槐耳顆粒對逆轉(zhuǎn)不完全熱消融后肝癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的作用及機制研究*

鐘 海 孔凡創(chuàng) 周春暉 王曉光 劉曉琳

嘉興市第二醫(yī)院 浙江 嘉興 314001

肝癌是世界范圍內(nèi)第五大惡性腫瘤[1]。近年來，熱消融在肝癌治療中發(fā)展迅速。本課題組研究顯示[2]，在直徑小于3cm的小肝癌治療中，完全消融療效可與手術(shù)切除媲美。但部分肝癌很難達到理想的完全消融。

中藥制劑槐耳顆粒作為肝癌根治性切除術(shù)后的輔助治療，能顯著延長無復發(fā)生存期，并有效減少肝外復發(fā)[3]。研究顯示，槐耳能夠有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的初始階段上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，從而抑制腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移[4]。本研究通過建立亞致死肝癌細胞熱損傷模型，探討槐耳顆粒治療不完全熱消融后肝癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的機制。

1 材料與方法

1.1 材料：分述如下。

1.1.1 槐耳顆粒：國藥準字：Z20000109，產(chǎn)品編號：B14006012409，購自啟東蓋天力藥業(yè)有限公司。

1.1.2 細胞株：人肝癌（Huh7）細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。購買的Huh7細胞被接種在由10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基組成的生長培養(yǎng)基中。培養(yǎng)環(huán)境是37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱。

1.1.3 實驗試劑：DMEM細胞培養(yǎng)基（PM150210，Pro‐cell）；胎 牛血清（164210，Procell）；CCK-8溶液［40203ES60，翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；TRI reagent?（T9424，美國Sigma-Aldrich公司）；Re‐vertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622，美國Thermo Scientific公司）；RIPA裂解液（R0010，北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.4 儀器：細胞培養(yǎng)箱；恒溫水浴鍋（上海比朗儀器制造有限公司）；UV-1800紫外分光光度計（上海美析儀器有限公司）；BX-51光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Fast7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；BIORAD凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc? XR+）

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 構(gòu)建亞致死肝癌細胞熱損傷模型：收集對數(shù)生長期的Huh7細胞，在15mL聚丙烯管中（5×104個）密封（Parafilm封口膜）。根據(jù)分組，Huh7細胞被置于不同溫度的恒溫水浴鍋中進行熱應激處理。30min后，Huh7細胞被轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱中恢復培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分組：本研究包含以下細胞處理條件：①熱損傷處理溫度分別設定為41.5℃、42℃、42.5℃、43℃、43.5℃、44℃、47℃、50℃；②恢復培養(yǎng)的時間為1d、2d、3d、4d和5d；③槐耳干預濃度分為0、2、4、6、8g/L（溶劑為無血清DMEM培養(yǎng)基）。最終的熱損傷和槐耳干預條件均通過CCK-8測定的細胞生存率確定。對照組細胞保持37℃培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8實驗：收集的Huh7細胞處理為10000個/mL的細胞懸液。10μl CCK-8溶液加入100μl細胞懸液中。2h后用UV-1800紫外分光光度計測定450nm的吸光度，并計算Huh7細胞的生存率和抑制率［抑制率=（1-實驗孔A450nm/對照組A450nm）×100%］。

1.2.4 Transwell實驗：Huh7細胞被無血清培養(yǎng)基調(diào)整為1×105個/mL的細胞懸液。侵襲實驗中，Corning Transwell小室上層鋪有基質(zhì)膠；遷移實驗中不需要添加基質(zhì)膠。小室上層添加100μl細胞懸液，下層添加600μl含血清培養(yǎng)基。72h后，小室下層的細胞被固定和染色。發(fā)生侵襲和遷移的Huh7細胞數(shù)量均在顯微鏡下觀察和計數(shù)。

1.2.5 實時熒光定量（qRT-PCR）：使用TRI reagent?分離細胞的總RNA。通過RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit和PCR擴增儀的處理得到cDNA。cDNA、待測mRNA引物、SYBR Green染液與DEPC水混勻后被加入Fast7500實時熒光定量PCR儀中檢測。mRNA水平統(tǒng)一按照2-ΔΔCT的形式。引物序列如下（5’-3’）：N-Cadherin，（上游）AGGCTTCTGGTGAAATCGCA，（下游）GGAGGGAT‐GACCCAGTCTCT；vimentin，（上游）TCCGCACATTCGAGCAAA‐GA，（下 游）AAGCGCACCTTGTCGATGTA；snail，（上 游）CGAGTGGTTCTTCTGCGCTA，（下 游）GGGCTGCTGGAAGGTA‐AACT；E-Cadherin，（上游）CAGGCCTCCGTTTCTGGAAT，（下游）GGTGTATACAGCCTCCCACG；GAPDH，（上游）TGTGGGCAT‐CAATGGATTTGG，（下游）ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。

1.2.6 Western blot檢測：使用RIPA裂解液抽提Huh7細胞的總蛋白。測定蛋白濃度后，蛋白中加入上樣緩沖液并高溫變性。經(jīng)過SDS-PAGE電泳和電轉(zhuǎn)步驟，蛋白被轉(zhuǎn)移到PVDF膜（1620177，美國Bio-Rad）上。PVDF膜在5%封閉液中孵育2h。再次清洗后，PVDF膜依次在稀釋的一抗和二抗中孵育12h（4℃）和1h（室溫）。1min后，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白表達。GAPDH在本實驗中作為內(nèi)參基因。

1.2.7 統(tǒng)計學方法：所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計均通過Graphpad 8.0軟件實現(xiàn)。計量資料統(tǒng)一按照±s的形式表示，兩組差異比較采用獨立樣本t檢驗，三組及三組以上差異比較采用One-way ANOVA方差分析和Bofferroni事后檢驗法。統(tǒng)計學意義判定標準為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 熱損傷對肝癌細胞活性的影響：隨著熱處理溫度升高，Huh7細胞的存活率逐漸降低；從43.5℃處理開始，48h的細胞存活率顯著低于同溫度24h的細胞存活率（P＜0.05），且44℃時細胞存活率降低約50%，見圖1A。因此選擇43.5℃作為后續(xù)處理溫度。CCK-8實驗顯示，熱處理早期，熱處理組細胞活性低于對照組，見圖1B和表1；從恢復培養(yǎng)3天開始，熱處理組Huh7細胞的活性顯著高于對照組（P＜0.05），見圖1B和表1。熱處理條件最終設定為43.5℃恒溫水浴處理30min，隨后細胞送至37℃培養(yǎng)箱恢復72h。

圖1 熱損傷對Huh7細胞活性的影響

表1 熱損傷對Huh7細胞增殖力影響(±s)

表1 熱損傷對Huh7細胞增殖力影響(±s)

熱處理后1d 2d 3d 4d 5d對照組A值0.29＋0.01 0.58＋0.04 0.82＋0.05 1.21＋0.08 1.75＋0.10抑制率/%-----熱處理組A值0.24＋0.02 0.45＋0.03 0.95＋0.04 1.45＋0.09 2.22＋0.12抑制率/%0.17 0.22-0.16-0.20-0.27

Transwell實驗結(jié)果顯示，和對照組比較，熱處理增加了侵襲和遷移的Huh7細胞數(shù)量（P＜0.05），見圖2A和2B。

圖2 熱損傷對Huh7細胞侵襲和遷移的影響

2.2 熱損傷對EMT相關基因的調(diào)控影響：qRT-PCR結(jié)果顯示，和對照組比較，熱處理組N-Cadherin、vimentin和snail的mRNA水平顯著上調(diào)，E-Cadherin的水平顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖3A-D。Western blot檢測結(jié)果顯示，熱處理上調(diào)N-Cadherin、vimentin和snail的蛋白，下調(diào)E-Cadherin蛋白，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3E-G。

圖3 熱損傷對Huh7細胞中EMT相關基因表達的影響

2.3 槐耳阻止熱損傷誘導的Huh7細胞增殖、侵襲和遷移：與對照組比較，單純熱處理的Huh7細胞生存率高于對照組（P＜0.05），見圖4A。加入槐耳顆粒后，Huh7細胞的活性隨著藥物濃度的升高而降低；當槐耳濃度達到4g/L時，與0g/L組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4A。根據(jù)該結(jié)果，槐耳干預條件確定為6g/L、8g/L。

Transwell實驗結(jié)果顯示，與熱處理組比較，槐耳減少了熱處理誘導的Huh7細胞侵襲和遷移，有效地降低了Huh7細胞的侵襲率和遷移率（P＜0.05），見圖4B和4C。

圖4 槐耳阻止熱損傷誘導的Huh7細胞增殖、侵襲和遷移

2.4 槐耳通過下調(diào)p-AKT蛋白，阻止熱損傷誘導的EMT相關基因變化：Western blot檢測結(jié)果顯示，增加槐耳干預后，Huh7細胞中N-Cadherin、vimentin和snail蛋白表達下調(diào)，E-Cadherin水平上調(diào)，與熱處理組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5A-E。另外，熱處理組Huh7細胞中p-AKT的水平明顯高于對照組（P＜0.05），但是AKT表達沒有變化；當細胞恢復培養(yǎng)時增加槐耳處理后，p-AKT水平降低（P＜0.05），見圖5F-G。

圖5 槐耳下調(diào)p-AKT阻止熱損傷誘導的EMT相關基因變化

3 討論

近年來隨著微創(chuàng)領域技術(shù)不斷地革新，熱消融技術(shù)已經(jīng)被納入肝癌根治性方案中。但這種治療的缺陷是熱能經(jīng)過輻射后殺傷能力降低，導致了腫瘤殘存和高轉(zhuǎn)移復發(fā)的臨床現(xiàn)象[5]。

EMT是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程，是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程。因此，檢測標志性基因是監(jiān)測EMT進程的關鍵。E-cadherin具有維持細胞間穩(wěn)定性、連接性和細胞極性的能力，能夠抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[6]。N-cadherin、Vimentin和Snail的上調(diào)則促進了EMT的發(fā)生。本文在亞致死肝癌細胞熱損傷模型的基礎上，通過檢測上述基因，證明熱損傷能夠促進EMT進程。

槐耳及其提取物在誘導癌細胞凋亡、抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移等多種抗癌途徑中的機制被挖掘，被廣泛應用于癌癥輔助治療。本研究發(fā)現(xiàn)，槐耳減少了熱處理后Huh7細胞的轉(zhuǎn)移，機制可能與抑制p-AKT有關。眾所周知，PI3K-AKT通路參與了包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。例如Jondal等[7]證實使用AKT通路抑制劑能夠降低熱消融術(shù)后肝癌細胞的生長。這些結(jié)論較大程度上增加了本研究的可靠性。

綜上，槐耳抑制不完全熱消融誘導的EMT進程，減少肝癌細胞的轉(zhuǎn)移，機制與抑制AKT磷酸化有關。