屈臣氏蒸餾水）；紫萁酮對(duì)照品（批號(hào)111888-201001，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所）。

2 方法

2.1 桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中紫萁酮含量的測(cè)定：分述如下。

2.1.1 色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18(150×2.1mm,1.7μm)色譜柱；流動(dòng)相組成為A相：乙腈-0.1%甲酸，B相：0.1%甲酸水；洗脫梯度：0～4min，99%～85%B；4～14min，85%～70%B；14～17min，70%～50%B；17～22min，50%～10%B；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，進(jìn)樣體積3μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備：精密量取紫萁酮適量，加甲醇配制成1mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備：取0.2g/mL桑黃湯劑0.5mL，按照1∶1比例加甲醇稀釋，渦旋60s，14000r/min離心20min，取上清液，UPLC檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

2.1.4 線性關(guān)系考察：取標(biāo)準(zhǔn)品母液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋。紫萁酮標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=10234x-390。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：為分析各因素對(duì)桑黃湯劑質(zhì)量的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比（A）、煎煮時(shí)間（B）、煎煮次數(shù)（C）三個(gè)因素為自變量，以紫萁酮提取量（Y）為響應(yīng)值，每個(gè)自變量以低、中、高三種實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行-1、0、1的編號(hào)。對(duì)桑黃湯劑的制備方法進(jìn)行三因素三水平研究，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 因素水平

2.3 桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC-QTOF-MS分析：色譜條件同“2.1.1項(xiàng)”，進(jìn)樣體積2μL。質(zhì)譜條件：飛行時(shí)間質(zhì)譜采用TurboIonSpray離子源，ESI正負(fù)離子掃描模式。具體條件為：Ion Source Gas1和Gas2均為55psi，Curtain gas：35psi，source temperature：600℃ ，IonSapary Voltage Floating（ISVF）：5500V/-4500V（正/負(fù)）；TOF MS scan accumulation time 0.15s/spectra，prod‐uct ion scan accumulation time 0.05s/spectra；二級(jí)質(zhì)譜采用information dependent acquisition（IDA）獲得，Declustering potential（DP）：±60V，Col‐lision Energy：35±15eV。

3 結(jié)果

3.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件：對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合分析，得到各因素變量和紫萁酮含量（Y）之間的回歸方程：Y=11.64+0.16A+3.12B+8.76C+0.27AB-0.31AC+2.64BC+0.35A2+1.86B2+2.63C2。方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果顯示（見表3），該回歸模型顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明該回歸模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度良好。各因素對(duì)紫萁酮影響率大小分別為：提取次數(shù)（C）＞提取時(shí)間（B）＞料液（A）。

表2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 響應(yīng)曲面方差分析及顯著性檢驗(yàn)

響應(yīng)曲面圖是根據(jù)響應(yīng)值對(duì)各實(shí)驗(yàn)因子所得到的三維圖表，在本次實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)，各個(gè)因素對(duì)于紫萁酮提取率的影響力是料液比（A）＜煎煮時(shí)間（B）＜煎煮次數(shù)（C）。由軟件分析得桑黃湯劑的煎煮條件為料液比1∶20、煎煮時(shí)間45min、煎煮次數(shù)3次，在此條件下紫萁酮提取率可達(dá)到31.11μg/mL。根據(jù)擬合的數(shù)值制備5組最優(yōu)條件下的湯劑，平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得紫萁酮含量為21.61、20.00、20.80、20.33、19.38、19.97，平均提取率為20.35，RSD值為3.80%，和理論值相差較大。結(jié)果表明軟件擬合得到的結(jié)果過于理想化，實(shí)際操作中存在的誤差會(huì)造成一定的損失。結(jié)果如圖1所示。

圖1 響應(yīng)面法優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)湯劑結(jié)果圖

3.2 桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分歸屬及其質(zhì)譜裂解分析：采用UPLC-QTOF-MS法檢測(cè)桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣本，總離子流圖見圖2?；瘜W(xué)成分歸屬的方法包括以下3種：①TCM MS/MS Library：本實(shí)驗(yàn)根據(jù)化合物的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布比和MS/MS搜索SCIEX OS配置的中藥二級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)TCM MS/MS Library，共鑒定化合物20個(gè)。正離子模式下鑒定出的化合物的名稱、分子式、保留時(shí)間、分子量實(shí)測(cè)值、Library Score分別為精氨酸L(+)-(C6H14N4O2,1.19,175.1192,97.1)，左 旋 肉 堿(C7H15NO3,1.28,162.1126,79.5)，脯氨酸(C5H9NO2,1.36,116.0708,98.5)，水 蘇 堿 (C7H13NO2,1.37,144.102,98)，六氫吡啶羧酸(C6H11NO2,1.42,130.0866,86.5)，煙 酸 (C6H5NO2,1.88,124.0392,97.3)，煙酰胺(C6H6N2O,1.96,123.0553,98.8)，次黃嘌呤(C5H4N4O,2.06,137.0459,97.2)，腺嘌呤(C5H5N5,2.57,136.0617,85.9)，蟲 草 素 (C10H13N5O3,2.64,252.1091,99)，苯丙氨酸(C9H11NO2,3.5,166.0864,97)；負(fù)離子模式下鑒定化合物分別為谷氨酸(C5H9NO4,1.23,146.0459,92.7)，山梨糖醇(C6H14O6,1.24,181.0722,94.8)，木 糖醇(C5H12O5,1.25,151.0614,86.3)，腺苷(C10H13N5O4,2.58,266.09,97.7)，香草酸(C8H8O4,4.25,167.0351,85.8)，芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(C21H18O11,12.04,445.0778,88.4)，異甘草素(C15H12O4,12.59,255.0661,88.8)，異補(bǔ)骨脂二氫黃酮(C20H20O4,18.46,323.1286,91.4)，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(C21H22O4,21.74,337.1448,86.2)。②標(biāo)準(zhǔn)品鑒定：通過標(biāo)準(zhǔn)品鑒定的負(fù)離子模式下化合物名稱、分子式、保留時(shí)間、分子量實(shí)測(cè)值分別為原兒茶酸(C7H6O4,4.08,153.0195)，原兒茶醛(C7H6O3,5.08,137.0246)，咖啡酸(C9H8O4,5.75,179.0352)，紫萁酮(C10H10O3,7.78,177.0558)，hispidin(C13H10O5,8.72,245.0454)。③化合物推測(cè)鑒定：通過查閱文獻(xiàn)，建立桑黃化學(xué)成分庫(kù)，SCIEX OS軟件獲得化合物的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)、質(zhì)量偏差（PPM）、MS/MS碎片信息，通過MS/MS質(zhì)譜裂解分析去進(jìn)行歸屬，共鑒定化合物24個(gè)。in‐terfungin B和inoscavin A推測(cè)方法見圖3，自建庫(kù)鑒定結(jié)果見表4。

表4 桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中自建庫(kù)鑒定結(jié)果

圖2 桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑總離子流圖（TIC圖）

圖3 負(fù)離子模式下化合物二級(jí)質(zhì)譜圖及其裂解途徑圖

4 討論

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝優(yōu)化常采用正交試驗(yàn)法和響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法。其中響應(yīng)面法是通過一系列的確定性試驗(yàn)，在設(shè)計(jì)空間中找到適宜的試驗(yàn)點(diǎn)，并得到各變量與響應(yīng)值間的數(shù)據(jù)，在中藥學(xué)和天然藥物化學(xué)等研究中應(yīng)用廣泛。桑黃是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥用菌，近年來已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，目前除了安徽省率先制定桑黃飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)外，浙江、遼寧等省也相繼制定桑黃飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要的使用方式為煎煮法。本研究采用響應(yīng)面法，以紫萁酮含量為指標(biāo)對(duì)桑黃湯劑的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明優(yōu)化的最佳工藝為料液比1∶20、煎煮時(shí)間45min、煎煮次數(shù)3次。

桑黃作為一種藥用真菌，其化學(xué)成分在發(fā)揮其功效時(shí)起著至關(guān)重要的作用。本研究采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)對(duì)桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，通過高分辨質(zhì)譜提供的精確分子量和碎片裂解信息，分析和鑒定了桑黃主要成分的裂解碎片。結(jié)果共鑒定出成分49個(gè)，該研究可為桑黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑有效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。