安中湯對肝胃不和型功能性消化不良大鼠胃腸功能的影響

嚴(yán)子興，林曉英，劉幼妹，王 雯，林振文，查曉晶，林蔚然

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州中醫(yī)院，福建 福州 350001；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院，福建 福州 350025）

目前功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）發(fā)病機(jī)制尚不明確，多認(rèn)為腦腸軸在其發(fā)病中起重要作用［1-3］，其中以 C 型鈉尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）-膜結(jié)合型鳥苷酸環(huán)化酶（particulate guanylyl cyclase，pGC）-環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）通路最為重要，已有研究證實CNP-pGC-cGMP 信號通路參與調(diào)控功能性消化不良大鼠胃腸功能［4-5］。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療FD 以質(zhì)子泵抑制劑、抗幽門螺桿菌治療及促胃動力為主，但療效欠佳，且容易反復(fù)發(fā)作，因此尋求更有效的治法勢在必行。中醫(yī)學(xué)從整體觀入手，對功能性疾病有較好的療效，在調(diào)節(jié)胃功能方面積累了豐富的理論和臨床經(jīng)驗。安中湯是福建省名老中醫(yī)唐江山治療消化道疾病的經(jīng)驗方，臨床具有一定療效，故本研究探討安中湯治療肝胃不和型FD 大鼠的療效及作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。因有多項研究表明多潘立酮治療FD 效果明顯，毒副作用較低，故采用多潘立酮治療作為陽性對照［6-7］。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物 安中湯組成：黨參15 g，白術(shù)9 g，茯苓 9 g，炙甘草5 g，柴胡6 g，白芍 9 g，枳實 6 g，沉香（后下）3 g，姜半夏5 g，陳皮5 g，百合15 g，烏藥10 g，煅瓦楞子15 g。由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，常規(guī)煎煮后將湯藥分裝為100 mL/袋，含生藥量濃度為1.12 g/mL；多潘立酮片（西安楊森制藥有限公司，規(guī)格：10 mg/片，產(chǎn)品批號：LKJ0277）10 mg 研成細(xì)粉以蒸餾水 10 mL 稀釋混勻，配制成1 mg/mL 混懸液，冰箱4 ℃保存。以上藥液臨用前恢復(fù)至室溫。

1.2 實驗動物 健康Wistar 雄性大鼠86 只，體質(zhì)量（280±20）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院動物中心，許可證號：SYXK（軍）2018-0003，飼養(yǎng)在室溫18～22 ℃，濕度40%～60%的環(huán)境中。普通飼料喂養(yǎng)（各成分熱量比例為：碳水化合物60%，蛋白質(zhì)22%，脂肪10%，包括纖維素在內(nèi)的其他成分8%），除實驗期外自由飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后進(jìn)行實驗。本實驗所有相關(guān)動物實驗操作都按照中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院動物倫理審查標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格進(jìn)行（審批號：2022-008）。

1.3 主要試劑 活性炭末半固體糊：在250 mL 蒸餾水中加入活性炭末2 g，羧甲基纖維素鈉10 g，糖8 g，淀粉8 g，奶粉16 g，攪拌均勻［8］，得到約300 mL黑色版固體糊，冰箱4 ℃保存，用時恢復(fù)至室溫；聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白定量試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司，貨號：ZJ101）；大鼠P 物質(zhì)（SP）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號：JM-01851R1）、大鼠胃促生長素（Gherlin）ELISA 試劑盒（貨號：JM-10778R1）、大鼠血管活性腸肽（VIP）ELISA 試劑盒（貨號：JM-01852R2）、大鼠5-羥色胺（5-HT）ELISA 試劑盒（貨號：JM-01849R1）均購自江蘇晶美生物科技有限公司；Harris 蘇木素（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZLI-9609）；中性樹膠（上海華靈康復(fù)器械廠，貨號：ZLI-9055）。

1.4 主要儀器 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）轉(zhuǎn)膜儀、Western blot 電泳儀均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技公司，Multiskan GO）；紫外分光光度計（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；高速離心機(jī)（Eppendorf AG）；超低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific）；恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯株式會社BX-53 光學(xué)顯微鏡）。

1.5 方法

1.5.1 造模 將86 只Wistar 大鼠先隨機(jī)選取23 只大鼠作為正常組，剩余大鼠采用郭氏夾尾刺激法［9］建立FD 大鼠模型，該造模方法在肝胃不和型FD 大鼠的制備實驗中應(yīng)用廣泛［10］。具體方法如下：使用卵圓鉗夾住大鼠尾巴中外1/3 處，每天進(jìn)行2 次，每天 9：00AM、15：00PM 各夾 1 次，每次夾 30 min，以使大鼠暴躁、反抗或相互攻擊、撕咬，盡量不使大鼠的尾部皮膚受到破損，連續(xù)造模7 d，造模期間所有大鼠均給予正常飲食及飲水。7 d 后，從正常組23 只大鼠中隨機(jī)選出3 只，從造模的63 只大鼠中隨機(jī)選出3 只，禁食不禁水1 d，結(jié)果觀察到造模組3 只大鼠出現(xiàn)明顯毛發(fā)雜亂、糞便稀溏、活動量減少、進(jìn)食量減少、緊張易激等肝胃不和表現(xiàn)。次日9：00AM 以10 mL/kg灌胃活性碳墨半固體糊，30 min后腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉處死，開腹取全胃并結(jié)扎賁門及幽門，取小腸并結(jié)扎幽門、回盲部，進(jìn)行胃排空和腸推進(jìn)率檢測，見表1。結(jié)果顯示造模組胃排空率及小腸推進(jìn)率均小于正常組，2 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）表示造模成功。

表1 2 組大鼠胃排空率與小腸推進(jìn)率比較（）

表1 2 組大鼠胃排空率與小腸推進(jìn)率比較（）

注：與正常組比較，1）P＜0.05。

小腸推進(jìn)率/%92.28±2.86 76.02±2.531）組別正常組造模組n3 3胃排空率/%74.52±5.44 49.45±6.051）

1.5.2 動物分組及給藥 造模成功后將造模組60只Wistar 大鼠隨機(jī)分為安中湯組、多潘立酮組、模型組各20 只。根據(jù)人與動物按體表面積折算公式計算，安中湯組予安中湯混懸液 9 mL/（kg·d）、多潘立酮組予多潘立酮混懸液2.7 mL/（kg·d）、模型組和正常組予10 mL/（kg·d）生理鹽水分別灌胃，以上液體灌胃時均恢復(fù)至室溫。4 組均在每日9：00—10：00 AM、15：00—16：00 PM 灌胃，共21 d。

1.5.3 指標(biāo)檢測

1.5.3.1 一般情況觀察 造模期間及藥物干預(yù)期間每日8：00AM、14：00PM 觀察各組大鼠毛發(fā)的顏色與光澤、大小便的性狀、每日的活動度及反應(yīng)。在適應(yīng)性喂養(yǎng)后、造模后，藥物干預(yù)第7、14、21 天的08：00AM 分別對4 組大鼠進(jìn)行稱體質(zhì)量，灌胃前將大鼠放置電子秤，并記錄每只大鼠體質(zhì)量，本實驗只對比灌胃前的體質(zhì)量變化。

1.5.3.2 血清VIP、Ghrelin、5-HT和SP含量檢測 藥物干預(yù)后，80 只大鼠禁食不禁水1 d，次日9：00AM給予活性碳末半固體糊2 mL 灌胃，30 min 后腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后立即開腹行腹主動脈采血5 mL，于乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）抗凝管靜置，低溫離心機(jī)以3 500 r/min 離心20 min，取血清后于標(biāo)本瓶分裝保存于-80 ℃液氮中，待檢測時將標(biāo)本盒取出，待溫至37 ℃，按照試劑盒步驟采用ELISA 法檢測上述指標(biāo)含量。

1.5.3.3 胃排空率、小腸推進(jìn)率檢測 腹主動脈采血后處死，取全胃并結(jié)扎賁門及幽門，取小腸并結(jié)扎幽門、回盲部，進(jìn)行胃排空和腸推進(jìn)率檢測。全胃取出，使用濾紙擦干胃表面水分之后對胃稱重為胃全重，然后從胃大彎處切開胃，用清水將胃部沖洗干凈，接著使用濾紙吸干胃內(nèi)外側(cè)表面水分對胃部進(jìn)行第二次稱重為胃凈重，后分別計算胃排空率、小腸推進(jìn)率，具體公式如下：‘

胃排空率＝1－［（胃全重－胃凈重）/活性炭末半固體糊］×100%

小腸推進(jìn)率＝L0/L×100%

注：L 為無張力狀態(tài)下從幽門至回盲部的長度；L0為無張力狀態(tài)下從幽門至炭末推進(jìn)最前沿的長度。

1.5.3.4 大鼠胃竇組織的Ghrelin、CNP 蛋白相對表達(dá)量檢測 采用Western blot 法檢測，取胃竇組織勻漿、裂解后，放入離心管中，4 ℃ 12 000 r/min 條件下離心15 min，取上清液進(jìn)行蛋白含量測定。根據(jù)蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，按照50∶1 的比例混合BCA Reagent 和Cu Reagent 配置工作溶液，在570 mm 的波長條件下對CD 值進(jìn)行檢測，根據(jù)測定結(jié)果繪制出CD 值與蛋白濃度之間的關(guān)系曲線，后進(jìn)行蛋白質(zhì)樣本變性。SDS-PAGE 凝膠電泳：將2 組蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜轉(zhuǎn)膜后，取PVDF 膜置于封閉液中1 h；根據(jù)目的蛋白的位置將PVDF 膜切成條狀，將試紙條置于蛋白質(zhì)抗稀釋溶液中并在4 ℃下孵育過夜，TBST 薄膜在室溫?fù)u洗3×10 min；按照目的蛋白的差異針對性地加入對應(yīng)的二抗，在室溫狀態(tài)下靜置1.5 h，TBST 薄膜在室溫?fù)u洗3×10 min；將塑料薄膜放入暗箱內(nèi)，底部可以通過注水實現(xiàn)薄膜的固定，將PVDF 薄膜靜置在薄膜內(nèi)，保證附著有蛋白質(zhì)的正面向上，把發(fā)光液試劑盒內(nèi)的2 種不同的液體按照1∶1 的比例進(jìn)行混合搖勻，并將其滴入薄膜后保證5 min 的反應(yīng)時間；注意使用塑料鑷子捏住PVDF 的一邊，在確保發(fā)光液順利流下之后，用保鮮膜蓋好，放入機(jī)器曝光和拍照，獲取目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5.3.5 胃竇黏膜組織病理學(xué)形態(tài)觀察 胃竇黏膜組織二甲苯Ⅰ、Ⅱ進(jìn)行脫蠟，準(zhǔn)備蓋玻片備用；用酒精進(jìn)行覆水處理，用自來水反復(fù)沖洗3 次；采用蘇木素染色，時長5 min；采用濃度為5%乙酸溶液進(jìn)行1 min 的分化處理后，用自來水進(jìn)行沖洗，在組織上滴入乙酸并置于載玻片之上；采用HE 染色，按染色狀態(tài)，適時采用流水進(jìn)行沖洗；脫水后晾干樣本后進(jìn)行封片，借助吸管吸一滴中性樹膠，壓片之后應(yīng)當(dāng)全覆蓋組織；最后用奧林巴斯BX-53 光學(xué)顯微鏡觀察胃竇黏膜組織病理學(xué)形態(tài)。

2 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量方差分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，采用最小顯著性差異法（LSD 法）。P＜0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況 與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)雜亂、糞便稀溏、活動量減少、緊張易激等表現(xiàn)，藥物干預(yù)組的大鼠一般情況較模型組有所改善；從各組大鼠實驗各階段體質(zhì)量變化可看出，安中湯組及多潘立酮組大鼠灌胃第7 天的體質(zhì)量增長幅度高于模型組大鼠（P均＜0.05），其數(shù)值及增長幅度接近正常組，安中湯組大鼠的體質(zhì)量增長幅度略高于多潘立酮組。見表2。

表2 4 組大鼠實驗各階段體質(zhì)量比較（） g

表2 4 組大鼠實驗各階段體質(zhì)量比較（） g

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

灌胃21天341.70±4.16 320.25±4.591）335.30±3.332）336.75±2.992）組別正常組模型組多潘立酮組安中湯組n 20 20 20 20適應(yīng)性喂養(yǎng)后300.65±3.13 301.75±4.21 302.70±4.67 302.65±2.70造模后320.40±3.25 312.45±4.571）313.25±4.471）313.80±2.841）灌胃第7天325.95±3.89 314.90±4.101）320.20±3.692）321.25±2.152）灌胃第14天333.05±4.03 318.00±4.411）327.15±3.122）328.45±2.042）

3.2 4 組大鼠血清 Ghrelin、VIP、SP、5-HT 水平比較 見表3。

表3 4 組大鼠血清Ghrelin、VIP、SP、5-HT 水平比較（） pg/mL

表3 4 組大鼠血清Ghrelin、VIP、SP、5-HT 水平比較（） pg/mL

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

5-HT 14.77±0.50 26.10±0.241）14.99±0.262）16.76±1.072）組別正常組模型組多潘立酮組安中湯組n 20 20 20 20 Gherlin（pg/mL）782.80±13.10 562.50±11.051）749.70±16.412）817.60±17.062）VIP 111.90±2.44 218.40±4.821）168.70±4.162）127.50±6.482）SP 3.13±0.15 5.40±0.151）3.85±0.132）3.21±0.112）

3.3 4組大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率比較 見表4。

表4 4 組大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率比較（）

表4 4 組大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率比較（）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

小腸推進(jìn)率/%94.04±0.41 77.82±1.201）89.21±0.582）89.16±0.402）組別正常組模型組多潘立酮組安中湯組n 20 20 20 20胃排空率/%76.34±1.29 49.49±1.041）74.31±0.922）71.79±0.542）

3.4 各組大鼠胃竇Ghrelin、CNP 蛋白相對表達(dá)量比較 與正常組比較，模型組大鼠胃竇組織中CNP 蛋白相對表達(dá)量明顯提高，Ghrelin 蛋白相對表達(dá)量明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，安中湯組與多潘立酮組大鼠胃竇組織中CNP蛋白相對表達(dá)量明顯降低，Ghrelin蛋白相對表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各組β-actin 蛋白相對表達(dá)量未發(fā)現(xiàn)明顯差異。見圖1、表5。

表5 4組大鼠胃竇組織CNP、Ghrelin蛋白相對表達(dá)量比較（）

表5 4組大鼠胃竇組織CNP、Ghrelin蛋白相對表達(dá)量比較（）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別正常組模型組多潘立酮組安中湯組Ghrelin 31 303.00±111.30 13 640.00±67.651）38 446.00±242.402）28 323.00±197.802）CNP 22 834.00±475.50 38 868.00±716.001）27 072.00±580.002）27 206.00±635.302）

圖1 Western blot檢測4組大鼠胃竇組織Ghrelin、CNP蛋白相對表達(dá)量

3.5 各組大鼠胃竇黏膜HE 染色組織病理學(xué)形態(tài)比較 正常組鏡下有少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞，腺體排列規(guī)則；模型組鏡下可見大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及少量嗜酸性粒細(xì)胞，腺體排列不規(guī)則，其余無明顯異常；多潘立酮組鏡下炎性細(xì)胞浸潤較模型組減輕，見少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及個別嗜酸性粒細(xì)胞，腺體排列尚規(guī)則，其余無明顯異常；安中湯組鏡下無明顯炎性細(xì)胞浸潤，腺體排列規(guī)則。見圖2。

圖2 4 組大鼠胃竇黏膜組織病理學(xué)形態(tài)HE 染色圖（×20）

4 討 論

胃腸道是一種由多個神經(jīng)系統(tǒng)所復(fù)合主導(dǎo)的器官系統(tǒng)，其中不僅僅有腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS），還包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）和植物神經(jīng)系統(tǒng)（autonomic nervous system，ANS）。腸神經(jīng)系統(tǒng)可通過內(nèi)臟敏感性反作用于中樞的痛覺、情緒和行為，其神經(jīng)系統(tǒng)間的傳導(dǎo)失常是導(dǎo)致FD 的重要機(jī)制［11］。有研究表明：調(diào)節(jié)相關(guān)腦腸肽水平可以糾正腦、腸內(nèi)分泌失調(diào)，改善FD 癥狀［12］。調(diào)節(jié)相關(guān)腦腸肽水平主要是通過CNP-pGC-cGMP 信號通路來實現(xiàn)的，CNP存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道中，是腦-腸軸中具備生物活性的多肽［1，13-16］，對縱向胃平滑肌有松弛作用［17］。在平滑肌中，CNP 與受體 NPR-B 特異性結(jié)合，激活 pGC［3，18］，從而致三磷酸鳥苷的環(huán)化，成為cGMP。cGMP 作為第二信使存在于人體之中，能夠使平滑肌產(chǎn)生舒張現(xiàn)象，促進(jìn)胃排空，最終影響胃腸道功能［19］。已有研究證實FD 大鼠胃腸功能的改變與 CNP-pGC-cGMP 信號通路的表達(dá)相關(guān)［4］。此前，已有諸多研究證實FD 的發(fā)病由多種腦腸肽共同參與，如5-HT、Ghrelin、VIP、SP 等。

本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清 Ghrelin 明顯降低，5-HT、VIP、SP 明顯升高。有報道指出，情緒可以影響腦腸軸的功能，其分泌功能的失調(diào)使5-HT 水平上升，導(dǎo)致胃腸道敏感性增加［20］。胃動力不足的 FD 患者其 Ghrelin 較正常水平顯著下降，這一結(jié)果可能與FD 患者進(jìn)食后胃排空障礙存在一定相關(guān)性。VIP 是一類對胃腸運(yùn)動有抑制，具有神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)雙重作用的神經(jīng)肽，在CNS、胃腸道中大量表達(dá)，具有抑制胃腸運(yùn)動及胃排空、減慢小腸運(yùn)動、降低消化系括約肌的緊張性、擴(kuò)血管、減少胃酸和GAS 分泌、促進(jìn)胰液分泌及抑制膽囊收縮等作用，表明FD 大鼠癥狀的發(fā)生與VIP 升高具有相關(guān)性［21］。目前已有研究證實，F(xiàn)D 模型組大鼠或者小鼠的VIP 含量通常會高于正常對照組［22］。研究表明通過降低SP 在血漿中的濃度能夠抑制背角神經(jīng)興奮，通過降低內(nèi)臟敏感度，使得FD 模型大鼠腸道過敏現(xiàn)象得到改善［23］。離體細(xì)胞實驗證明SP 能夠增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞對水和電解質(zhì)的通透性［24］。本研究結(jié)果還顯示：安中湯組胃排空率、小腸推進(jìn)率較模型組明顯改善，可知安中湯主要是通過改善大鼠的胃腸動力而起到明顯治療效果。且安中湯組較模型組胃竇CNP 蛋白的表達(dá)降低，CNP 對胃竇平滑肌具有明顯松弛作用，影響胃的收縮消化功能，安中湯可通過降低CNP 蛋白的表達(dá)促進(jìn)胃腸動力。安中湯組大鼠Ghrelin 蛋白較模型組顯著增高，Ghrelin 蛋白具有刺激FD 患者食欲、促進(jìn)進(jìn)食、參與胃酸分泌、改善胃腸動力等作用，可見安中湯的治療機(jī)制可能與以上胃腸激素水平變化相關(guān)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道可以通過腦腸軸實現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)，這種中樞和胃腸道雙向調(diào)節(jié)的形態(tài)在中醫(yī)中已有敘述，情志失調(diào)引起氣機(jī)紊亂，表現(xiàn)出臟器不能正常行使其功能，而久病和疼痛不適本身也是正氣衰弱、加劇情志不暢的因素。在治法上，注重肝主疏泄對情志的調(diào)暢尤為重要，肝木盛或中焦之土虧虛都易形成木克土的局面，加重肝胃不和的癥狀。說明疏肝和胃法在治療情志為發(fā)病重要因素的脾胃疾病中起重要作用，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)從腦腸軸水平整體調(diào)節(jié)胃腸道功能有共通之處。而本研究選用的安中湯是根據(jù)福建省名老中醫(yī)唐江山長期治療脾胃病的驗方，以六君子湯合百合湯、四磨湯、四逆散加減化裁而成，有平肝制酸、行氣止痛之效，護(hù)正祛邪，調(diào)和氣機(jī)，行氣而不耗氣。

綜上，安中湯可通過調(diào)節(jié)Ghrelin、VIP、SP、5-HT及CNP-pGC-cGMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動，促進(jìn)胃排空與腸道蠕動，改善FD 癥狀。