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      基于轉(zhuǎn)錄組測序金絲草葉片響應(yīng)鉛脅迫的抗氧化酶相關(guān)基因

      2022-11-04 09:43:24朱晨璐武欣怡喻君保黃偲祺曹樹一翟林韓雪潔侯曉龍
      關(guān)鍵詞:金絲過氧化物測序

      朱晨璐,武欣怡,喻君保,黃偲祺,曹樹一,翟林,韓雪潔,侯曉龍,2,3*

      (1.福建農(nóng)林大學林學院,福州 350002;2.南方紅壤區(qū)水土保持國家林業(yè)和草原局重點實驗室,福州 350002;3.海峽兩岸紅壤區(qū)水土保持協(xié)同創(chuàng)新中心,福州 350002)

      土壤重金屬污染是世界普遍關(guān)注的環(huán)境問題,土壤重金屬污染修復是目前研究的熱點[1]。植物修復克服了傳統(tǒng)物理和化學修復投資大、破壞土壤結(jié)構(gòu)并且容易造成二次污染等缺點,是一項經(jīng)濟、綠色、環(huán)保的修復技術(shù),受到普遍青睞[2]。近年來,有關(guān)學者在重金屬超富集植物的篩選、植物效果和耐性機理方面開展了較多研究[3-5],篩選出了一些針對不同重金屬的超富集植物,例如:砷(As)超富集植物蜈蚣草(Pteris VittaL.)[6]、2007年發(fā)現(xiàn)的鉻(Cr)超富集植物李氏禾(Leersia hexandraSw.)[7]、鎘(Cd)超富集植物東南景天(Sedum alfrediiHance)[8]等。但是,目前篩選出的超富集植物普遍具有生物量小、富集重金屬單一等問題,因此限制了植物修復技術(shù)的大范圍應(yīng)用[5]。植物對重金屬的轉(zhuǎn)運、耐受及富集能力是植物修復技術(shù)的關(guān)鍵,尋找超富集植物并探討其對重金屬脅迫的響應(yīng)機制,從而進一步提升植物修復效率,已受到學者們的廣泛關(guān)注[9]。研究表明一些超富集植物可通過形態(tài)的改變或生理的調(diào)控來適應(yīng)重金屬脅迫,但目前對植物適應(yīng)重金屬脅迫的內(nèi)在機制尚不清晰,特別是在分子生物學機制方面還有待進一步深入探索。

      金 絲 草[Pogonatherum crinitum(Thunb.)Kunth.]是一種重金屬鉛(Pb)的超富集植物,該植物能在Pb含量高達20 000 mg·kg-1的脅迫環(huán)境中正常生長,在重金屬礦區(qū)金絲草生物轉(zhuǎn)運系數(shù)可以達到10.18[10]。重金屬Pb脅迫下,金絲草可通過提高抗氧化酶活性[超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)]、提高滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)含量[脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(Cpr)]和調(diào)控抗壞血酸-谷胱甘肽(ASA-GSH)循環(huán)等策略來適應(yīng)Pb脅迫環(huán)境[11],特別是隨Pb脅迫濃度的增大,金絲草體內(nèi)抗氧化酶活性呈增加趨勢[12],說明抗氧化系統(tǒng)在抵御重金屬毒害中起重要作用,但對其分子生物學過程尚不清楚。目前,國內(nèi)外對植物響應(yīng)逆境脅迫的抗氧化酶相關(guān)基因已開展一些研究。邵文靜等[13]的研究發(fā)現(xiàn) 高 粱[Sorghum bicolor(L.)Moench]的SbSODs、Sb-PODs等基因在低溫脅迫下上調(diào)表達,這一發(fā)現(xiàn)為探討高粱耐低溫機制提供了參考;肖生鴻等[14]的研究發(fā)現(xiàn)低濃度的汞(Hg)會誘導POD3、CAT2等基因上調(diào),以此來降低重金屬的毒害。研究表明芥菜[Brassica juncea(L.)Czern.]幼苗通過提高與CAT、POD和SOD等酶相關(guān)基因的表達量,加強抗氧化系統(tǒng)抗逆性,從而響應(yīng)脅迫[15];ALARAIDH等[16]的研究發(fā)現(xiàn)在Pb、Cr和Cd脅迫下,葫蘆巴(Trigonella foenum-graecumL.)通過調(diào)控CAT、POD等酶的相關(guān)基因不同程度地表達來減弱重金屬對其的毒害作用;通過對苜蓿(Medicago sativaL.)的研究發(fā)現(xiàn),非生物脅迫環(huán)境可刺激抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)和SOD等相關(guān)酶的表達使之適應(yīng)脅迫環(huán)境[17]。但目前對金絲草耐Pb的分子機制尚未明確,對其響應(yīng)Pb脅迫的抗氧化酶相關(guān)基因及其作用機制尚不清晰。

      本研究以Pb超富集植物金絲草為研究對象,設(shè)計不同Pb濃度模擬脅迫試驗,比較不同Pb脅迫處理下金絲草抗氧化酶活性的差異,對Pb脅迫處理的金絲草葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序,篩選出與抗氧化酶活性相關(guān)的差異表達基因并進行qRT-PCR驗證,揭示與金絲草響應(yīng)Pb脅迫的抗氧化酶相關(guān)基因及其作用機理,為更深入揭示植物響應(yīng)Pb脅迫的內(nèi)在機理提供科學依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗材料

      供試的金絲草采用種子培養(yǎng),種子采自福建三明鉛鋅礦區(qū)。將種子均勻撒到溫室中的苗床上,保持土壤含水量為田間持水量的70%左右,待金絲草長至15 cm左右時開展脅迫試驗。

      1.2 試驗設(shè)計

      選擇長勢一致的金絲草幼苗,清洗干凈根系后,移栽到盛有1/8 Hoagland營養(yǎng)液的水培裝置中,并使用定植籃、定植棉固定,每盆移栽幼苗15株,在營養(yǎng)液中緩苗3 d后開始Pb脅迫試驗。設(shè)置不同濃度Pb處理,分別為300、500、1 000 mg·L-1和2 000 mg·L-1(分別用Pb300、Pb500、Pb1000和Pb2000表示),采用(CH3COOH)2Pb配制的60 mg·L-1的Pb溶液,按照設(shè)計的Pb脅迫濃度加入相應(yīng)Pb溶液于裝有營養(yǎng)液的培養(yǎng)裝置中,同時設(shè)置無Pb脅迫的對照試驗(CK)。營養(yǎng)液為1/8的Hoagland營養(yǎng)液,營養(yǎng)成分見表1,其中KH2PO4濃度由原配方的0.136 g·L-1減少為0.680 mg·L-1,以避免產(chǎn)生沉淀。用去離子水反復清洗金絲草根系后移入不同Pb濃度的脅迫液中,置于人工氣候培養(yǎng)箱中進行脅迫試驗,溫度為25℃,濕度為75%,光照強度為6 000 lx,晝夜光照時間為16 h/8 h,脅迫時間為7 d。選取新鮮金絲草葉片剪碎混勻裝入離心管,經(jīng)液氮速凍,置于-80℃冰箱備用。CK、Pb300、Pb500、Pb1000和Pb2000處理的樣品用于抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量測定、RNA提取,并供熒光定量使用,每個處理各3次重復。同時選取CK、Pb1000處理的樣品用于RNA測序分析,每組3次重復。

      表1 Hoagland營養(yǎng)液組分Table 1 Components of Hoagland nutrient solution

      1.3 試驗方法

      1.3.1 抗氧化酶的測定

      制備酶液:稱取金絲草新鮮葉片0.2 g,使用液氮在研缽中研磨成勻漿后放入4 mL離心管,加入1 mL 0.05 mol·L-1pH 7.8的磷酸鹽緩沖液,定容至4 mL。利用渦旋儀混勻,放入冷凍高速離心機4℃、10 000 r·min-1下離心10 min,取上清液放入4℃冰箱備用。金絲草葉片SOD、CAT、POD活性和MDA含量分別采用氮藍四唑法、紫外吸收法、愈創(chuàng)木酚法和硫代巴比妥酸法測定[18]。

      1.3.2 RNA提取、測序和組裝

      新鮮植株使用TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA,利用超微量分光光度計檢測RNA濃度及純度(濃度需大于50 ng·μL-1,OD值在1.8~2.0之間,保證RNA純度)。配制1%的瓊脂糖膠,將RNA樣品加入進樣口,電泳約20 min,將膠放置在全自動凝膠成像儀上觀察樣品的完整度及是否存在DNA污染跑膠。得到的RNA經(jīng)質(zhì)檢后建立文庫,使用Illumina HiSeq 4000測序平臺測序,將最終得到的clean reads利用組裝軟件Trinity[19]進行組裝并評估。用RSEM軟件對組裝出來的unigene定量。

      1.3.3 差異基因分析

      將基因表達水平中的reads count數(shù)據(jù),使用DESeq2[20]軟件進行分析,得到差異基因。FDR(錯誤發(fā)現(xiàn)率)<0.05且| |log2FC>1的基因為顯著差異基因,將顯著差異的Unigene向GO數(shù)據(jù)庫的各條目映射進行功能分析,同時將Unigene與KEGG數(shù)據(jù)庫比對確定基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。結(jié)合兩種富集分析結(jié)果,篩選需要的差異基因。

      1.3.4 反轉(zhuǎn)錄與熒光定量

      使用全式金公司生產(chǎn)的Uni All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用NCBI中premier designing tools設(shè)計篩選出的與金絲草葉片抗氧化酶相關(guān)的耐Pb基因?qū)χ亟饘貾b脅迫響應(yīng)的引物,如表2所示。

      表2 候選基因名稱及定量引物序列Table 2 Candidate gene names and primer sequences used in qRT-PCR

      使用福州都拜特生物技術(shù)有限公司的QuanStu-dio3 System熒光定量PCR儀,反應(yīng)體系為:上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,cDNA 1 μL,2×PerfectStart Green qPCR SuperMix 10 μL,Nuclease-free Water 8.2 μL,共20 μL。反應(yīng)過程為94℃30 s,94℃5 s,60℃30 s,共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3個生物學重復,每個生物學重復設(shè)3個技術(shù)重復,使用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

      1.4 數(shù)據(jù)處理

      使用SPSS 25軟件,采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)和Tukey's post-hoc檢驗對試驗數(shù)據(jù)進行多重比較。抗氧化酶活性與分子生物學指標均做3次重復試驗,試驗結(jié)果用平均值±標準差表示。采用Origin 2017軟件繪圖。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 Pb脅迫對金絲草葉片抗氧化酶活性的影響

      不同Pb脅迫濃度下,金絲草葉片抗氧化酶活性的變化如圖1所示。隨著Pb濃度的增加,金絲草葉片POD酶活性呈上升趨勢,Pb1000、Pb2000處理下的POD酶活性顯著大于CK及其他處理(P<0.05),分別比CK處理提高10.16%、10.27%。Pb脅迫下,金絲草葉片CAT酶活性隨Pb濃度的增加而增加,且Pb2000、Pb1000及Pb500處理下的酶活性顯著大于CK處理(P<0.05),分別是CK處理的2.14、1.90倍和1.82倍。葉片SOD酶活性則是隨著Pb濃度的增加呈逐漸上升的變化規(guī)律,且Pb1000、Pb2000處理的酶活性顯著大于CK處理(P<0.05),相較于Pb1000處理,Pb2000處理下的SOD酶活性提高了18.54%,二者差異顯著(P<0.05)。隨著Pb濃度增加,金絲草葉片MDA含量總體呈上升趨勢,與CK處理相比,Pb500、Pb1000處理下的MDA含量分別提高了0.57、1.30倍,差異顯著(P<0.05),但Pb2000處理下的MDA含量顯著低于其他處理(P<0.05)。由此可見,金絲草葉片可能通過抗氧化酶響應(yīng)及MDA含量的變化來適應(yīng)Pb脅迫,不同抗氧化酶通過不同響應(yīng)方式提高植物耐性,減少Pb脅迫對植株的毒害。

      圖1 不同Pb脅迫濃度對金絲草葉片抗氧化酶活性和MDA含量的影響Figure 1 Effects of different Pb stress concentrations on antioxidant enzyme activities and MDA content in the leaves of P.crinitum

      2.2 測序結(jié)果

      由于Pb濃度為1 000 mg·L-1處理的金絲草葉片抗氧化酶活性變化顯著,故選擇對照(CS)處理與1 000 mg·L-1Pb脅迫(TS)處理的金絲草葉片樣品進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序,每組3個重復,共6個樣品,測序結(jié)果如表3所示。兩組樣品經(jīng)組裝、過濾后得到總堿基數(shù)共56.34 Gb,GC比例為57.37%~58.06%,堿基組成平衡。各樣品堿基質(zhì)量值達到Q20以上水平的堿基數(shù)目占比均大于95%,達到Q30以上的堿基數(shù)目占比均大于90%,說明各樣品測序質(zhì)量高,達到建庫要求。

      表3 金絲草葉片轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析Table 3 Analysis of transcriptome sequencing data of P.crinitum

      2.3 差異基因表達

      通過Deseq2軟件分析TS與CS處理金絲草葉片的差異表達基因,基于差異分析結(jié)果篩選FDR<0.05且|log2FC|>1的基因為顯著差異基因(圖2)。分析發(fā)現(xiàn)TS與CS處理金絲草的葉片Unigenes共有3 282個差異基因(DEGs),其中有1 626個上調(diào)基因和1 656個下調(diào)基因。由圖3可知,金絲草耐Pb相關(guān)基因在CS與TS處理下差異顯著。與CS處理組相比,TS處理組與抗氧化酶相關(guān)的基因(POD、CAT、SOD、GSH、Unigene0049346、Unigene0015966、Unigene0002954、Unigene0032786和Unigene0041749等)表達上調(diào),與Pb脅迫下金絲草葉片抗氧化酶活性變化趨勢一致。除此之外,金屬硫蛋白(MTs)、蛋白激酶(Kinase)、類甜蛋白(Thaumatin-like protein)、BOX、ZIP、NAC轉(zhuǎn)運蛋白、ABC轉(zhuǎn)運蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等均為上調(diào)表達,這些可能也與提高植物抗逆性來適應(yīng)Pb脅迫有關(guān);葉綠體多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,chloroplastic)、蛋白質(zhì)線粒體(Protein mitochondrial)和組織蛋白酶(Cathepsin)等則為下調(diào)表達,這類基因與植株機能代謝有關(guān),說明Pb脅迫下植株部分機能受損。

      圖2 CS-vs-TS差異火山圖Figure 2 CS-vs-TS difference volcano map

      圖3 金絲草耐Pb差異基因(DEGs)表達量熱圖Figure 3 Heat map of the expression of some Pb-tolerant DEGs in the leaves of P.crinitum

      2.4 差異表達基因的GO富集

      將差異表達基因與GO數(shù)據(jù)庫比對進行注釋與富集分析,進一步了解Pb脅迫下DEGs的功能。共有1 032條DEGs富集在GO數(shù)據(jù)庫,這些基因所富集的GO條目可分為生物學過程(Biological process)、細胞組分(Cellular componet)和分子功能(Molecular function)3大類(圖4)。在生物學過程方面,代謝過程(Metabolic process)、細胞過程(Cellular process)和單一有機物過程(Single-organism process)占主要部分,分別占30.52%、24.32%和20.93%。在細胞組分中,差異表達基因主要富集在細胞(Cell)以及細胞組成(Cell part)部分,均占富集在GO數(shù)據(jù)庫總DEGs的18.80%,其次為細胞器(Organelle)、膜(Membrane)。在分子功能方面,催化活性(Catalytic activity)富集的差異表達基因最多,占比27.71%,其次為連接(Binding),再次為轉(zhuǎn)運活動(Bransporter activity),其占比3.01%。這表明Pb脅迫下金絲草葉片可通過代謝、催化各類酶活性和轉(zhuǎn)運蛋白等方式適應(yīng)重金屬毒害。共有143條DEGs富集在與抗氧化酶相關(guān)的36個GO條目上,包括“過氧化物酶體”“氧化還原酶活性”“分子內(nèi)氧化還原酶活性”“氧化活性”“過氧化物酶活性”“二硫氧化還原酶活性”“活性氧代謝過程”“過氧化氫代謝過程”“氧化還原輔酶代謝過程”“超氧化物代謝過程”“氧化還原工藝”“對活性氧的響應(yīng)”和“對氧化應(yīng)激的反應(yīng)”等(表4),其中有82條DEGs顯著富集在GO功能中(P<0.05),如“過氧化物酶體”“氧化還原酶活性”“氧化還原酶活性,作用于CH-OH供體組”“氧化還原酶活性,作用于其他含氮化合物作為供體,鐵硫蛋白作為受體”“活性氧代謝過程”和“過氧化氫代謝過程”。

      表4 抗氧化酶相關(guān)基因的GO分析Table 4 GO analysis of antioxidant enzyme-related genes

      圖4 Pb脅迫下金絲草葉片差異表達基因的GO富集分類圖Figure 4 GO enrichment classification map of differentially expressed genes in the leaves of P.crinitum under Pb stress

      2.5 差異表達基因的KEGG富集

      將DEGs與KEGG數(shù)據(jù)庫比對進行功能注釋與通路富集分析,共有476條DEGs被注釋到121條KEGG通路上,其中25條通路被顯著富集(P<0.05)。如圖5富集散點圖所示,在“核糖體(Ribosome)”通路上的63條DEGs富集最為顯著(P<0.05),占所有注釋到KEGG通路DEGs的13.24%。在“代謝通路(Metabolic pathways)”上參與的DEGs最多,共有225個,占比47.27%,其中主要富集在“碳代謝(Carbon metabolism)”“苯丙氨酸代謝(Phenylalanine metabolism)”通路;其次為“次生代謝物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)”通路,占比31.51%,說明Pb脅迫下,葉片的代謝系統(tǒng)具有重要作用,體內(nèi)碳代謝、苯丙氨酸代謝等均有明顯變化。DEGs在“苯丙氨酸代謝(Phenylalanine metabolism)”“苯丙烷生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)”“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis)”和“過氧化物酶體(Peroxisome)”等抗氧化酶相關(guān)的通路上顯著富集(P<0.05),共占比12.18%,金絲草葉片可能通過這些通路參與抗氧化過程,去除活性氧抵御Pb毒害。除此之外,還有一些DEGs被注釋到與抗氧化酶相關(guān)的“谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)”“抗壞血酸和醛糖代謝(Ascorbate and aldarate metabolism)”“植物激素信號轉(zhuǎn)導(Plant hormone signal transduction)”“黃酮類生物合成(Flavonoid biosynthesis)”和“MAPK信號通路-植物(MAPK signaling pathway-plant)”等通路上。

      圖5 Pb脅迫下部分金絲草葉片差異基因的KEGG分析Figure 5 KEGG analysis of partial DEGs in leaves of P.crinitum under Pb stress

      2.6 抗氧化酶相關(guān)基因的篩選與熒光定量驗證

      結(jié)合DEGs的表達及功能注釋結(jié)果,從富集顯著(P<0.05)并與抗氧化酶相關(guān)的GO條目與KEGG通路中篩選出差異顯著的與抗氧化酶相關(guān)的上調(diào)DEGs,如圖6所示(其引物見表2),共有PcCAT(Unigene0029007)、PcSOD(Unigene0041749)和PcPOD(Unigene0069373)3個候選基因。PcCAT、PcSOD參與“過氧化物酶體(Peroxisome)”通路,作用于抗氧化酶系統(tǒng)中的過氧化氫代謝,屬于過氧化物酶體靶向信號(PTS1 type),表示金絲草葉片受到Pb脅迫后,可能通過過氧化物酶體產(chǎn)生信號,促進抗氧化酶相關(guān)基因表達,恢復細胞穩(wěn)態(tài)。PcPOD參與“苯丙烷生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)”通路,上、下游分別為酚類醇類、木質(zhì)素類,表明金絲草葉片該候選基因可能參與了香豆醇(p-Coumaroyl alcohol)、松柏醇(Coniferyl alcohol)和芥子醇(Sinapyl alcohol)轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素(Lignin)的過程,從而響應(yīng)Pb脅迫環(huán)境。

      圖6 候選基因代謝通路富集圖Figure 6 Enrichment map of candidate gene metabolic pathways

      為了驗證金絲草葉片轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果以及與抗氧化酶相關(guān)的候選基因,本試驗對篩選出的3個Pb脅迫下與葉片抗氧化酶相關(guān)的DEGs(PcSOD、PcCAT和PcPOD)進行表達量分析。如圖7所示,Pb1000處理下,基因PcSOD的相對表達量低于Pb500處理,除此之外,金絲草葉片過氧化物酶相關(guān)基因PcSOD的相對表達量隨著Pb脅迫濃度的增加呈線性上升的趨勢。隨著Pb脅迫濃度的增加,抗氧化酶相關(guān)基因PcCAT與PcPOD的相對表達量均顯著上調(diào),且Pb2000處理下相對表達量達到最大。不同處理下各DEGs的相對表達量均顯著大于CK處理,這與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致,表明本試驗中轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果真實準確。

      圖7 抗氧化酶相關(guān)基因PcSOD、PcCAT和PcPOD的相對表達量Figure 7 The relative expression of antioxidant enzyme-related genes PcSOD,PcCAT and PcPOD

      3 討論

      Pb脅迫影響植物正常生長,刺激植物產(chǎn)生活性氧(ROS),積累過剩的ROS會造成植株體內(nèi)氧化損傷,MDA含量增加,甚至會造成細胞死亡[21],植物對Pb毒害的主要防衛(wèi)方式為提高植物抗氧化性[22]。有研究表明,在一定的Pb脅迫范圍內(nèi),玉蟬花(Iris ensataThunb.)葉片SOD、POD酶活性隨著Pb濃度的增加而增加,且在Pb濃度為800 mg·L-1時達到峰值,通過此種抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)方式使玉蟬花適應(yīng)Pb脅迫[23]。本研究中,隨Pb脅迫濃度的增加金絲草葉片抗氧化酶(POD、SOD和CAT)活性總體呈上升趨勢。這可能是因為Pb脅迫激活了金絲草葉片抗氧化酶活性,通過提高SOD、POD和CAT酶活性來清除植株體內(nèi)過多的ROS,提高植物抗氧化性,從而提高其耐Pb性,與MA?ECKA等[24]對芥菜的研究結(jié)果以及HELAOUI等[25]對紫花苜蓿的研究結(jié)果類似。MDA是植物膜脂化的產(chǎn)物之一,同時也反映了植株膜脂化程度[26]。本研究中,在一定范圍內(nèi),金絲草葉片MDA含量隨著Pb濃度的增加而增加,說明Pb脅迫對金絲草葉片造成了膜脂化損傷,刺激了抗氧化系統(tǒng),且隨著濃度的增加該傷害程度增大。在Pb濃度為2 000 mg·L-1時,MDA含量顯著低于其他處理,可能是因為高濃度Pb脅迫對金絲草葉片的過氧化傷害嚴重且達到不可逆轉(zhuǎn)的程度,造成了細胞死亡;也可能是因為此時葉片中抗氧化酶清除了過量的活性氧,抗氧化抵御系統(tǒng)降低了膜脂化程度,從而提高植物耐性,與吳桂容等[27]及CEDENO等[28]的研究結(jié)果相似,使得超富集植物金絲草可在20 000 mg·kg-1的Pb脅迫環(huán)境下正常生長[10]。

      目前,對金絲草分子生物學方面的研究較少,且在NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有公開的關(guān)于金絲草基因組及轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)。本研究通過RNA-seq測序技術(shù)對Pb脅迫和對照組的金絲草葉片進行測序,利用DESeq2軟件以表達量為依據(jù),篩選出與金絲草葉片抗氧化酶相關(guān)的候選DEGs。將得到DEGs與GO數(shù)據(jù)庫比對并進行富集,發(fā)現(xiàn)DEGs最顯著富集的GO條目為代謝過程,其次為催化活性。這可能是因為植物響應(yīng)外界刺激的主要方式之一為代謝物調(diào)控,通過代謝或生成次級代謝產(chǎn)物來抵御非生物脅迫[29]。Pb處理與CK處理的小麥幼苗的DEGs主要富集于免疫系統(tǒng)過程和代謝過程等,在分子功能方面主要富集于催化活性等[30],這可能是因為植物通過催化抗氧化酶活性來適應(yīng)環(huán)境壓力,與本研究結(jié)果一致。本研究中金絲草葉片的DEGs在“氧化還原酶活性”“活性氧代謝過程”和“過氧化氫代謝過程”等GO條目中顯著富集,這是因為植物在非生物脅迫下會產(chǎn)生大量ROS,清除過量的ROS是植物適應(yīng)脅迫毒害的主要方式,該反應(yīng)最關(guān)鍵、最主要的影響因子是抗氧化相關(guān)酶[31]。除此之外,DEGs還在“氧化還原酶活性,作用于CH-OH供體組”上顯著富集,這可能是因為CH-OH作為常見的ROS,更容易獲取氫原子而引起氧化鏈式循環(huán)反應(yīng),造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等多種損傷,加劇脅迫毒害[32],因此抗氧化酶相關(guān)基因更集中作用在CH-OH供體組。本研究中,通過與KEGG通路數(shù)據(jù)庫比對并進行富集,發(fā)現(xiàn)CK處理與重金屬Pb脅迫處理的金絲草葉片DEGs主要富集在代謝通路和次代謝的生物合成等代謝途徑。這可能是因為非生物脅迫下,植物通過次生代謝物的生成,如細胞色素[33]等基因表達量上調(diào),促進抗氧化酶活性提高,從而增加植物抗逆性[34]。Pb脅迫下,金絲草葉片DEGs在“苯丙氨酸代謝”“苯丙烷生物合成”和“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”等抗氧化酶相關(guān)的通路上顯著富集,這是因為黃酮、木質(zhì)素等酚類化合物作為苯丙烷代謝的產(chǎn)物主要作用于清除植物體內(nèi)多余ROS、提高植物抗氧化[35],而苯丙氨酸作為主要的氨化酶參與該代謝過程[36],因此金絲草葉片通過基因調(diào)控促進苯丙烷生物合成,提高自身耐性來適應(yīng)Pb脅迫。本研究中葉片DEGs還顯著富集在“過氧化物酶體”通路上,這是因為Pb脅迫下植物體內(nèi)過氧化物酶體會產(chǎn)生逆向信號響應(yīng)脅迫[37],同時過氧化物酶體也是產(chǎn)生與調(diào)節(jié)ROS的重要細胞器之一[32]。

      本研究中篩選出的PcCAT、PcSOD抗氧化酶基因在“過氧化物酶體”通路上,作用于抗氧化系統(tǒng)中的PTS1信號,且均為上調(diào)表達。過氧化物酶體作為響應(yīng)非生物脅迫的重要細胞器自身無法生成相關(guān)酶,需要靶向信號(PTS)指引酶分子前體進入過氧化物酶體中[38]。Pb脅迫可能刺激金絲草葉片中過氧化物酶體產(chǎn)生PTS1,推動核糖體定向運輸?shù)竭^氧化物酶體中,促進PcCAT、PcSOD上調(diào)表達合成抗氧化酶,清除脅迫下金絲草葉片PcPOD在“苯丙烷生物合成”通路上調(diào)表達,這可能是因為PcPOD是木質(zhì)素合成途徑中的上游基因,Pb脅迫下葉片中該基因的上調(diào)表達促進了酚類醇(香豆醇、松柏醇和芥子醇)向木質(zhì)素轉(zhuǎn)化。木質(zhì)素作為細胞壁的重要組分,其含量的增加意味著金絲草葉片通過抑制ROS產(chǎn)生[39]和增加細胞壁的強度[40]來提高植株對Pb脅迫的抗性,本研究結(jié)果與LU等[41]發(fā)現(xiàn)沙梨[Pyrus pyrifolia(Burm.f.)Nakai]通過抗氧化相關(guān)基因調(diào)控木質(zhì)素代謝物質(zhì)生成從而適應(yīng)非生物脅迫一致。本研究發(fā)現(xiàn),隨Pb脅迫濃度的增加,抗氧化酶相關(guān)基因PcSOD、PcCAT和PcPOD的相對表達量呈逐漸上升趨勢,這與研究發(fā)現(xiàn)隨Pb濃度的增加,金絲草葉片POD、SOD和CAT酶活性逐漸增加的趨勢基本一致,說明金絲草可能通過這些抗氧化酶相關(guān)基因調(diào)控植株酶活性使之適應(yīng)Pb脅迫環(huán)境。但在Pb1000處理下,PcSOD的表達量的變化與該活性變化不一致,這可能是在該處理下有其他相關(guān)基因參與了SOD酶的調(diào)控。李蘭[42]通過研究發(fā)現(xiàn),Cr脅迫促進油菜(Brassica napusL.)葉片的SOD、POD和ZS758(與CAT相關(guān))的相關(guān)基因表達上調(diào),與對應(yīng)的酶活性變化趨勢一致。Cd脅迫下,小麥(Triticum aestivumL.)抗氧化系統(tǒng)起主要的解毒作用,植株體內(nèi)POD、SOD和CAT基因表達量與酶活性明顯增加[43]。ZHAO等[44]對商陸(Phytolacca americanaRoxb.)的研究發(fā)現(xiàn)錳(Mn)、銅(Cu)會誘導植株P(guān)OD等抗氧化相關(guān)酶基因表達,說明提高植物抗氧化能力是應(yīng)對重金屬脅迫的重要策略。此外,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序及注釋結(jié)果,金絲草抗氧化系統(tǒng)還受多種基因調(diào)控,后期應(yīng)持續(xù)深入研究。

      4 結(jié)論

      (1)Pb脅迫下金絲草可通過提高過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性,清除活性氧自由基,從而適應(yīng)Pb脅迫環(huán)境。

      (2)Pb脅迫下,金絲草葉片差異基因主要集中在與代謝、催化活性相關(guān)的功能條目中,其中差異基因顯著富集在“氧化物酶體”“氧化還原酶活性”“氧化還原酶活性,作用于CH-OH供體組”“活性氧代謝過程”和“過氧化氫代謝過程”以及“苯丙氨酸代謝”“苯丙烷生物合成”“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成”和“過氧化物酶體”等與抗氧化相關(guān)的GO條目與KEGG通路中。

      (3)金絲草葉片抗氧化酶相關(guān)基因PcSOD、PcPOD和PcCAT的qPCR驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致,不同濃度Pb脅迫下其相對表達量與抗氧化酶活性變化趨勢基本一致,說明這3個基因參與了金絲草應(yīng)對Pb脅迫的調(diào)控過程。

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