蘿卜硫素下調(diào)結(jié)直腸癌中eIF4F翻譯起始復(fù)合物的表達(dá)

邢 運(yùn)，周大臣，賀 良，崔 笑，喻宗繁

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是指結(jié)腸和直腸黏膜上皮和腺體發(fā)生的惡性腫瘤。2018年的全球癌癥統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，CRC總發(fā)病人數(shù)185萬，占比10.2%，居全球癌癥發(fā)病率第3位。死亡人數(shù)88.1萬(9.2%)，居第2位[1]。在細(xì)胞翻譯過程的起始階段，真核細(xì)胞啟動(dòng)因子4F(eIF4F)翻譯起始-復(fù)合物作為限速步驟發(fā)揮著重要作用[2]。蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)是一種異硫氰酸酯，天然存在于大多數(shù)十字花科蔬菜中。1992年首次從西蘭花中提取，并定義為II相解毒酶誘導(dǎo)劑[3]。SFN已被證實(shí)具有多種抗癌特性，特別是對(duì)CRC[4]。該研究從CRC患者組織標(biāo)本中檢測(cè)eIF4F翻譯起始復(fù)合物相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步探討SFN影響CRC細(xì)胞增殖的具體分子生物學(xué)機(jī)制，為SFN治療CRC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標(biāo)本 收集12例安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科CRC患者的組織標(biāo)本，分別收取腫瘤組織與癌旁組織，放入裝有RNA組織保存液的標(biāo)本管中，并且所有標(biāo)本在收集和運(yùn)輸過程中均置于冰上，并于-80 ℃冰箱中長(zhǎng)期保存，將收集到的12例組織樣本制作為組織芯片。

1.1.2細(xì)胞與動(dòng)物 原代CRC細(xì)胞系HT-29購(gòu)于上海生命科學(xué)院細(xì)胞典藏庫(kù)。健康裸鼠，4～6周齡，18～22 g，購(gòu)自江蘇南京集萃藥康生物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCKK(蘇)2018-0008。飼養(yǎng)于20～25 ℃、40%～60%濕度、照明與黑暗各12 h交替環(huán)境中，自由進(jìn)水、飲食，1周后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3試劑和儀器 SFN、MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素/鏈霉素、BCA試劑盒和4%多聚甲醛購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM購(gòu)自美國(guó)Hycolne公司；0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)Wisen公司；β-actin和eIF4F復(fù)合物相關(guān)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔或抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋有限公司；二甲基亞砜(DMSO)和0.1%結(jié)晶紫購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher公司，熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 原代CRC細(xì)胞系HT-29細(xì)胞，DMEM高糖培養(yǎng)基+10%血清+雙抗(青霉素、鏈霉素)中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為：5%CO2，37 ℃。每3 d換液1次，每5 d傳代1次，傳代次數(shù)不超過10代，1 500 r/min離心5 min，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞活力測(cè)定(MTT) 將細(xì)胞接種于密度為3×103個(gè)/孔的96孔板中。二甲基亞砜(DMSO，對(duì)照組)和不同濃度的SFN處理48 h。MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入5 mg/ml 的MTT溶液10 μl，37 ℃孵育4 h。移除培養(yǎng)基并添加200 μl異丙醇以溶解甲醛沉淀物。在570 nm處測(cè)量細(xì)胞勻漿的光密度，620 nm作為參比濾光片。DMSO作為載體對(duì)照，對(duì)細(xì)胞活力無影響。

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 處理后的HT-29細(xì)胞PBS洗2次，加入蛋白裂解液(RIPA ∶蛋白酶抑制劑 ∶磷酸酶抑制劑比例為1 ∶100 ∶100)，待細(xì)胞裂解完全后吸取懸液，4 ℃、13 200 r/min離心30 min，吸取蛋白上清液，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，用BCA法測(cè)蛋白濃度并進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，加上樣緩沖液煮沸10 min變性，以蛋白質(zhì)30 μg進(jìn)行SDS-PACE電泳。轉(zhuǎn)膜后，用含5% BSA的TBST室溫慢搖封閉1.5 h，分別加入β-actin和相應(yīng)一抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠/兔二抗孵育1 h，洗膜后用顯影儀檢測(cè)蛋白顯影。

1.2.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(裸鼠成瘤) 12只健康適齡裸鼠隨機(jī)均分為兩組，將0.1 ml(細(xì)胞數(shù)約1×106)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞沿皮下緩慢注入裸鼠腋窩。3 d后，實(shí)驗(yàn)組每天腹腔注射溶解于DMSO的SFN(0.5 mg/kg)，對(duì)照組每天腹腔注射等濃度的溶劑DMSO(0.5 mg/kg)，共注射14 d。14 d后處死裸鼠，取出腫瘤，測(cè)量體積大小，將腫瘤標(biāo)本制成石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.2.5HE染色法 石蠟切片置于65 ℃恒溫箱中烘焙60 min，于二甲苯中脫蠟，依次在無水乙醇、95%、70%、50%乙醇溶液中脫蠟處理。將切片依次放入蘇木精、伊紅染色槽中，用自來水洗滌，再置于50%、70%、95%乙醇溶液、無水乙醇中脫水處理，干燥后用中性樹脂密封，鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)與形態(tài)。

1.2.6免疫組織化學(xué)染色法 石蠟切片置于65 ℃恒溫箱中烘焙60 min，于二甲苯中脫蠟，依次在無水乙醇、95%、70%、50%乙醇溶液中脫蠟處理。再放入枸櫞酸鈉溶液中高溫下抗原修復(fù)10 min。用純水沖洗2次，每次5 min，油性筆畫圈，10%過氧化氫去離子水 ∶甲醇(1 ∶9) 孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，TBST沖洗3次，每次5 min，破膜液(含0.25% Triton X-100的TBS) 10 min，TBST沖洗，滴加10%山羊血清封閉液，室溫孵育2 h，滴加一抗，4 ℃過夜?；厥找豢梗琓BST沖洗，滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，清洗，滴加相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，純水沖洗，DAB顯色后自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精染核20 s，純水沖洗。再置于50%、70%、95%乙醇溶液、無水乙醇中脫水處理、固定，中性樹膠封片后鏡下觀察相關(guān)蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用GraphPad Prism 9.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)均分別重復(fù)3次以上。用ImageJ軟件測(cè)量蛋白灰度值以及免疫組化光密度值，并對(duì)光密度(optical density，OD)值、裸鼠成瘤中的腫瘤體積結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC患者標(biāo)本中eIF4F復(fù)合物相關(guān)蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織CRC患者標(biāo)本的免疫組化染色結(jié)果顯示，eIF4F復(fù)合物相關(guān)蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(圖1A)。OD值分析顯示：腫瘤組織4EBP1(t=4.235，P<0.001)、P-4EBP1(t=2.974，P<0.01)、eIF4E(t=3.820，P<0.001)、P-eIF4E(t=3.308，P<0.01)、eIF4G(t=4.252，P<0.001)表達(dá)均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。

圖1 CRC患者腫瘤組織與癌旁組織中eIF4F復(fù)合物相關(guān)蛋白的表達(dá)差異 ×200A：腫瘤組織與癌旁組織免疫組化染色結(jié)果；B：各組OD值差異分析；與癌旁組織比較：**P<0.01，***P<0.001

2.2 SFN可抑制HT-29細(xì)胞的增殖用MTT比色法檢測(cè)SFN作用48 h后HT-29細(xì)胞存活率的變化，結(jié)果顯示：SFN對(duì)HT-29細(xì)胞活性有抑制作用，并且呈劑量依賴性。SFN對(duì)HT-29細(xì)胞的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)為15.85 μmol/L(圖2A)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.645，P<0.05)(圖2B)。HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組組織細(xì)胞內(nèi)空泡更多(圖2C)。

圖2 SFN抑制HT-29細(xì)胞的增殖 ×200A：不同濃度SFN處理HT-29細(xì)胞48 h后的細(xì)胞活性；B：裸鼠皮下移植瘤的體積比較；C：裸鼠皮下移植瘤的HE染色；與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.3 SFN通過PI3K/AKT/mTOR/4EBP1信號(hào)通路影響HT-29細(xì)胞的增殖Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SFN處理HT-29細(xì)胞后，eIF4F翻譯起始復(fù)合物相關(guān)蛋白的表達(dá)降低。作為其信號(hào)通路的上游，AKT和mTOR表達(dá)量也同時(shí)降低，P-AKT和P-mTOR的表達(dá)有所上升，而PI3K的表達(dá)量無明顯差異(圖3A)。裸鼠皮下移植瘤的免疫組織化學(xué)染色顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中eIF4F翻譯起始復(fù)合物相關(guān)蛋白的表達(dá)量降低，AKT的表達(dá)降低，P-AKT與P-mTOR的表達(dá)增加(圖3B)，這與Western blot檢測(cè)結(jié)果相吻合。

圖3 SFN降低相關(guān)通路蛋白及eIF4F復(fù)合物相關(guān)蛋白的表達(dá) ×200A：SFN處理HT-29細(xì)胞后相關(guān)蛋白的Western blot結(jié)果；B：皮下移植瘤相關(guān)蛋白的免疫組化結(jié)果

3 討論

本研究顯示，eIF4F翻譯起始復(fù)合物在人類CRC組織中上調(diào)，這是翻譯起始的關(guān)鍵組成部分。同時(shí)，從十字花科蔬菜中提取的天然異硫氰酸酯SFN可通過抑制PI3K/AKT/mTOR/4EBP1信號(hào)通路，抑制原代CRC細(xì)胞中eIF4F復(fù)合物的上調(diào)。

mRNA翻譯(蛋白質(zhì)合成)是基因表達(dá)中最耗能的步驟，并且受到高度調(diào)控。翻譯調(diào)控是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的快速適應(yīng)性反應(yīng)，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。因此，翻譯過程在人體生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用，mRNA翻譯成蛋白質(zhì)更是基因表達(dá)調(diào)控中的關(guān)鍵[5]。蛋白質(zhì)翻譯包括起始、延伸、終止和核糖體回收。起始是限速階段，并受到eIF4F翻譯起始復(fù)合物合成速度的限制[6]。eIF4F由支架蛋白eIF4G、mRNA5′Cap結(jié)合亞單位eIF4E和RNA解旋酶eIF4A三個(gè)部分組成。在組成蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合物的所有起始因子中，由于eIF4E被認(rèn)為是最不豐富的翻譯起始因子，所以，eIF4E 與eIF4G 結(jié)合形成eIF4F復(fù)合物的過程，也就成為了翻譯開始的限速步驟和控制蛋白質(zhì)翻譯、表達(dá)的關(guān)鍵點(diǎn)[7]。

eIF4E：eIF4G的形成受到小的翻譯抑制因子4E結(jié)合蛋白(4EBPs)的嚴(yán)格調(diào)控，4EBPs與eIF4G競(jìng)爭(zhēng)形成eIF4E：4EBP1復(fù)合物，并抑制eIF4E：eIF4G的形成[7]。eIF4E上4EBPs的結(jié)構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)與eIF4G重疊，從而使eIF4E能夠同時(shí)與eIF4G或4EBP1獨(dú)占結(jié)合。哺乳動(dòng)物有3種4EBPs：4EBP1、4EBP2和4EBP3，其中4EBP1發(fā)揮著比其他因子更重要的生物學(xué)功能[8]。4EBP1與帽結(jié)合eIF4E的結(jié)合比與無帽eIF4E結(jié)合更快、更緊密。4EBP1和eIF4E之間的這種相互作用受到4EBP1磷酸化的嚴(yán)格調(diào)控，這反過來又會(huì)使4EBP1失活，并解離eIF4E：4EBP1相互作用。4EBP1的過度磷酸化在大多數(shù)人類癌癥中被觀察到，并且經(jīng)常與腫瘤分級(jí)和不良預(yù)后相關(guān)。

文獻(xiàn)[9]報(bào)道，PI3K/AKT/mTOR通路在細(xì)胞增殖、凋亡、代謝和血管生成等方面都發(fā)揮著重要作用。另外，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路與許多人類疾病密切相關(guān)，包括缺血性腦損傷、神經(jīng)退行性疾病和腫瘤[10]。PI3K/AKT/mTOR分為兩部分：磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及其下游分子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(PKB，又稱AKT)。該通路被RTK和細(xì)胞因子受體激活。酪氨酸殘基被磷酸化，為PI3K轉(zhuǎn)位到膜上提供錨點(diǎn)，參與細(xì)胞外基質(zhì)分子和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)。這一信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞也有重要的生物學(xué)效應(yīng)，如促進(jìn)細(xì)胞活性和延緩衰老和死亡，與各類生理活動(dòng)相聯(lián)系。這一通路的功能障礙不僅與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，還與許多其他人類疾病有關(guān)，如白血病、糖尿病和精神分裂癥。雷帕霉素(TOR)是真核細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸激酶靶標(biāo)，是細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的關(guān)鍵因子[11]。哺乳動(dòng)物mTOR能感知細(xì)胞水平的代謝物(如氨基酸、葡萄糖、氧氣和生長(zhǎng)因子)，調(diào)節(jié)從蛋白質(zhì)合成到自噬的一系列過程。并在不同的復(fù)合體中起作用，即mTOR復(fù)合體1(mTORC1)和mTOR復(fù)合體2(mTORC2)[12]。

本研究顯示，SFN可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR/4EBP1信號(hào)通路來抑制eIF4F翻譯起始復(fù)合物的形成，其原因可能是mTOR磷酸化引起的信號(hào)反饋導(dǎo)致AKT過度磷酸化和4EBP1去磷酸化。反過來，4EBP1被SFN去磷酸化并激活，其與eIF4E穩(wěn)定結(jié)合，導(dǎo)致蛋白停止翻譯。mTOR通過調(diào)節(jié)4EBP1的磷酸化在mRNA的翻譯過程中起著關(guān)鍵作用。然而，即使AKT磷酸化被激活，PI3K的表達(dá)仍無顯著變化。因此，可以發(fā)現(xiàn)mTOR磷酸化可誘導(dǎo)反饋，激活A(yù)KT磷酸化，影響其下游的4EBP1，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯過程。