基于轉(zhuǎn)錄組測序金絲草葉片響應(yīng)鉛脅迫的抗氧化酶相關(guān)基因

朱晨璐，武欣怡，喻君保，黃偲祺，曹樹一，翟林，韓雪潔，侯曉龍，2，3*

（1.福建農(nóng)林大學林學院，福州 350002；2.南方紅壤區(qū)水土保持國家林業(yè)和草原局重點實驗室，福州 350002；3.海峽兩岸紅壤區(qū)水土保持協(xié)同創(chuàng)新中心，福州 350002）

土壤重金屬污染是世界普遍關(guān)注的環(huán)境問題，土壤重金屬污染修復是目前研究的熱點[1]。植物修復克服了傳統(tǒng)物理和化學修復投資大、破壞土壤結(jié)構(gòu)并且容易造成二次污染等缺點，是一項經(jīng)濟、綠色、環(huán)保的修復技術(shù)，受到普遍青睞[2]。近年來，有關(guān)學者在重金屬超富集植物的篩選、植物效果和耐性機理方面開展了較多研究[3-5]，篩選出了一些針對不同重金屬的超富集植物，例如：砷（As）超富集植物蜈蚣草（Pteris VittaL.）[6]、2007年發(fā)現(xiàn)的鉻（Cr）超富集植物李氏禾（Leersia hexandraSw.）[7]、鎘（Cd）超富集植物東南景天（Sedum alfrediiHance）[8]等。但是，目前篩選出的超富集植物普遍具有生物量小、富集重金屬單一等問題，因此限制了植物修復技術(shù)的大范圍應(yīng)用[5]。植物對重金屬的轉(zhuǎn)運、耐受及富集能力是植物修復技術(shù)的關(guān)鍵，尋找超富集植物并探討其對重金屬脅迫的響應(yīng)機制，從而進一步提升植物修復效率，已受到學者們的廣泛關(guān)注[9]。研究表明一些超富集植物可通過形態(tài)的改變或生理的調(diào)控來適應(yīng)重金屬脅迫，但目前對植物適應(yīng)重金屬脅迫的內(nèi)在機制尚不清晰，特別是在分子生物學機制方面還有待進一步深入探索。

金 絲 草[Pogonatherum crinitum（Thunb.）Kunth.]是一種重金屬鉛（Pb）的超富集植物，該植物能在Pb含量高達20 000 mg·kg-1的脅迫環(huán)境中正常生長，在重金屬礦區(qū)金絲草生物轉(zhuǎn)運系數(shù)可以達到10.18[10]。重金屬Pb脅迫下，金絲草可通過提高抗氧化酶活性[超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）]、提高滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)含量[脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（Cpr）]和調(diào)控抗壞血酸-谷胱甘肽（ASA-GSH）循環(huán)等策略來適應(yīng)Pb脅迫環(huán)境[11]，特別是隨Pb脅迫濃度的增大，金絲草體內(nèi)抗氧化酶活性呈增加趨勢[12]，說明抗氧化系統(tǒng)在抵御重金屬毒害中起重要作用，但對其分子生物學過程尚不清楚。目前，國內(nèi)外對植物響應(yīng)逆境脅迫的抗氧化酶相關(guān)基因已開展一些研究。邵文靜等[13]的研究發(fā)現(xiàn) 高 粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]的SbSODs、Sb-PODs等基因在低溫脅迫下上調(diào)表達，這一發(fā)現(xiàn)為探討高粱耐低溫機制提供了參考；肖生鴻等[14]的研究發(fā)現(xiàn)低濃度的汞（Hg）會誘導POD3、CAT2等基因上調(diào)，以此來降低重金屬的毒害。研究表明芥菜[Brassica juncea（L.）Czern.]幼苗通過提高與CAT、POD和SOD等酶相關(guān)基因的表達量，加強抗氧化系統(tǒng)抗逆性，從而響應(yīng)脅迫[15]；ALARAIDH等[16]的研究發(fā)現(xiàn)在Pb、Cr和Cd脅迫下，葫蘆巴（Trigonella foenum-graecumL.）通過調(diào)控CAT、POD等酶的相關(guān)基因不同程度地表達來減弱重金屬對其的毒害作用；通過對苜蓿（Medicago sativaL.）的研究發(fā)現(xiàn)，非生物脅迫環(huán)境可刺激抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）和SOD等相關(guān)酶的表達使之適應(yīng)脅迫環(huán)境[17]。但目前對金絲草耐Pb的分子機制尚未明確，對其響應(yīng)Pb脅迫的抗氧化酶相關(guān)基因及其作用機制尚不清晰。

本研究以Pb超富集植物金絲草為研究對象，設(shè)計不同Pb濃度模擬脅迫試驗，比較不同Pb脅迫處理下金絲草抗氧化酶活性的差異，對Pb脅迫處理的金絲草葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出與抗氧化酶活性相關(guān)的差異表達基因并進行qRT-PCR驗證，揭示與金絲草響應(yīng)Pb脅迫的抗氧化酶相關(guān)基因及其作用機理，為更深入揭示植物響應(yīng)Pb脅迫的內(nèi)在機理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的金絲草采用種子培養(yǎng)，種子采自福建三明鉛鋅礦區(qū)。將種子均勻撒到溫室中的苗床上，保持土壤含水量為田間持水量的70%左右，待金絲草長至15 cm左右時開展脅迫試驗。

1.2 試驗設(shè)計

選擇長勢一致的金絲草幼苗，清洗干凈根系后，移栽到盛有1/8 Hoagland營養(yǎng)液的水培裝置中，并使用定植籃、定植棉固定，每盆移栽幼苗15株，在營養(yǎng)液中緩苗3 d后開始Pb脅迫試驗。設(shè)置不同濃度Pb處理，分別為300、500、1 000 mg·L-1和2 000 mg·L-1（分別用Pb300、Pb500、Pb1000和Pb2000表示），采用（CH3COOH）2Pb配制的60 mg·L-1的Pb溶液，按照設(shè)計的Pb脅迫濃度加入相應(yīng)Pb溶液于裝有營養(yǎng)液的培養(yǎng)裝置中，同時設(shè)置無Pb脅迫的對照試驗（CK）。營養(yǎng)液為1/8的Hoagland營養(yǎng)液，營養(yǎng)成分見表1，其中KH2PO4濃度由原配方的0.136 g·L-1減少為0.680 mg·L-1，以避免產(chǎn)生沉淀。用去離子水反復清洗金絲草根系后移入不同Pb濃度的脅迫液中，置于人工氣候培養(yǎng)箱中進行脅迫試驗，溫度為25℃，濕度為75%，光照強度為6 000 lx，晝夜光照時間為16 h/8 h，脅迫時間為7 d。選取新鮮金絲草葉片剪碎混勻裝入離心管，經(jīng)液氮速凍，置于-80℃冰箱備用。CK、Pb300、Pb500、Pb1000和Pb2000處理的樣品用于抗氧化酶活性和丙二醛（MDA）含量測定、RNA提取，并供熒光定量使用，每個處理各3次重復。同時選取CK、Pb1000處理的樣品用于RNA測序分析，每組3次重復。

表1 Hoagland營養(yǎng)液組分Table 1 Components of Hoagland nutrient solution

1.3 試驗方法

1.3.1 抗氧化酶的測定

制備酶液：稱取金絲草新鮮葉片0.2 g，使用液氮在研缽中研磨成勻漿后放入4 mL離心管，加入1 mL 0.05 mol·L-1pH 7.8的磷酸鹽緩沖液，定容至4 mL。利用渦旋儀混勻，放入冷凍高速離心機4℃、10 000 r·min-1下離心10 min，取上清液放入4℃冰箱備用。金絲草葉片SOD、CAT、POD活性和MDA含量分別采用氮藍四唑法、紫外吸收法、愈創(chuàng)木酚法和硫代巴比妥酸法測定[18]。

1.3.2 RNA提取、測序和組裝

新鮮植株使用TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA，利用超微量分光光度計檢測RNA濃度及純度（濃度需大于50 ng·μL-1，OD值在1.8～2.0之間，保證RNA純度）。配制1%的瓊脂糖膠，將RNA樣品加入進樣口，電泳約20 min，將膠放置在全自動凝膠成像儀上觀察樣品的完整度及是否存在DNA污染跑膠。得到的RNA經(jīng)質(zhì)檢后建立文庫，使用Illumina HiSeq 4000測序平臺測序，將最終得到的clean reads利用組裝軟件Trinity[19]進行組裝并評估。用RSEM軟件對組裝出來的unigene定量。

1.3.3 差異基因分析

將基因表達水平中的reads count數(shù)據(jù)，使用DESeq2[20]軟件進行分析，得到差異基因。FDR（錯誤發(fā)現(xiàn)率）＜0.05且| |log2FC＞1的基因為顯著差異基因，將顯著差異的Unigene向GO數(shù)據(jù)庫的各條目映射進行功能分析，同時將Unigene與KEGG數(shù)據(jù)庫比對確定基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。結(jié)合兩種富集分析結(jié)果，篩選需要的差異基因。

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄與熒光定量

使用全式金公司生產(chǎn)的Uni All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用NCBI中premier designing tools設(shè)計篩選出的與金絲草葉片抗氧化酶相關(guān)的耐Pb基因?qū)χ亟饘貾b脅迫響應(yīng)的引物，如表2所示。

表2 候選基因名稱及定量引物序列Table 2 Candidate gene names and primer sequences used in qRT-PCR

使用福州都拜特生物技術(shù)有限公司的QuanStu-dio3 System熒光定量PCR儀，反應(yīng)體系為：上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA 1 μL，2×PerfectStart Green qPCR SuperMix 10 μL，Nuclease-free Water 8.2 μL，共20 μL。反應(yīng)過程為94℃30 s，94℃5 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3個生物學重復，每個生物學重復設(shè)3個技術(shù)重復，使用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 25軟件，采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）和Tukey's post-hoc檢驗對試驗數(shù)據(jù)進行多重比較。抗氧化酶活性與分子生物學指標均做3次重復試驗，試驗結(jié)果用平均值±標準差表示。采用Origin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb脅迫對金絲草葉片抗氧化酶活性的影響

不同Pb脅迫濃度下，金絲草葉片抗氧化酶活性的變化如圖1所示。隨著Pb濃度的增加，金絲草葉片POD酶活性呈上升趨勢，Pb1000、Pb2000處理下的POD酶活性顯著大于CK及其他處理（P＜0.05），分別比CK處理提高10.16%、10.27%。Pb脅迫下，金絲草葉片CAT酶活性隨Pb濃度的增加而增加，且Pb2000、Pb1000及Pb500處理下的酶活性顯著大于CK處理（P＜0.05），分別是CK處理的2.14、1.90倍和1.82倍。葉片SOD酶活性則是隨著Pb濃度的增加呈逐漸上升的變化規(guī)律，且Pb1000、Pb2000處理的酶活性顯著大于CK處理（P＜0.05），相較于Pb1000處理，Pb2000處理下的SOD酶活性提高了18.54%，二者差異顯著（P＜0.05）。隨著Pb濃度增加，金絲草葉片MDA含量總體呈上升趨勢，與CK處理相比，Pb500、Pb1000處理下的MDA含量分別提高了0.57、1.30倍，差異顯著（P＜0.05），但Pb2000處理下的MDA含量顯著低于其他處理（P＜0.05）。由此可見，金絲草葉片可能通過抗氧化酶響應(yīng)及MDA含量的變化來適應(yīng)Pb脅迫，不同抗氧化酶通過不同響應(yīng)方式提高植物耐性，減少Pb脅迫對植株的毒害。

圖1 不同Pb脅迫濃度對金絲草葉片抗氧化酶活性和MDA含量的影響Figure 1 Effects of different Pb stress concentrations on antioxidant enzyme activities and MDA content in the leaves of P.crinitum

2.2 測序結(jié)果

由于Pb濃度為1 000 mg·L-1處理的金絲草葉片抗氧化酶活性變化顯著，故選擇對照（CS）處理與1 000 mg·L-1Pb脅迫（TS）處理的金絲草葉片樣品進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，每組3個重復，共6個樣品，測序結(jié)果如表3所示。兩組樣品經(jīng)組裝、過濾后得到總堿基數(shù)共56.34 Gb，GC比例為57.37%～58.06%，堿基組成平衡。各樣品堿基質(zhì)量值達到Q20以上水平的堿基數(shù)目占比均大于95%，達到Q30以上的堿基數(shù)目占比均大于90%，說明各樣品測序質(zhì)量高，達到建庫要求。

表3 金絲草葉片轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析Table 3 Analysis of transcriptome sequencing data of P.crinitum

2.3 差異基因表達

通過Deseq2軟件分析TS與CS處理金絲草葉片的差異表達基因，基于差異分析結(jié)果篩選FDR＜0.05且|log2FC|＞1的基因為顯著差異基因（圖2）。分析發(fā)現(xiàn)TS與CS處理金絲草的葉片Unigenes共有3 282個差異基因（DEGs），其中有1 626個上調(diào)基因和1 656個下調(diào)基因。由圖3可知，金絲草耐Pb相關(guān)基因在CS與TS處理下差異顯著。與CS處理組相比，TS處理組與抗氧化酶相關(guān)的基因（POD、CAT、SOD、GSH、Unigene0049346、Unigene0015966、Unigene0002954、Unigene0032786和Unigene0041749等）表達上調(diào)，與Pb脅迫下金絲草葉片抗氧化酶活性變化趨勢一致。除此之外，金屬硫蛋白（MTs）、蛋白激酶（Kinase）、類甜蛋白（Thaumatin-like protein）、BOX、ZIP、NAC轉(zhuǎn)運蛋白、ABC轉(zhuǎn)運蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等均為上調(diào)表達，這些可能也與提高植物抗逆性來適應(yīng)Pb脅迫有關(guān)；葉綠體多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，chloroplastic）、蛋白質(zhì)線粒體（Protein mitochondrial）和組織蛋白酶（Cathepsin）等則為下調(diào)表達，這類基因與植株機能代謝有關(guān)，說明Pb脅迫下植株部分機能受損。

圖2 CS-vs-TS差異火山圖Figure 2 CS-vs-TS difference volcano map

圖3 金絲草耐Pb差異基因（DEGs）表達量熱圖Figure 3 Heat map of the expression of some Pb-tolerant DEGs in the leaves of P.crinitum

2.4 差異表達基因的GO富集

將差異表達基因與GO數(shù)據(jù)庫比對進行注釋與富集分析，進一步了解Pb脅迫下DEGs的功能。共有1 032條DEGs富集在GO數(shù)據(jù)庫，這些基因所富集的GO條目可分為生物學過程（Biological process）、細胞組分（Cellular componet）和分子功能（Molecular function）3大類（圖4）。在生物學過程方面，代謝過程（Metabolic process）、細胞過程（Cellular process）和單一有機物過程（Single-organism process）占主要部分，分別占30.52%、24.32%和20.93%。在細胞組分中，差異表達基因主要富集在細胞（Cell）以及細胞組成（Cell part）部分，均占富集在GO數(shù)據(jù)庫總DEGs的18.80%，其次為細胞器（Organelle）、膜（Membrane）。在分子功能方面，催化活性（Catalytic activity）富集的差異表達基因最多，占比27.71%，其次為連接（Binding），再次為轉(zhuǎn)運活動（Bransporter activity），其占比3.01%。這表明Pb脅迫下金絲草葉片可通過代謝、催化各類酶活性和轉(zhuǎn)運蛋白等方式適應(yīng)重金屬毒害。共有143條DEGs富集在與抗氧化酶相關(guān)的36個GO條目上，包括“過氧化物酶體”“氧化還原酶活性”“分子內(nèi)氧化還原酶活性”“氧化活性”“過氧化物酶活性”“二硫氧化還原酶活性”“活性氧代謝過程”“過氧化氫代謝過程”“氧化還原輔酶代謝過程”“超氧化物代謝過程”“氧化還原工藝”“對活性氧的響應(yīng)”和“對氧化應(yīng)激的反應(yīng)”等（表4），其中有82條DEGs顯著富集在GO功能中（P＜0.05），如“過氧化物酶體”“氧化還原酶活性”“氧化還原酶活性，作用于CH-OH供體組”“氧化還原酶活性，作用于其他含氮化合物作為供體，鐵硫蛋白作為受體”“活性氧代謝過程”和“過氧化氫代謝過程”。

表4 抗氧化酶相關(guān)基因的GO分析Table 4 GO analysis of antioxidant enzyme-related genes

圖4 Pb脅迫下金絲草葉片差異表達基因的GO富集分類圖Figure 4 GO enrichment classification map of differentially expressed genes in the leaves of P.crinitum under Pb stress

2.5 差異表達基因的KEGG富集

將DEGs與KEGG數(shù)據(jù)庫比對進行功能注釋與通路富集分析，共有476條DEGs被注釋到121條KEGG通路上，其中25條通路被顯著富集（P＜0.05）。如圖5富集散點圖所示，在“核糖體（Ribosome）”通路上的63條DEGs富集最為顯著（P＜0.05），占所有注釋到KEGG通路DEGs的13.24%。在“代謝通路（Metabolic pathways）”上參與的DEGs最多，共有225個，占比47.27%，其中主要富集在“碳代謝（Carbon metabolism）”“苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）”通路；其次為“次生代謝物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）”通路，占比31.51%，說明Pb脅迫下，葉片的代謝系統(tǒng)具有重要作用，體內(nèi)碳代謝、苯丙氨酸代謝等均有明顯變化。DEGs在“苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）”“苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）”“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis）”和“過氧化物酶體（Peroxisome）”等抗氧化酶相關(guān)的通路上顯著富集（P＜0.05），共占比12.18%，金絲草葉片可能通過這些通路參與抗氧化過程，去除活性氧抵御Pb毒害。除此之外，還有一些DEGs被注釋到與抗氧化酶相關(guān)的“谷胱甘肽代謝（Glutathione metabolism）”“抗壞血酸和醛糖代謝（Ascorbate and aldarate metabolism）”“植物激素信號轉(zhuǎn)導（Plant hormone signal transduction）”“黃酮類生物合成（Flavonoid biosynthesis）”和“MAPK信號通路-植物（MAPK signaling pathway-plant）”等通路上。

圖5 Pb脅迫下部分金絲草葉片差異基因的KEGG分析Figure 5 KEGG analysis of partial DEGs in leaves of P.crinitum under Pb stress

2.6 抗氧化酶相關(guān)基因的篩選與熒光定量驗證

結(jié)合DEGs的表達及功能注釋結(jié)果，從富集顯著（P＜0.05）并與抗氧化酶相關(guān)的GO條目與KEGG通路中篩選出差異顯著的與抗氧化酶相關(guān)的上調(diào)DEGs，如圖6所示（其引物見表2），共有PcCAT（Unigene0029007）、PcSOD（Unigene0041749）和PcPOD（Unigene0069373）3個候選基因。PcCAT、PcSOD參與“過氧化物酶體（Peroxisome）”通路，作用于抗氧化酶系統(tǒng)中的過氧化氫代謝，屬于過氧化物酶體靶向信號（PTS1 type），表示金絲草葉片受到Pb脅迫后，可能通過過氧化物酶體產(chǎn)生信號，促進抗氧化酶相關(guān)基因表達，恢復細胞穩(wěn)態(tài)。PcPOD參與“苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）”通路，上、下游分別為酚類醇類、木質(zhì)素類，表明金絲草葉片該候選基因可能參與了香豆醇（p-Coumaroyl alcohol）、松柏醇（Coniferyl alcohol）和芥子醇（Sinapyl alcohol）轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素（Lignin）的過程，從而響應(yīng)Pb脅迫環(huán)境。

圖6 候選基因代謝通路富集圖Figure 6 Enrichment map of candidate gene metabolic pathways

為了驗證金絲草葉片轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果以及與抗氧化酶相關(guān)的候選基因，本試驗對篩選出的3個Pb脅迫下與葉片抗氧化酶相關(guān)的DEGs（PcSOD、PcCAT和PcPOD）進行表達量分析。如圖7所示，Pb1000處理下，基因PcSOD的相對表達量低于Pb500處理，除此之外，金絲草葉片過氧化物酶相關(guān)基因PcSOD的相對表達量隨著Pb脅迫濃度的增加呈線性上升的趨勢。隨著Pb脅迫濃度的增加，抗氧化酶相關(guān)基因PcCAT與PcPOD的相對表達量均顯著上調(diào)，且Pb2000處理下相對表達量達到最大。不同處理下各DEGs的相對表達量均顯著大于CK處理，這與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致，表明本試驗中轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果真實準確。

圖7 抗氧化酶相關(guān)基因PcSOD、PcCAT和PcPOD的相對表達量Figure 7 The relative expression of antioxidant enzyme-related genes PcSOD，PcCAT and PcPOD

3 討論

Pb脅迫影響植物正常生長，刺激植物產(chǎn)生活性氧（ROS），積累過剩的ROS會造成植株體內(nèi)氧化損傷，MDA含量增加，甚至會造成細胞死亡[21]，植物對Pb毒害的主要防衛(wèi)方式為提高植物抗氧化性[22]。有研究表明，在一定的Pb脅迫范圍內(nèi)，玉蟬花（Iris ensataThunb.）葉片SOD、POD酶活性隨著Pb濃度的增加而增加，且在Pb濃度為800 mg·L-1時達到峰值，通過此種抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)方式使玉蟬花適應(yīng)Pb脅迫[23]。本研究中，隨Pb脅迫濃度的增加金絲草葉片抗氧化酶（POD、SOD和CAT）活性總體呈上升趨勢。這可能是因為Pb脅迫激活了金絲草葉片抗氧化酶活性，通過提高SOD、POD和CAT酶活性來清除植株體內(nèi)過多的ROS，提高植物抗氧化性，從而提高其耐Pb性，與MA?ECKA等[24]對芥菜的研究結(jié)果以及HELAOUI等[25]對紫花苜蓿的研究結(jié)果類似。MDA是植物膜脂化的產(chǎn)物之一，同時也反映了植株膜脂化程度[26]。本研究中，在一定范圍內(nèi)，金絲草葉片MDA含量隨著Pb濃度的增加而增加，說明Pb脅迫對金絲草葉片造成了膜脂化損傷，刺激了抗氧化系統(tǒng)，且隨著濃度的增加該傷害程度增大。在Pb濃度為2 000 mg·L-1時，MDA含量顯著低于其他處理，可能是因為高濃度Pb脅迫對金絲草葉片的過氧化傷害嚴重且達到不可逆轉(zhuǎn)的程度，造成了細胞死亡；也可能是因為此時葉片中抗氧化酶清除了過量的活性氧，抗氧化抵御系統(tǒng)降低了膜脂化程度，從而提高植物耐性，與吳桂容等[27]及CEDENO等[28]的研究結(jié)果相似，使得超富集植物金絲草可在20 000 mg·kg-1的Pb脅迫環(huán)境下正常生長[10]。

目前，對金絲草分子生物學方面的研究較少，且在NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有公開的關(guān)于金絲草基因組及轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)。本研究通過RNA-seq測序技術(shù)對Pb脅迫和對照組的金絲草葉片進行測序，利用DESeq2軟件以表達量為依據(jù)，篩選出與金絲草葉片抗氧化酶相關(guān)的候選DEGs。將得到DEGs與GO數(shù)據(jù)庫比對并進行富集，發(fā)現(xiàn)DEGs最顯著富集的GO條目為代謝過程，其次為催化活性。這可能是因為植物響應(yīng)外界刺激的主要方式之一為代謝物調(diào)控，通過代謝或生成次級代謝產(chǎn)物來抵御非生物脅迫[29]。Pb處理與CK處理的小麥幼苗的DEGs主要富集于免疫系統(tǒng)過程和代謝過程等，在分子功能方面主要富集于催化活性等[30]，這可能是因為植物通過催化抗氧化酶活性來適應(yīng)環(huán)境壓力，與本研究結(jié)果一致。本研究中金絲草葉片的DEGs在“氧化還原酶活性”“活性氧代謝過程”和“過氧化氫代謝過程”等GO條目中顯著富集，這是因為植物在非生物脅迫下會產(chǎn)生大量ROS，清除過量的ROS是植物適應(yīng)脅迫毒害的主要方式，該反應(yīng)最關(guān)鍵、最主要的影響因子是抗氧化相關(guān)酶[31]。除此之外，DEGs還在“氧化還原酶活性，作用于CH-OH供體組”上顯著富集，這可能是因為CH-OH作為常見的ROS，更容易獲取氫原子而引起氧化鏈式循環(huán)反應(yīng)，造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等多種損傷，加劇脅迫毒害[32]，因此抗氧化酶相關(guān)基因更集中作用在CH-OH供體組。本研究中，通過與KEGG通路數(shù)據(jù)庫比對并進行富集，發(fā)現(xiàn)CK處理與重金屬Pb脅迫處理的金絲草葉片DEGs主要富集在代謝通路和次代謝的生物合成等代謝途徑。這可能是因為非生物脅迫下，植物通過次生代謝物的生成，如細胞色素[33]等基因表達量上調(diào)，促進抗氧化酶活性提高，從而增加植物抗逆性[34]。Pb脅迫下，金絲草葉片DEGs在“苯丙氨酸代謝”“苯丙烷生物合成”和“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”等抗氧化酶相關(guān)的通路上顯著富集，這是因為黃酮、木質(zhì)素等酚類化合物作為苯丙烷代謝的產(chǎn)物主要作用于清除植物體內(nèi)多余ROS、提高植物抗氧化[35]，而苯丙氨酸作為主要的氨化酶參與該代謝過程[36]，因此金絲草葉片通過基因調(diào)控促進苯丙烷生物合成，提高自身耐性來適應(yīng)Pb脅迫。本研究中葉片DEGs還顯著富集在“過氧化物酶體”通路上，這是因為Pb脅迫下植物體內(nèi)過氧化物酶體會產(chǎn)生逆向信號響應(yīng)脅迫[37]，同時過氧化物酶體也是產(chǎn)生與調(diào)節(jié)ROS的重要細胞器之一[32]。

本研究中篩選出的PcCAT、PcSOD抗氧化酶基因在“過氧化物酶體”通路上，作用于抗氧化系統(tǒng)中的PTS1信號，且均為上調(diào)表達。過氧化物酶體作為響應(yīng)非生物脅迫的重要細胞器自身無法生成相關(guān)酶，需要靶向信號（PTS）指引酶分子前體進入過氧化物酶體中[38]。Pb脅迫可能刺激金絲草葉片中過氧化物酶體產(chǎn)生PTS1，推動核糖體定向運輸?shù)竭^氧化物酶體中，促進PcCAT、PcSOD上調(diào)表達合成抗氧化酶，清除脅迫下金絲草葉片PcPOD在“苯丙烷生物合成”通路上調(diào)表達，這可能是因為PcPOD是木質(zhì)素合成途徑中的上游基因，Pb脅迫下葉片中該基因的上調(diào)表達促進了酚類醇（香豆醇、松柏醇和芥子醇）向木質(zhì)素轉(zhuǎn)化。木質(zhì)素作為細胞壁的重要組分，其含量的增加意味著金絲草葉片通過抑制ROS產(chǎn)生[39]和增加細胞壁的強度[40]來提高植株對Pb脅迫的抗性，本研究結(jié)果與LU等[41]發(fā)現(xiàn)沙梨[Pyrus pyrifolia（Burm.f.）Nakai]通過抗氧化相關(guān)基因調(diào)控木質(zhì)素代謝物質(zhì)生成從而適應(yīng)非生物脅迫一致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨Pb脅迫濃度的增加，抗氧化酶相關(guān)基因PcSOD、PcCAT和PcPOD的相對表達量呈逐漸上升趨勢，這與研究發(fā)現(xiàn)隨Pb濃度的增加，金絲草葉片POD、SOD和CAT酶活性逐漸增加的趨勢基本一致，說明金絲草可能通過這些抗氧化酶相關(guān)基因調(diào)控植株酶活性使之適應(yīng)Pb脅迫環(huán)境。但在Pb1000處理下，PcSOD的表達量的變化與該活性變化不一致，這可能是在該處理下有其他相關(guān)基因參與了SOD酶的調(diào)控。李蘭[42]通過研究發(fā)現(xiàn)，Cr脅迫促進油菜（Brassica napusL.）葉片的SOD、POD和ZS758（與CAT相關(guān)）的相關(guān)基因表達上調(diào)，與對應(yīng)的酶活性變化趨勢一致。Cd脅迫下，小麥（Triticum aestivumL.）抗氧化系統(tǒng)起主要的解毒作用，植株體內(nèi)POD、SOD和CAT基因表達量與酶活性明顯增加[43]。ZHAO等[44]對商陸（Phytolacca americanaRoxb.）的研究發(fā)現(xiàn)錳（Mn）、銅（Cu）會誘導植株P(guān)OD等抗氧化相關(guān)酶基因表達，說明提高植物抗氧化能力是應(yīng)對重金屬脅迫的重要策略。此外，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序及注釋結(jié)果，金絲草抗氧化系統(tǒng)還受多種基因調(diào)控，后期應(yīng)持續(xù)深入研究。

4 結(jié)論

（1）Pb脅迫下金絲草可通過提高過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性，清除活性氧自由基，從而適應(yīng)Pb脅迫環(huán)境。

（2）Pb脅迫下，金絲草葉片差異基因主要集中在與代謝、催化活性相關(guān)的功能條目中，其中差異基因顯著富集在“氧化物酶體”“氧化還原酶活性”“氧化還原酶活性，作用于CH-OH供體組”“活性氧代謝過程”和“過氧化氫代謝過程”以及“苯丙氨酸代謝”“苯丙烷生物合成”“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”和“過氧化物酶體”等與抗氧化相關(guān)的GO條目與KEGG通路中。

（3）金絲草葉片抗氧化酶相關(guān)基因PcSOD、PcPOD和PcCAT的qPCR驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，不同濃度Pb脅迫下其相對表達量與抗氧化酶活性變化趨勢基本一致，說明這3個基因參與了金絲草應(yīng)對Pb脅迫的調(diào)控過程。