LncRNA MEG3對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺獲得性耐藥的影響

朱 君，朱正春，秦學(xué)金，張 迪，郗玉巧，李 佳，仲 飛,4

腦膠質(zhì)瘤是源自神經(jīng)上皮的惡性腫瘤，其惡性程度、致死率、復(fù)發(fā)率以及對(duì)化療的耐藥性均較高[1]。2014年至2018年期間，CBTRUS統(tǒng)計(jì)報(bào)告有83 029人死于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其中最常見是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[2]。替莫唑胺(temozolomide, TMZ)為基礎(chǔ)的系統(tǒng)化療對(duì)腦膠質(zhì)瘤有確切療效[3]。但是對(duì)于TMZ耐藥的腦膠質(zhì)瘤，很難預(yù)防其進(jìn)展或復(fù)發(fā)[4]。因此，闡明TMZ耐藥的發(fā)生機(jī)制在臨床上對(duì)改善膠質(zhì)瘤的化療效果有極其重要的意義。LncRNA被歸類為具有調(diào)控作用的非編碼RNA[5]。有研究[6]證明LncRNA在癌癥的起始、進(jìn)展和化療耐藥過程中起到重要作用。LncRNA MEG3是LncRNAs中的一種，參與多種腫瘤耐藥性的調(diào)控[7]，但是其是否參與調(diào)控膠質(zhì)瘤的耐藥性鮮有報(bào)道，現(xiàn)以U87/TMZ細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察LncRNA MEG3對(duì)其耐藥性的影響，以期為臨床逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤耐藥研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87購自上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑 替莫唑胺(貨號(hào)：T2577-25MG)購自美國Sigma公司；U-87 MG細(xì)胞專用培養(yǎng)基(貨號(hào)：CM-0238)購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胰酶消化液(貨號(hào)：SH30042.01B)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(貨號(hào)：11011-8611)購自浙江天杭生物科技股份有限公司；RNA提取試劑盒(貨號(hào)：15596018)、qRT-PCR試劑盒(貨號(hào)：CS11733046)、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(貨號(hào)：11668)購自美國 Invitrogen公司；RIPA裂解液(貨號(hào)：P0013C)、BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：P0012)、ECL液(貨號(hào)：P0018AS)、MTT檢測試劑盒(貨號(hào)：C0009S)及細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號(hào)：C1062M)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel基質(zhì)膠(貨號(hào)：356234)購自美國 BD公司；Transwell小室(貨號(hào)：3421)購自Corning公司；抗體購自Abcam公司，一抗：MDM2抗體(貨號(hào)：ab259265)、 p53抗體(貨號(hào)：ab32389)、GADPH抗體(貨號(hào)：ab263962)；二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(貨號(hào)：ab97126)、羊抗兔 IgG(貨號(hào)：ab97051)，所有引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.3主要儀器 QP-80二氧化碳培養(yǎng)箱(中國濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；TS100型倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；CFX ConnectTM實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀、凝膠成像儀、電泳儀(美國Bio-Rad公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices 公司)；流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter FC500公司)。

1.2 方法

1.2.1膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87的培養(yǎng) 用U-87 MG細(xì)胞專用培養(yǎng)基(MEM+10% FBS+1% P/S Solution)培養(yǎng)細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2獲得性TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的構(gòu)建 將U87細(xì)胞(1×105/ml)暴露于初始濃度為5 μg/ml的TMZ中15～20 d。觀察細(xì)胞生長情況，U87細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期后，倍增TMZ濃度繼續(xù)誘導(dǎo)，直至TMZ濃度達(dá)160 μg/ml，每個(gè)梯度濃度(5、10、20、40、80、160 μg/ml)培養(yǎng)15～20 d。最終獲得耐藥細(xì)胞U87/TMZ。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將U87/TMZ細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種至6孔板，融合度達(dá)70%～80%時(shí)，用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pcDNA-MEG3至U87/TMZ中作為LncRNA MEG3過表達(dá)組，轉(zhuǎn)染pcDNA至U87/TMZ中作為LncRNA MEG3空載體組，以常規(guī)培養(yǎng)的U87/TMZ作為空白組。設(shè)置組別如下：pcDNA-MEG3組、pcDNA組、Control組。轉(zhuǎn)染48 h后觀察，然后用10 μg/ml TMZ繼續(xù)處理細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4qRT-PCR檢測細(xì)胞中LncRNA MEG3的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的U87和U87/TMZ細(xì)胞，根據(jù)試劑盒操作步驟，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。后續(xù)cDNA被用作檢測基因表達(dá)的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算LncRNA MEG3的表達(dá)。LncRNA MEG3引物序列F：5′- GGGCATTAAGCCCTGACCTT-3′，R：5′-CCTTGGGGAGGGAAACACTC-3′；內(nèi)參GADPH引物序列F：5′-ATGTTGCAACCGGGAAGGAA -3′，R：5′-AGGAAAAGCATCACCCGGAG -3′。

1.2.5Western blot 檢測U87/TMZ細(xì)胞中LncRNA MEG3相關(guān)蛋白表達(dá)變化 pcDNA-MEG3組、pcDNA組、Control組細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后，再用10 μg/ml TMZ處理48 h，用RIPA裂解細(xì)胞，從三組細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用封閉液室溫封閉2～3 h，一抗孵育12 h，一抗?jié)舛葹椋篗DM2 (1 ∶400)、p53(1 ∶400)、GAPDH(1 ∶1 000)，二抗孵育2 h，二抗?jié)舛葹椋嚎寡?1 ∶5 000)、抗兔(1 ∶3 000)。ECL發(fā)光檢測，以GAPDH作為內(nèi)參，分析結(jié)果。

1.2.6MTT法檢測細(xì)胞增殖 將所需細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以9×103個(gè)/孔傳代至96孔板中。次日，加入含梯度濃度(5、10、20、40、80 μg/ml)TMZ處理48 h。處理結(jié)束后加入MTT溶液20 μl，4 h后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，用酶標(biāo)儀檢測490 nm下的吸光度。

1.2.7細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況 收集pcDNA-MEG3組、pcDNA組、Control組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，接種至6孔板中，在含10 μg/ml TMZ的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2～3周后用4%多聚甲醇固定細(xì)胞，GIMSA染色10～30 min，洗去染液后拍照進(jìn)行圖像分析。

1.2.8Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲 將基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基以1 ∶3的比例配置，每個(gè)Transwell小室中加入50 μl，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中凝固。收集pcDNA-MEG3組、pcDNA組、Control組細(xì)胞，用含有10 μg/ml TMZ無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，在上室加入100 μl細(xì)胞懸液，24孔板底部中加入600 μl含10%血清培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)48 h，再用甲醇固定30 min，適當(dāng)風(fēng)干后，結(jié)晶染液染色15 min，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.9流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集pcDNA-MEG3組、pcDNA組、Control組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，用10 μg/ml TMZ處理細(xì)胞，然后分裝到5 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min。按照試劑盒說明書用PBS洗滌2次后加入binding buffer(500 μl)，加入 Annxine-FITC(5 μl)和 Propidiumlodide(5 μl)混勻，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.10動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 4周齡BALB/c雌性裸鼠12只，購自上海靈暢生物科技有限公司，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度(23±2) ℃，濕度50%～56%。該實(shí)驗(yàn)相關(guān)內(nèi)容經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。收集2×106個(gè)U87/TMZ細(xì)胞(pcDNA-MEG3組和pcDNA組細(xì)胞)，接種于裸鼠右側(cè)腋窩。在注射U87/TMZ細(xì)胞25 d后，每天向小鼠體內(nèi)注射5 mg/kg TMZ。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸入麻醉處死小鼠，記錄腫瘤體積和重量。

2 結(jié)果

2.1 U87細(xì)胞和U87/TMZ細(xì)胞的增殖能力MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U87細(xì)胞與U87/TMZ細(xì)胞用5、10、20、40、80 μg/ml TMZ處理48 h后，細(xì)胞抑制率逐漸升高。與U87細(xì)胞相比，U87/TMZ細(xì)胞的抑制率下降(P<0.01)，見圖1。

圖1 不同濃度TMZ對(duì)U87和U87/TMZ細(xì)胞生長抑制率的影響與U87細(xì)胞比較：**P<0.01

2.2 LncRNA MEG3在U87細(xì)胞和U87/TMZ細(xì)胞中的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，在mRNA水平上，U87/TMZ細(xì)胞中LncRNA MEG3的表達(dá)量低于U87細(xì)胞(t=61.85,P<0.01)，見圖2。

圖2 U87和U87/TMZ細(xì)胞 LncRNA MEG3表達(dá)情況與U87細(xì)胞比較：**P<0.01

2.3 U87/TMZ細(xì)胞中LncRNA MEG3基因表達(dá)變化qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與pcDNA組和Control組比較，pcDNA-MEG3組LncRNA MEG3 mRNA的表達(dá)水平較高(F=602.4,P<0.01)，見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組U87/TMZ細(xì)胞LncRNAMEG3的表達(dá)情況與Control組比較：**P<0.01；與pcDNA組比較：##P<0.01

2.4 U87/TMZ細(xì)胞LncRNA MEG3相關(guān)蛋白表達(dá)變化Western blot結(jié)果顯示，與Control組和pcDNA組相比，pcDNA-MEG3組的MDM2蛋白表達(dá)降低(F=28.1,P<0.01)，p53蛋白表達(dá)升高(F=22.14,P<0.01)，見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染后各組U87/TMZ細(xì)胞MDM2、p53蛋白的表達(dá)情況與Control組比較：**P<0.01；與pcDNA組比較：##P<0.01

2.5 LncRNA MEG3過表達(dá)聯(lián)合TMZ(10 μg/ml)對(duì)U87/TMZ細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組和 pcDNA組比較，pcDNA-MEG3組的細(xì)胞增殖速度降低(F=389,P<0.01)，見圖5。

2.6 LncRNA MEG3過表達(dá)聯(lián)合TMZ(10 μg/ml)對(duì)U87/TMZ細(xì)胞侵襲的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組和 pcDNA組比較，pcDNA-MEG3組的細(xì)胞侵襲能力降低(F=594.4,P<0.01)，見圖6。

圖6 轉(zhuǎn)染后各組U87/TMZ細(xì)胞侵襲能力的影響情況 ×40與Control組比較：**P<0.01；與pcDNA組比較：##P<0.01

2.7 LncRNA MEG3過表達(dá)聯(lián)合TMZ(10 μg/ml)對(duì)U87/TMZ細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與Control組和 pcDNA組比較，pcDNA-MEG3組的細(xì)胞凋亡率升高(F=477.6,P<0.01)，見圖7。

圖7 轉(zhuǎn)染后各組U87/TMZ細(xì)胞凋亡的影響情況與Control組比較：**P<0.01；與pcDNA組比較：##P<0.01

2.8 LncRNA MEG3過表達(dá)聯(lián)合TMZ對(duì)小鼠移植瘤生長的影響與pcDNA組相比，pcDNA-MEG3組的腫瘤生長減弱。腫瘤切除后，pcDNA-MEG3組腫瘤體積小于pcDNA組(P<0.01)，pcDNA-MEG3組腫瘤質(zhì)量小于pcDNA組(t=12.02,P<0.01)，見圖8。綜上所述， LncRNA MEG3的過表達(dá)在體外和體內(nèi)都逆轉(zhuǎn)了TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療耐藥性。

圖8 小鼠體內(nèi)成瘤情況A：右側(cè)腋下原位移植瘤圖；B：裸鼠腫瘤形態(tài)和大??；C：移植瘤的體積生長曲線；D：兩組移植瘤的質(zhì)量；與pcDNA組比較：**P<0.01

3 討論

化療是癌癥治療中的主要治療手段之一，90%的化療失敗都與腫瘤耐藥相關(guān)[8]。腫瘤細(xì)胞可由于內(nèi)在因素(如突變、易位、表觀遺傳因素)和外在因素(如缺氧、pH、激素、抗腫瘤藥物)而產(chǎn)生耐藥性[9]。筆者推測LncRNA MEG3可能參與TMZ在膠質(zhì)瘤中的耐藥性調(diào)控。本研究通過MTT法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞和TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力，采用qRT-PCR法檢測LncRNA MEG3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力和 LncRNA MEG3表達(dá)水平更低。構(gòu)建LncRNA MEG3過表達(dá)的TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并設(shè)置空載體和對(duì)照組；Western blot法分析各組細(xì)胞LncRNA MEG3相關(guān)蛋白表達(dá)；細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡能力，發(fā)現(xiàn)LncRNA MEG3過表達(dá)組的 LncRNA MEG3 mRNA及p53蛋白表達(dá)水平均有上調(diào)，MDM2蛋白表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)的LncRNA MEG3能抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡能力。小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，LncRNA MEG3的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了TMZ耐藥的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療耐藥性。

已有文獻(xiàn)[10-14]報(bào)道LncRNA MEG3 在腫瘤抑制中發(fā)揮重要作用，并參與了多種腫瘤的耐藥性調(diào)控，包括結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌等。本研究表明LncRNA MEG3在TMZ耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)降低，其過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)對(duì)TMZ的耐藥性。因此，LncRNA MEG3可能成為TMZ耐藥膠質(zhì)瘤化療的一個(gè)預(yù)后分子標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)。有文獻(xiàn)[15]報(bào)道膠質(zhì)瘤化療耐藥可能與細(xì)胞鐵死亡、凋亡、焦亡等死亡機(jī)制相關(guān)。然而，LncRNA MEG3在膠質(zhì)瘤耐藥中的確切生物學(xué)行為及其具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究，為今后膠質(zhì)瘤的臨床基因治療和新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的思路和理論依據(jù)。