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    基于高通量技術(shù)對(duì)比分析南洲大曲與茅臺(tái)大曲的細(xì)菌多樣性

    2022-11-05 12:35:34何猛超羅家順涂翠娥張嬌嬌胡景輝韓興林
    釀酒科技 2022年10期
    關(guān)鍵詞:醬香型大曲菌門

    何猛超,羅家順,羅 軻,3,涂翠娥,張嬌嬌,胡景輝,韓興林

    (1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京 100015;2.湖南南洲酒業(yè)有限公司,湖南南縣 413200;3.湖南中和生物科技有限公司,湖南益陽 413000;4.國(guó)家酒類品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心,北京 100015)

    醬香型白酒作為中國(guó)傳統(tǒng)白酒之一,以醬香突出、濃郁豐滿、空杯留香持久的特點(diǎn)受到廣大消費(fèi)者的青睞。醬香型白酒以高粱為原料,高溫大曲為糖化發(fā)酵劑經(jīng)高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、三年陳釀等工藝釀造。高溫大曲又稱“細(xì)菌曲”,作為醬香型白酒特有的曲種,含有多種微生物以及豐富的酶系,是醬香型白酒發(fā)酵過程中微生物的主要來源,同時(shí)賦予醬香型白酒獨(dú)特的香氣和風(fēng)味。酒曲質(zhì)量的好壞很大程度上影響白酒的品質(zhì),由于不同地區(qū)、不同白酒企業(yè)使用的高溫大曲不同,導(dǎo)致生產(chǎn)的醬香型白酒品質(zhì)各異。因此,研究高溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu),尤其是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),有利于調(diào)控醬香型高溫大曲的制曲工藝,對(duì)醬香型白酒的優(yōu)質(zhì)釀造具有深遠(yuǎn)意義。

    隨著現(xiàn)代技術(shù)的高速發(fā)展,高通量測(cè)序技術(shù)在白酒行業(yè)的運(yùn)用十分廣泛,主要用于研究酒曲、釀造環(huán)境、酒醅等微生物多樣性。近年來,高通量技術(shù)在醬香型白酒行業(yè)的研究中逐漸普遍,利用高通量技術(shù)解析高溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)及功能,結(jié)合傳統(tǒng)可培養(yǎng)方式篩選、分離功能微生物,兩種技術(shù)的聯(lián)用能更好地解析高溫大曲的微生物多樣性,對(duì)深入研究高溫大曲中不同微生物的產(chǎn)酶、產(chǎn)香特性具有重要意義。

    茅臺(tái)酒是我國(guó)醬香型白酒的典型代表,其使用的高溫大曲也是醬香型白酒行業(yè)公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)大曲。以茅臺(tái)大曲為對(duì)照,研究其他醬香型白酒企業(yè)的高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu),對(duì)比分析兩者的微生物差異性,將有助于企業(yè)調(diào)控制曲工藝,提升產(chǎn)品的品質(zhì)。湖南南洲酒業(yè)有限公司,具有百年釀酒歷史,致力于以稻米、高粱、小麥為主要原料的湖南區(qū)域特色的酒類產(chǎn)品開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)研究,釀造的醬香型白酒選用貴州茅臺(tái)地區(qū)生產(chǎn)的紅纓子糯高粱,采用“三高三長(zhǎng)”醬酒釀制工藝,所釀酒體醬香突出,幽雅細(xì)膩,深受業(yè)界及消費(fèi)者好評(píng)。目前,鮮有關(guān)于我公司南洲大曲的研究報(bào)道。

    基于此,本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)南洲大曲和茅臺(tái)大曲的細(xì)菌多樣性,采用生物信息學(xué)分析方法對(duì)比研究南洲大曲與茅臺(tái)大曲之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異。通過本研究為我公司醬香型大曲工藝的改良以及產(chǎn)品質(zhì)量的提高提供指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、儀器

    耗材:本實(shí)驗(yàn)所用高溫大曲為南洲大曲以及茅臺(tái)大曲,由湖南南洲酒業(yè)有限公司提供。大曲微生物DNA試劑盒為Fast DNA?Spin Kit for Soil。

    儀器:Illumina MiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái),美國(guó)Illumina公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 大曲微生物DNA的提取

    采用Fast DNA? Spin Kit for Soil 試劑盒提取兩種大曲的總DNA,具體提取步驟參照試劑盒說明書。提取后的DNA 采用Nanodrop 進(jìn)行定量,并通過1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量。檢測(cè)合格的樣品使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建。細(xì)菌使用引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')擴(kuò)增V4 高變區(qū)。本測(cè)試在中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院高通量測(cè)序平臺(tái)完成。

    1.2.2 生物信息學(xué)分析

    在序列充足的情況下,為了使分析結(jié)果質(zhì)量更高,首先對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)進(jìn)行過濾處理,得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data),基于有效數(shù)據(jù)進(jìn) 行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚 類分析。基于OTU 聚類結(jié)果,可對(duì)OTU 進(jìn)行Alpha 多樣性分析,了解樣品內(nèi)微生物群落的多樣性和豐富度。基于物種組成分析,得到相應(yīng)的物種信息;Venn圖分析得到樣品間共有或獨(dú)有的物種數(shù)目。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 兩種高溫大曲細(xì)菌群落Alpha 多樣性比較分析

    通過質(zhì)量初篩的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體后的樣品的高質(zhì)量序列量分別為茅臺(tái)大曲68679、南洲大曲67202?;诩?xì)菌OTU 數(shù)進(jìn)行Alpha 多樣性指數(shù)分析以及豐度等級(jí)曲線分析如表1、圖1 所示。從表1 可以看出,兩個(gè)高溫大曲樣品的覆蓋率(Goods coverage)均高于0.99,說明測(cè)序結(jié)果具有較高可信度,能夠反映樣品的真實(shí)情況。

    圖1 豐度等級(jí)曲線圖

    一般,多樣性指數(shù)主要反映樣品內(nèi)微生物群落的多樣性和豐富度。其中,Chao1 指數(shù)和Observed species 指數(shù)標(biāo)示樣品細(xì)菌群落的豐富度,Chao1 指數(shù)和Observed species 指數(shù)越大,表明群落的豐富度越高。茅臺(tái)大曲的Chao1 指數(shù)和Ob-served species 指數(shù)分別為432.61、428.80,均高于南洲大曲(Chao1 指數(shù)421.28,Observed species 指數(shù)420.60),說明茅臺(tái)大曲樣品的細(xì)菌群落豐富度高(表1)。Simpson 指數(shù)、Shannon 指數(shù)用來反映樣品的物種多樣性,Shannon 指數(shù)/Simpson 指數(shù)值越高,表明群落的多樣性越高。就樣品的細(xì)菌多樣性來說,南洲大曲樣品的Simpson 指數(shù)(0.96)以及Shannon 指數(shù)(5.93)較高,表明南洲大曲樣品中細(xì)菌多樣性高。Pielou’s evenness 指數(shù)標(biāo)示微生物群落的均勻性,南洲大曲樣品的細(xì)菌群落均勻性略高于茅臺(tái)大曲。

    表1 兩種高溫大曲細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)比較分析結(jié)果

    圖1 為兩個(gè)樣品的豐度等級(jí)曲線圖,該曲線可以直觀地反映群落中高豐度和稀有OTU 的數(shù)量。折線在橫軸上的長(zhǎng)度反映了樣品在該豐度中的OTU 數(shù);折線的平緩程度,反映了群落組成的均勻度,折線越平緩,則群落中各OTU 間的豐度差異越小,群落組成的均勻度越高,折線越陡峭,則均勻度越低。從圖1 可知,兩個(gè)高溫大曲樣品微生物群落組成均勻。

    2.2 兩種大曲之間物種差異性分析

    韋恩圖可以直觀反映不同樣品之間的共有物種和特有物種,茅臺(tái)大曲和南洲大曲兩個(gè)樣品的微生物物種差異性如圖2 所示。從圖2 可知,茅臺(tái)大曲和南洲大曲的細(xì)菌數(shù)分別為430、419,兩個(gè)高溫大曲之間共有的細(xì)菌數(shù)僅為86 個(gè),說明兩者之間的細(xì)菌群落差異性較大,這可能與兩種大曲制曲的環(huán)境、氣候不同相關(guān)。

    圖2 兩種高溫大曲的韋恩圖

    2.3 兩種大曲之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較分析

    2.3.1 兩種大曲的細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)分析

    為進(jìn)一步比較兩種大曲之間細(xì)菌群落豐度上的差異,根據(jù)OTU 分析結(jié)果,對(duì)樣品數(shù)據(jù)在門和屬水平上進(jìn)行分類學(xué)分析。選取在門水平上豐度排名前20 的微生物進(jìn)行差異性分析,結(jié)果見圖3。從圖3 可知,茅臺(tái)大曲和南洲大曲中的優(yōu)勢(shì)菌門均為Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)以及Cyanobacteria(藍(lán)藻菌門)。這與前人研究結(jié)果相似,趙馳等發(fā)現(xiàn)不同原料制成的高溫大曲均是以厚壁菌門和放線菌門為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)門;侯強(qiáng)川等發(fā)現(xiàn)湖北省堯治河高溫大曲以厚壁菌門、放線菌門、變形菌門作為優(yōu)勢(shì)菌門;戴奕杰等發(fā)現(xiàn)醬香型白酒在高溫制曲、發(fā)酵釀酒兩個(gè)階段的優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門4類。說明醬香型白酒的優(yōu)勢(shì)菌門以上述4 類為主,但不同菌門的豐度不一致。本研究中南洲大曲和茅臺(tái)大曲就4 類優(yōu)勢(shì)菌門而言,細(xì)菌的群落豐度存在差異。南洲大曲的放線菌門(8.36 %)豐度顯著低于茅臺(tái)大曲的放線菌門豐度(23.62 %),變形菌門豐度(30.66%)顯著高于茅臺(tái)大曲的變形菌門豐度(14.22%)。

    圖3 基于門水平兩種高溫大曲的細(xì)菌相對(duì)豐度圖

    2.3.2 兩種大曲的細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)分析

    基于屬水平兩種大曲的細(xì)菌相對(duì)豐度圖如圖4所示。相對(duì)豐度較高的菌屬為(芽孢桿菌屬)、(乳球菌屬)、(糖多孢菌屬)、(克羅彭斯特菌屬)、(假諾卡氏菌屬)、(片球菌屬)、(魏斯氏菌屬)、(高溫放線菌屬)等。本文研究與前人研究結(jié)果相似,GAN等分析茅臺(tái)大曲的微生物群落組成和功能特征,發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌群為鏈孢桿菌屬()、芽孢桿菌屬()、乳酸菌屬()、糖多孢菌屬()和枝芽孢菌屬()等;JIANG 等采用高通量測(cè)序技術(shù)解析北方醬香型白酒高溫大曲制曲過程中微生物多樣性,結(jié)果表明,6 個(gè)大曲樣品中主要細(xì)菌屬為乳酸菌()、魏斯氏菌()、芽孢桿菌()、糖多孢菌()等。從圖4 來看,(芽孢桿菌屬)在南洲大曲和茅臺(tái)大曲中是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬,相對(duì)豐度分別為24.03%、22.96%。研究表明,芽孢桿菌屬是醬香型白酒中的功能微生物,具有較強(qiáng)的酶分泌能力,能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、糖化酶等,還能生成醬香型白酒中的風(fēng)味成分,如四甲基吡嗪等。在茅臺(tái)酒曲中為優(yōu)勢(shì)菌屬的(乳球菌屬)19.13 %、(克羅彭斯特菌屬)7.00 %,在南洲大曲中的相對(duì)豐度僅為2.15 %和1.57 %。相反地,南洲大曲中相對(duì)豐度較高的(片球菌屬)9.18%、(魏斯氏菌屬)8.26%、(沙雷氏菌屬)4.54 %、(高溫放線菌屬)4.54 %等幾個(gè)菌屬在茅臺(tái)大曲中相對(duì)豐度較低,僅為0.85 %、0.20 %、0.27 %、0.15 %。上述結(jié)果顯示兩種大曲之間在細(xì)菌屬水平上存在較大差異,南洲大曲存在獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)。有報(bào)道顯示,克羅彭斯特菌屬在白酒發(fā)酵中有利于乙酸、乳酸、乙酸乙酯等風(fēng)味的形成。魏斯氏菌屬作為乳酸菌的一類,具有生成乳酸,降低發(fā)酵體系pH 值的作用,在傳統(tǒng)發(fā)酵食品行業(yè)是至關(guān)重要的菌株。因此,通過對(duì)比茅臺(tái)大曲和南洲大曲細(xì)菌屬的差異,可為后續(xù)南洲大曲酒廠篩選功能微生物或強(qiáng)化大曲提供一定指導(dǎo)。

    圖4 基于屬水平兩種高溫大曲的細(xì)菌相對(duì)豐度圖

    3 結(jié)論

    本研究采取高通量測(cè)序技術(shù),以茅臺(tái)大曲為標(biāo)尺對(duì)比分析了南洲大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。結(jié)果表明,Alpha多樣性指數(shù)中,茅臺(tái)大曲的細(xì)菌群落豐富度較高,南洲大曲的細(xì)菌群落多樣性較高。在細(xì)菌門水平,茅臺(tái)大曲和南洲大曲中的優(yōu)勢(shì)菌門均為Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)以及Cyanobacteria(藍(lán)藻菌門)。南洲大曲的放線菌門(8.36 %)豐度顯著低于茅臺(tái)大曲的放線菌門豐度(23.62 %),變形菌門豐度(30.66 %)顯著高于茅臺(tái)大曲的變形菌門豐度(14.22%);細(xì)菌屬水平,南洲大曲和茅臺(tái)大曲的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬均為(芽孢桿菌屬),但兩種大曲之間在細(xì)菌屬水平上存在較大差異,南洲大曲存在獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu),其優(yōu)勢(shì)菌屬為(芽孢桿菌屬)、(片球菌屬)、(魏斯氏菌屬)、(沙雷氏菌屬)等。通過對(duì)比分析南洲大曲與茅臺(tái)大曲之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異,可為后續(xù)醬香型大曲工藝的改良以及產(chǎn)品質(zhì)量的提高提供有益指導(dǎo)。

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