5-磷酸核糖醇轉移酶fukutin抑制HeLa細胞中α-dystroglycan的分泌

周 恒，喬 兵，李彩紅，李 強，朱昉修，范禮斌

抗肌萎縮相關糖蛋白(dystroglycan，DG)由α和β兩個亞基構成[1]，位于胞外的α亞基通過與跨膜的β亞基非共價連接，而將胞外基質(zhì)組分(如層粘連蛋白)與胞內(nèi)組分(如dystrophin)連接起來[2]。研究[2]表明α-DG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結構和功能、上皮的形態(tài)發(fā)生、細胞黏附、突觸的發(fā)生和信號轉導等方面發(fā)揮重要作用。

研究[3]表明α-DG的結構和功能與該蛋白復雜的糖基化修飾密切相關。FKTN是5-磷酸核糖醇轉移酶家族成員之一，可將5-磷酸核糖醇共價連接到α-DGO-糖基化的M3核心，而fukutin相關蛋白(fukutin-related protein，F(xiàn)KRP)將5-磷酸核糖醇添加到前一個5-磷酸核糖醇后，后續(xù)的糖基轉移酶在串聯(lián)的5-磷酸核糖醇上繼續(xù)延伸糖鏈[4]。α-DG的雜多糖鏈上的木糖-葡萄糖醛酸二糖重復單元是許多胞外基質(zhì)蛋白結合的區(qū)域，而5-磷酸核糖醇是這個重復結構形成的必不可少的引物[4]。課題組擬通過在HeLa細胞中過表達FKTN后探究其對細胞周期、凋亡、遷移和α-DG分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株和質(zhì)粒HeLa細胞、TG1菌株、pcDNA3.1載體、質(zhì)粒pcDNA3.1-α-DAG-FLAG為范禮斌課題組保存[5]，質(zhì)粒pcDNA3.1-FKTN-3xFlag購自湖南優(yōu)寶生物科技有限公司(貨號：F138577)。

1.2 主要儀器BSC-Ⅱ級生物安全柜(1300)、微量核酸檢測儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；小型梯度PCR儀、電泳儀(美國伯樂生物科技有限公司)；全自動化學發(fā)光成像儀、小型垂直轉移槽(上海天能生物科技有限公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；CytoFLEX流式細胞儀、高速冷凍離心機[貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司]；光吸收酶標儀[美谷分子儀器(上海)有限公司]。

1.3 主要試劑胎牛血清(美國Clark Bioscience公司)；Opti-MEM[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；Lipo8000TM轉染試劑、苯甲基磺酰氟(PMSF)、胰酶細胞消化液(含EDTA)、Western細胞裂解液、一抗稀釋液(上海碧云天生物技術有限公司)；蛋白酶抑制劑混合物(美國MedChemExpress)；改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、EcoRⅠ、XbaⅠ限制性內(nèi)切酶、T4連接酶(上海生工生物有限公司)；DNA聚合酶[寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司]；膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒(廣州飛揚生物工程有限公司)；PI染液(美國BD Biosciences)；Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡試劑(上海貝博生物科技有限公司)；0.2 μm PVDF膜(美國伯樂生物科技有限公司)；WGA-agarose(美國Vector Laboratories)；FLAG抗體[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]；HA抗體[圣克魯斯生物技術(上海)有限公司]；GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；IIH6 C4抗體(美國愛荷華大學Campbell, K.P教授贈送)；辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgM(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.4 方法

1.4.1質(zhì)粒構建 PCR引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，α-DAG-HA正向引物序列：GGAATTCCGCCACCATGAGGATGTCTGT，反向引物序列：GCTCTAGAGCTTAAGCGTAATCTGGAACATC-GTATGGGTAGCCCCGGGTGATATTCT。以pcDNA3.1-α-DAG-FLAG質(zhì)粒為模板，PCR擴增出含HA標簽的α-DAG，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒進行回收，得到其PCR純化產(chǎn)物。使用EcoRⅠ、XbaⅠ限制酶分別酶切PCR純化產(chǎn)物和pcDNA3.1載體，用T4連接酶將兩者的酶切產(chǎn)物進行連接。連接產(chǎn)物轉化至TG1感受態(tài)細胞中，37 ℃培養(yǎng)約10 h，分別挑取數(shù)個單克隆進行擴大培養(yǎng)約12 h，提取質(zhì)粒后，用EcoRⅠ和XbaⅠ進行酶切鑒定，最后將酶切正確的重組質(zhì)粒送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進行測序。

1.4.2細胞培養(yǎng)與轉染 用完全培養(yǎng)基(10%FBS+90%DMEM高糖培養(yǎng)基+100 U/ml青霉素+ 100 μg/ml鏈霉素)于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa細胞，待細胞生長至90%匯合度時即可進行細胞傳代。提前一天接種1.5×106個HeLa細胞至6 cm培養(yǎng)皿中，使第2天細胞匯合度為70%～90%。取一個無菌的離心管，加入250 μl Opti-MEM，加入5 μg質(zhì)粒和8 μl Lipo8000TM轉染試劑，混合后加至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至48 h時用于后續(xù)實驗。

1.4.3流式細胞術檢測細胞周期 將pcDNA3.1-FKTN-3xFlag轉染至HeLa細胞中，培養(yǎng)48 h后收集細胞沉淀。用預冷的PBS清洗后，加入500 μl預冷的70%乙醇并-20 ℃固定過夜。離心后用預冷的PBS清洗，再加入500 μl PI染液，4 ℃避光孵育15 min后，流式細胞儀檢測細胞周期，F(xiàn)lowJo軟件用于分析細胞周期各時相百分比。

1.4.4流式細胞術檢測細胞凋亡 將pcDNA3.1-FKTN-3xFlag轉染至HeLa細胞中，培養(yǎng)48 h后收集細胞沉淀。用預冷的PBS清洗后，加入400 μl Annexin V結合液使細胞懸浮(密度大約為106/ml)。再加入5 μl Annexin V-FITC染色液，4 ℃避光孵育15 min，最后加入10 μl PI染色液，4 ℃避光孵育5 min后立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡，用Flow Jo軟件分析凋亡率。

1.4.5細胞劃痕實驗 先用筆在12孔板背后均勻劃3條橫線，每條線間隔0.5 cm橫穿過孔，接種3.5×105個HeLa細胞至12孔板中，第2天細胞單層鋪滿。將pcDNA3.1-FKTN-3xFlag和pcDNA3.1分別轉染至HeLa細胞中(設置復孔)，轉染6～8 h后用100 μl槍頭垂直于背面的橫線于匯合完全的單細胞層中劃線。用PBS清洗后，加無血清培養(yǎng)基。顯微鏡下觀察并記錄，此為0 h，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h時觀察并記錄。

1.4.6WGA富集實驗 將相關質(zhì)粒分別轉染至HeLa細胞中，培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，立即放置冰上并加入PMSF和蛋白酶抑制劑混合物。離心后取少量上清液用于改良型Bradford試劑盒測定總蛋白濃度，其余加入10 μl WGA-agarose，4 ℃孵育過夜。上述溶液離心后，沉淀用清洗液(PBS+0.1% TritonX-100)清洗，沉淀用于Western blot檢測。

1.4.7Western blot法檢測蛋白表達 SDS-PAGE后的凝膠用電轉儀(252 mA恒流1.5 h)將目的蛋白轉移到PVDF膜上。膜置于5%脫脂牛奶中室溫封閉1.5 h，然后分別于相應的一抗(稀釋比為1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(稀釋比為1 ∶2 500)室溫孵育1.5 h，用ECL試劑盒進行顯色，再用化學發(fā)光儀拍攝。

2 結果

2.1 真核表達質(zhì)粒構建將構建的pcDNA3.1-α-DAG-HA質(zhì)粒進行酶切鑒定，酶切鑒定正確的質(zhì)粒送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司測序。結果表明：構建的質(zhì)粒含有插入片段(圖1A泳道2、3、4)，測序結果顯示載體上的插入片段是正確的(圖1B)。

圖1 pcDNA3.1-α-DAG-HA重組質(zhì)粒的酶切鑒定與測序結果A：pcDNA3.1-α-DAG-HA重組質(zhì)粒酶切鑒定圖；1：pcDNA3.1-DAG1-HA酶切產(chǎn)物；2～4：pcDNA3.1-α-DAG-HA酶切產(chǎn)物；M：Marker；B：pcDNA3.1-DAG1-HA測序結果圖

2.2 HeLa細胞過表達FKTNHeLa細胞轉染FKTN后，進行Western blot檢測。結果顯示：FKTN可見相應的目的條帶，而對照組未見任何條帶，表明FKTN在HeLa細胞中可表達(圖2泳道3)。

圖2 FKTN在HeLa細胞中的過表達1：未轉染的HeLa細胞裂解液；2：轉染pcDNA3.1的HeLa細胞裂解液；3：轉染pcDNA3.1-FKTN-3xFlag的HeLa細胞裂解液

2.3 FKTN阻滯細胞周期HeLa細胞過表達FKTN后，使用流式細胞儀檢測細胞周期(表1)。結果顯示：與對照組相比，F(xiàn)KTN過表達組S期百分比下降(P<0.001)，G2期百分比升高(P<0.05)，G1期百分比無變化(P>0.05)。表明過表達的FKTN使HeLa細胞S期減少、G2期增加，因而阻滯了細胞周期(圖3)。

表1 FKTN對細胞周期各時相平均百分比的影響

圖3 FKTN過表達后HeLa細胞的細胞周期圖A：轉染pcDNA3.1的對照組；B：轉染pcDNA3.1-FKTN-3xFlag的過表達組

2.4 FKTN對細胞凋亡的影響HeLa細胞過表達FKTN后，使用流式細胞儀檢測凋亡情況(表2)。結果顯示：與對照組相比，F(xiàn)KTN過表達組細胞凋亡率無變化(P>0.05)。表明FKTN對HeLa細胞凋亡無影響(圖4)。

表2 FKTN對細胞凋亡的影響

圖4 FKTN過表達后HeLa細胞的凋亡情況A：轉染pcDNA3.1的對照組；B：轉染pcDNA3.1-FKTN-3xFlag的過表達組

2.5 FKTN對細胞遷移的影響HeLa細胞過表達FKTN后，采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移速率。S0表示0 h時兩條線之間的面積，S24表示24 h時兩條線之間的面積，遷移速率=(S0-S24)/S0。結果顯示：與對照組相比，F(xiàn)KTN過表達組細胞遷移速率無變化(P>0.05)，如表3所示。表明FKTN對HeLa細胞遷移無影響(圖5)。

圖5 FKTN過表達后HeLa細胞的遷移圖 ×100

表3 FKTN對細胞遷移的影響

2.6 FKTN對α-DG分泌的影響HeLa細胞過表達pcDNA3.1-FKTN-3xFlag和pcDNA3.1-α-DAG-HA，pcDNA3.1和pcDNA3.1-α-DAG-HA后，進行WGA富集實驗和Western blot。結果顯示：細胞培養(yǎng)液中與對照組相比，F(xiàn)KTN過表達組α-DG分泌量減少(圖6A泳道2、3)。細胞裂解液孵育HA抗體后，對照組和FKTN過表達組均有目的條帶，但HA-α-DG表達量無變化(圖6B泳道5、6)；孵育IIH6 C4抗體(此抗體特異性識別α-DG的糖鏈)后，F(xiàn)KTN過表達組α-DG糖基化程度高于對照組(圖6B泳道5、6)。表明在HeLa細胞中過表達FKTN促進α-DG糖基化，抑制α-DG分泌(圖6)。

圖6 FKTN過表達對α-DG分泌的影響A：過表達FKTN后分泌的α-DG；1：轉染pcDNA3.1的HeLa細胞培養(yǎng)液；2：轉染pcDNA3.1和pcDNA3.1-α-DAG-HA的HeLa細胞培養(yǎng)液；3：轉染pcDNA3.1-FKTN-3xFlag和pcDNA3.1-α-DAG-HA的HeLa細胞培養(yǎng)液；B：過表達FKTN后細胞裂解液中α-DG及其相關蛋白；4：轉染pcDNA3.1的HeLa細胞裂解液；5：轉染pcDNA3.1和pcDNA3.1-α-DAG-HA的HeLa細胞裂解液；6：轉染pcDNA3.1-FKTN-3xFlag和pcDNA3.1-α-DAG-HA的HeLa細胞裂解液

3 討論

腫瘤進展的標志是侵襲和轉移，腫瘤細胞為了遠處轉移，必須先從基膜中釋放出來[6]。細胞與細胞或基質(zhì)之間的黏附對于細胞增殖、遷移、分化以及組織的穩(wěn)定性具有關鍵性作用[7]，典型的黏附分子包括整合素(integrin)和DG。位于胞外的α-DG是高度糖基化的受體，它與胞外基質(zhì)配體和跨膜的β抗肌萎縮相關糖蛋白(β-dystroglycan，β-DG)結合從而緊密連接基膜與細胞膜[7]。FKTN是福山型先天性肌營養(yǎng)不良病的致病基因，這種疾病屬于常染色體隱性遺傳病，患者表現(xiàn)為先天性肌無力、小腦發(fā)育不全以及嚴重的智力缺陷[8]。FKTN的功能可能是通過影響α-DG的糖基化從而對細胞的功能(如遷移)產(chǎn)生影響，siRNA抑制FKTN表達后，星形細胞瘤細胞系出現(xiàn)明顯的胞質(zhì)突起[9]。

FKTN與細胞增殖的關系已經(jīng)有報道。例如在胃癌細胞系中siRNA抑制FKTN表達后，細胞增殖能力下降[10]。在星形膠質(zhì)細胞中，F(xiàn)KTN與激活蛋白1(activator protein-1，AP1)結合，從而促進cyclin D1表達，有利于細胞增殖[11]。而穩(wěn)定表達DG的乳腺癌細胞中，細胞周期阻滯在G0/G1期，且α-DG表達量無明顯變化，β-DG表達水平明顯增加[12]。本研究表明過表達FKTN后，HeLa細胞的細胞周期S期百分比下降，阻滯細胞周期進程。在不同的細胞中FKTN對細胞增殖的影響不同，可能與組織和細胞類型的特異性有關。在前列腺癌和乳腺癌細胞中，β3-N-乙酰氨基葡萄糖基轉移酶1(β3-N-acetylglucosaminyltransferase 1，β3GnT1)與類乙酰氨基葡萄糖基轉移酶(like acetylglucosaminyltransferase，LARGE)結合共同調(diào)節(jié)α-DG糖基化，隨后糖基化的α-DG與laminin的相互作用可拮抗胞外基質(zhì)組分誘導的ERK/AKT磷酸化，從而抑制腫瘤細胞遷移，抑制腫瘤形成[13]。本研究雖然表明過表達FKTN后，細胞遷移速率增加，但差異無統(tǒng)計學意義(圖5)。

目前暫無文獻描述FKTN與細胞凋亡之間的關系，但5-磷酸核糖醇轉移酶家族的另一成員FKRP與細胞凋亡密切相關。在FKRP基因突變患者的多功能干細胞來源的肌管細胞中，ERK1/2活性降低，細胞凋亡增加[14]。本研究表明在HeLa細胞中過表達FKTN后，細胞凋亡率無變化(圖4)。DG在胞內(nèi)合成后，被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體中的一系列糖基轉移酶修飾，從而成為細胞膜中的α-DG和β-DG或分泌到胞外(α-DG)[2]。WGA富集實驗常用來分離、鑒定糖基化的α-DG[15]。本研究用此方法富集了HeLa細胞和培養(yǎng)液，并分析胞內(nèi)和分泌的α-DG的含量，結果表明過表達的FKTN抑制α-DG的分泌。

綜上所述，本研究表明在HeLa細胞中過表達FKTN阻滯細胞周期，抑制α-DG分泌，但對細胞凋亡和細胞遷移無影響。