右美托咪定對(duì)鐵超載誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用

丁 慧，王京燕，黃 艷，鐘薇薇，魯顯福，李元海,

鐵死亡[1]是依賴鐵的脂質(zhì)過氧化物積累到毒性水平導(dǎo)致細(xì)胞死亡的非凋亡的程序性死亡，鐵是否過量是鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵[2]。腦中鐵沉積足以引發(fā)腦出血[3]，免疫組化檢測顯示腦內(nèi)的鐵沉積隨年齡增加[4]。腦鐵水平過高會(huì)引起脂質(zhì)氧化水平升高造成神經(jīng)中毒[5]。mTOR(mammalian target of rapamycin)可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1 (transferrin receptor1，TFR1)的穩(wěn)定性，維持細(xì)胞內(nèi)鐵的平衡狀態(tài)[6]。在腦出血疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)現(xiàn)mTOR介導(dǎo)的鐵代謝的證據(jù)，缺失會(huì)引起鐵代謝紊亂，引起氧化應(yīng)激，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

右美托咪定(dexmedetomidine, Dex)作為高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，能改善神經(jīng)退行性疾病和腦外傷中的氧化應(yīng)激水平的異常增高[7]。小鼠海馬神經(jīng)元(hippocampal neurons, HT22)作為中樞神經(jīng)執(zhí)行認(rèn)知功能的神經(jīng)元易受到應(yīng)激刺激—尤其是鐵離子刺激，誘發(fā)氧化應(yīng)激引起鐵死亡，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[8]。該研究擬探討Dex對(duì)鐵超載造成的HT22細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為麻醉藥物治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系、HT22專用完全培養(yǎng)基購自中國武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司；0.25%胰酶消化液購自Gibco公司；右美托咪定購自揚(yáng)子江藥業(yè)(集團(tuán))有限公司；DHE熒光探針購自yeasen公司；丙二醛 (malondialdehyde，MDA)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Mito-FerroOrange亞鐵離子探針購自日本Dojindo分子技術(shù)有限公司；兔抗長鏈酯酰輔酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4)、兔抗TFR1、兔抗mTOR購自美國Abcam公司。兔抗p-mTOR、抗β-actin和抗前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2 (prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)抗體、山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)辣根過氧化物酶(HRP)二抗購自中國武漢愛博泰克(Abclonal)生物科技有限公司。mTOR、TFR1、ACSL4、PTGS2 和 GAPDH 引物由中國安徽通用生物科技公司合成。

1.2 儀器熒光倒置顯微鏡(德國Zeiss公司)；Centrifuge 5424 R冷凍離心機(jī)(德國eppendorf公司)；Synergy2酶標(biāo)儀(美國BioTek儀器公司)；Bioshine ChemiQ化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、CFX Connect 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀(美國Bio-Rad公司)； Talos L120C G2透射電子顯微鏡(美國Thermoscientific公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞分組 HT22細(xì)胞隨機(jī)分為4組：① 對(duì)照組(Ctrl組)：HT22細(xì)胞使用HT22細(xì)胞專用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；② FAC處理組(FAC組)：使用終濃度為125 μmol/L的FAC處理HT22細(xì)胞后培養(yǎng)24 h；③ Dex處理組(Dex組)：使用終濃度為5 μmol/L Dex預(yù)處理HT22細(xì)胞2 h后，使用終濃度為125 μmol/L FAC處理HT22細(xì)胞后培養(yǎng)24 h；④ 鐵死亡抑制劑Fer-1處理組(Fer-1組)：使用終濃度為1 μmol/L Fer-1預(yù)處理HT22細(xì)胞2 h后，使用終濃度為125 μmol/L FAC處理HT22細(xì)胞后培養(yǎng)24 h。

1.3.2CCK-8法檢測HT22細(xì)胞活力 選取對(duì)數(shù)生長期的HT22細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板上，培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度Dex (0.2、1、5、25 μmol/L)，此外設(shè)置對(duì)照組(Ctrl組)和空白組(等量細(xì)胞培養(yǎng)基和CCK-8試劑)，每孔再設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑(每孔內(nèi)加入100 μl培養(yǎng)基)，于培養(yǎng)箱中孵育2 h后使用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度(absorbance, A)值，以此計(jì)算各孔的細(xì)胞相對(duì)存活率。相對(duì)存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3Western blot法檢測蛋白表達(dá) HT22細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)12 h后，按照上述實(shí)驗(yàn)分組方法加入藥物處理。制取樣品，經(jīng)PBS沖洗2次，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，置于1.5 ml EP管中，12 000 r/min離心30 min。取上清液，將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按1 ∶4體積混合，100 ℃煮沸10 min變性，使溫度降至室溫。以每孔10 μl的蛋白樣品量進(jìn)行蛋白電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，每次10 min。PTGS2、ACSL4、p-mTOR、mTOR、TFR1抗體按1 ∶1 000稀釋，置于4 ℃過夜后，使用TBST洗滌3次，每次10 min。加入1 ∶10 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，使用ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.3.4qPCR檢測PTGS2和ACSL4表達(dá)水平 HT22細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)12 h后，按照上述實(shí)驗(yàn)分組方法加入藥物處理。制取樣品，加入RNA裂解液裂解30 min，吹下細(xì)胞轉(zhuǎn)至無酶EP管中，加入氯仿萃取，12 000 r/min離心30 min。取上清液加入等量異丙醇，置于-20 ℃助沉2 h。隨后12 000 r/min離心15 min得到RNA沉淀，洗滌干燥后定量，隨后加入Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)儀器的操作說明，利用特異性引物對(duì)單個(gè)細(xì)胞樣本的cDNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。以β-actin作為內(nèi)參，比較分析各組mRNA的表達(dá)，見表1。采用最優(yōu)稀釋和熔化曲線，以確保每一套引物擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。所有表達(dá)式均使用2-ΔΔCt方法計(jì)算。數(shù)據(jù)分析使用qBase+ (Version 3.0, Bio Gazelle, Gent, Belgium)。

表1 引物序列

1.3.5MDA試劑盒測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 將HT22細(xì)胞以1×105/孔接種在6孔板上，培養(yǎng)12 h后, 按照上述實(shí)驗(yàn)分組方法加入藥物處理，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞孵育箱內(nèi)孵育24 h，收集細(xì)胞至EP管中，1 200 r/min離心10 min，取上清液于冰上待測，吸取300 μl上清液于96孔板，使用酶標(biāo)儀在532 nm處檢測細(xì)胞的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MDA濃度。

1.3.6DHE免疫熒光染色檢測ROS生成 將HT22細(xì)胞以1×105/孔接種在6孔板上，培養(yǎng)12 h后，按照上述細(xì)胞分組方法加入藥物處理，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，使用PBS洗2次，將終濃度為10 μmol/L的DHE熒光染料加到PBS中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min后用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。選擇Image J軟件進(jìn)行熒光半定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.7Mito-FerroOrange熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)Fe2+的變化 以1×105/孔接種在6孔板上，培養(yǎng)12 h后, 按照上述細(xì)胞分組方法加入藥物處理。使用DMSO將Mito-FerroOrange熒光探針溶解為1 μmol/L的儲(chǔ)存液，于6孔板上處理細(xì)胞，使用HBSS洗3次后，每孔加入儲(chǔ)存液使其終濃度為1 μmol/L，于培養(yǎng)箱孵育30 min后，置于共聚焦顯微鏡下觀察各組的熒光強(qiáng)度。

1.3.8電鏡檢測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 將HT22細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)12 h至細(xì)胞匯集到80%～90%，按上述實(shí)驗(yàn)分組方法處理后孵育24 h，提取電鏡樣品，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞置于EP管中，1 500 r/min離心5 min，加入戊二醛固定液固定細(xì)胞沉淀。將標(biāo)本置于電鏡下觀察各組線粒體嵴、線粒體膜密度及細(xì)胞核的變化。

1.3.9低表達(dá)mTOR 時(shí)TFR1蛋白水平變化 將HT22細(xì)胞隨機(jī)分為3組：① 對(duì)照組(Ctrl組)：HT22細(xì)胞使用HT22細(xì)胞專用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；② FAC處理組(FAC組)：使用終濃度為125 μmol/L FAC處理HT22細(xì)胞后培養(yǎng)24 h；③ FAC+AZD8055組：使用終濃度為125 μmol/L FAC和終濃度為80 nmol/L AZD8055處理HT22細(xì)胞后培養(yǎng)24 h。根據(jù)1.3.3項(xiàng)方法，使用Western blot檢測p-mTOR和TFR1的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 Dex對(duì)FAC暴露下HT22細(xì)胞存活率的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，0.2、1、5 μmol/L Dex對(duì)HT22細(xì)胞活力有促進(jìn)作用，而25 μmol/L Dex作用不顯著(F=13.31,P<0.05)，見圖1A。FAC降低HT22細(xì)胞的活力，而1、5 μmol/L Dex預(yù)處理抑制了HT22細(xì)胞活力的降低(F=0.57,P<0.05) ，見圖1B。因此選取5 μmol/L Dex作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)劑量。

圖1 Dex對(duì)FAC暴露下HT22細(xì)胞存活率的影響A：CCK-8法檢測不同濃度Dex處理后細(xì)胞存活率；B：CCK-8法檢測Dex預(yù)處理細(xì)胞后加入FAC的細(xì)胞存活率；a：Ctrl組；b-e：0.2、1、5、25 μmol/L Dex組；f：FAC組；g：0.2 μmol/L Dex + FAC組；h： 1 μmol/L Dex+ FAC組；i：5 μmol/L Dex+ FAC組；j：25 μmol/L Dex+ FAC組；與Ctrl組比較：#P<0.05，##P<0.01；與FAC組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 Dex抑制FAC引起HT22細(xì)胞發(fā)生鐵死亡使用FAC處理HT22細(xì)胞24 h后，與Ctrl組相比，F(xiàn)AC組鐵死亡標(biāo)志性蛋白PTGS2和ACSL4蛋白表達(dá)明顯升高，與FAC組比較，Dex組PTGS2和ACSL4蛋白表達(dá)下降，這一變化與Fer-1組一致(P<0.05)，見圖2A，且FAC組PTGS2和ACSL4的mRNA表達(dá)水平相比于Ctrl組也顯著增加，與FAC組比較，Dex組PTGS2和ACSL4的 mRNA表達(dá)水平下降，這一變化與Fer-1組一致(P<0.05)，見圖2B。

圖2 Dex抑制FAC引起HT22細(xì)胞發(fā)生鐵死亡A：Western blot法檢測HT22細(xì)胞PTGS2、ACSL4的表達(dá)；B：qPCR法檢測HT22細(xì)胞PTGS2、ACSL4的mRNA表達(dá)；a:Ctrl組；b：FAC組；c：Dex+FAC組；d：Fer-1+FAC組；與Ctrl組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001;與FAC組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 Dex降低HT22細(xì)胞內(nèi)ROS水平細(xì)胞內(nèi)ROS的水平增高會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。DHE熒光探針染色可檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，使用125 μmol/L FAC處理HT22細(xì)胞24 h后，相較于Ctrl組，F(xiàn)AC組ROS水平升高(P<0.01)；使用Dex和Fer-1預(yù)處理2 h后，與FAC組比較，Dex組和Fer-1組ROS水平降低(F=35.90,P<0.05)，見圖3。

圖3 DHE熒光探針檢測HT22細(xì)胞中的ROS水平 ×400A:Ctrl組；B：FAC組；C：Dex組；D：Fer-1組；與Ctrl組比較：##P<0.01;與FAC組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4 Dex減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化水平使用125 μmol/L FAC處理HT22細(xì)胞24 h后，相較于Ctrl組，F(xiàn)AC組脂質(zhì)氧化水平升高(P<0.001)；使用Dex預(yù)處理2 h后，與FAC組比較，Dex組脂質(zhì)氧化水平降低(F=162.20,P<0.001)，見圖4。

圖4 MDA試劑盒檢測HT22細(xì)胞中脂質(zhì)氧化程度A:Ctrl組；B：FAC組；C：Dex組；D：Fer-1組；與Ctrl組比較：###P<0.001;與FAC組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.5 Dex降低細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量Mito-FerroOrange熒光探針檢測Fe2+的變化，結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，F(xiàn)AC組細(xì)胞內(nèi)Fe2+濃度升高(P<0.001)，而Dex組與Fer-1組細(xì)胞內(nèi)Fe2+濃度則顯著下降(P<0.001)，表明Dex抑制了FAC所引起的Fe2+濃度的增加(F=0.36,P<0.001)，見圖5。

圖5 Mito-FerroOrange Fe2+熒光探針檢測HT22細(xì)胞中的Fe2+含量 ×60A:Ctrl組；B：FAC組；C：Dex組；D：Fer-1組；與Ctrl組比較：###P<0.001;與FAC組比較：***P<0.001

2.6 Dex減輕細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷使用透射電子顯微鏡觀察HT22細(xì)胞中的超微結(jié)構(gòu)改變，與Ctrl組比較，F(xiàn)AC組線粒體損傷嚴(yán)重，膜密度增厚，線粒體嵴消失，Dex組和Fer-1組細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷程度減輕，見圖6。

圖6 電子顯微鏡下HT22細(xì)胞中線粒體及細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)的變化情況 ×13 500A:Ctrl組；B：FAC組；C：Dex組；D：Fer-1組；箭頭：線粒體

2.7 Dex通過減輕鐵超載毒性抑制鐵死亡使用mTOR抑制劑AZD8055后，TFR1表達(dá)上調(diào)(F=73.03，P<0.05)，見圖7A；與Ctrl組比較，F(xiàn)AC組mTOR表達(dá)水平下調(diào)，TFR1及Fpn水平上調(diào)，鐵蛋白(Ferrtin)表達(dá)降低；與FAC組比較，Dex組mTOR表達(dá)水平升高，TFR1和Fpn表達(dá)水平減少，而Ferrtin表達(dá)活躍(P<0.05)，見圖7B。

圖7 Dex通過減輕鐵超載毒性抑制鐵死亡A：Western blot法檢測HT22細(xì)胞經(jīng)AZD8055處理后p-mTOR、TFR1的表達(dá)；B：Western blot法檢測鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)；a:Ctrl組；b：FAC組；c：FAC+AZD8055組；d：Dex組；e：Fer-1組；與Ctrl組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001;與FAC組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

本研究根據(jù)文獻(xiàn)[9]和CCK-8法檢測結(jié)果確定了Dex是一種安全無毒的麻醉藥物，可以保護(hù)HT22細(xì)胞免受毒性損傷。采用FAC誘導(dǎo)HT22細(xì)胞，建立鐵超載模型。結(jié)果表明，與Ctrl組相比，F(xiàn)AC組Fe2+含量升高，提示鐵超載模型建立成功。本實(shí)驗(yàn)采用5 μmol/L Dex預(yù)處理，發(fā)生鐵超載毒性的HT22細(xì)胞中Fe2+含量下降，提示Dex可以減輕鐵超載引起的HT22細(xì)胞損傷。

鐵死亡是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種相對(duì)較新的死亡方式，它與神經(jīng)退行性疾病和腦缺血/出血性中風(fēng)均有密切關(guān)系[10]，鐵代謝紊亂可以認(rèn)為是鐵死亡的觸發(fā)階段[11]，影響細(xì)胞中ROS和脂質(zhì)氧化的水平。HT22細(xì)胞分離自大腦海馬體，是鐵死亡高度敏感的細(xì)胞，目前廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。FAC誘導(dǎo)的細(xì)胞外高鐵濃度，使HT22細(xì)胞受到鐵超載毒性攻擊。HT22細(xì)胞發(fā)生鐵超載后，會(huì)產(chǎn)生過量脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，加速細(xì)胞的損傷，引起氧化應(yīng)激。細(xì)胞外高鐵能增加TFR1入口的鐵積累量，刺激TFR1通道打開，大量鐵流入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)Ferrtin可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵水平，對(duì)其進(jìn)行貯存，維持細(xì)胞內(nèi)鐵的穩(wěn)態(tài)。一旦Ferrtin降解，鐵將變成游離態(tài)并促進(jìn)Fenton反應(yīng)發(fā)生，生成脂質(zhì)過氧自由基(PUFA-OO·)，并最終形成脂質(zhì)氫過氧化物(PUFA-OOH)，加速脂質(zhì)積聚，最終導(dǎo)致鐵死亡[12]。PTGS2和ACSL4是已知的鐵死亡關(guān)鍵的標(biāo)志性蛋白，參與上述脂質(zhì)積累的過程，本研究結(jié)果顯示，與Ctrl組比較，F(xiàn)AC組HT22細(xì)胞PTGS2和ACSL4的蛋白和mRNA表達(dá)水平升高，ROS、脂質(zhì)氧化水平和Fe2+水平表達(dá)升高，細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)損壞程度加重，提示FAC可以促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生；且Dex能降低FAC引起的HT22細(xì)胞中PTGS2和ACSL4的蛋白和mRNA表達(dá)水平升高，減輕ROS、脂質(zhì)氧化水平和Fe2+水平表達(dá)的升高，以及緩解細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)損壞程度，提示Dex可能是通過抑制鐵死亡的方式保護(hù)HT22細(xì)胞。

mTOR通路失控通常表現(xiàn)在腦出血、神經(jīng)退行性疾病和衰老等許多疾病中,因此靶向mTOR治療在近年來快速興起[13]， mTOR在鐵死亡的研究中越發(fā)受到重視，許多研究者認(rèn)為mTOR介導(dǎo)的鐵代謝與腦出血之間存在聯(lián)系。mTOR作為調(diào)節(jié)鐵離子代謝的上游靶點(diǎn)已被證實(shí)[14]，mTOR-TFR1信號(hào)通路作為調(diào)節(jié)鐵離子代謝的關(guān)鍵通路，因此mTOR在鐵死亡的發(fā)生機(jī)制中具有重要作用。細(xì)胞高鐵濃度會(huì)使mTOR的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)失衡，引起氧化應(yīng)激誘發(fā)鐵死亡[15]。本研究顯示，在HT22細(xì)胞鐵超載的模型中，使用mTOR抑制劑AZD8055處理，在mTOR表達(dá)量低的組別中下游TFR1蛋白表達(dá)水平升高，這表明在HT22細(xì)胞的鐵超載模型中存在該通路的調(diào)控；使用Dex處理后，由FAC誘導(dǎo)的mTOR蛋白表達(dá)上調(diào)，下游的TFR1蛋白表達(dá)被抑制，并且降低了FAC引起的HT22細(xì)胞中Ferrtin和Fpn——鐵相關(guān)的蛋白表達(dá)水平的上調(diào)。這說明Dex可能是通過調(diào)節(jié)鐵代謝的方式影響細(xì)胞存活，從而改善鐵超載引起的HT22細(xì)胞損傷。

本研究證實(shí)Dex可以抑制FAC誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，從而減輕HT22細(xì)胞的鐵超載毒性，其機(jī)制可能與激活mTOR-TFR1通路有關(guān)，自噬可能參與其中，但本研究尚未證實(shí)。本研究使用的Dex是商品針劑，對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)存在一定影響；其次，在細(xì)胞機(jī)制方面，本研究證實(shí)Dex對(duì)鐵超載引起的HT22細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有明確的保護(hù)作用，但尚未在原代神經(jīng)元上驗(yàn)證；在動(dòng)物體內(nèi)Dex對(duì)鐵超載引起的認(rèn)知和記憶功能障礙是否具有保護(hù)作用是本課題組下一步的研究方向。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院教育部抗炎免疫藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位老師和同學(xué)的幫助。)