奧貝膽酸對DEHP亞急性暴露導(dǎo)致小鼠膽汁淤積的保護(hù)作用

屈明超,趙 凡,張 程,張佳怡,葉 露,張 倫,余 蕓,王建青

膽汁淤積是由各種原因引起的膽汁合成、分泌及排泄障礙而導(dǎo)致膽汁過度堆積的過程[1]。已知膽汁淤積的發(fā)生涉及雌激素、遺傳及環(huán)境等多種因素。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]是鄰苯二甲酸酯(phthalates, PAEs)中應(yīng)用最廣泛的增塑劑，生活中被廣泛應(yīng)用于各種塑料制品中[2-3]。已知DEHP可通過氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等對肝臟產(chǎn)生毒性作用[4]，另有臨床研究[5]表明使用含有DEHP的輸液管可顯著增加膽汁淤積發(fā)生率。針對膽汁淤積性肝損傷，目前臨床治療上仍無特效藥物，主要使用的有熊去氧膽酸(ursodeoxychofic acid，UDCA)和腺苷蛋氨酸等[6]，然而對于部分膽汁淤積患者并沒有很好的治療效果。奧貝膽酸(obeticholic acid，OCA)是一種選擇性法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)激動劑，在調(diào)節(jié)膽汁酸代謝中發(fā)揮著重要的作用[7]。該研究旨在探究DEHP暴露與膽汁淤積的關(guān)系，以及OCA后處理的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 雌性ICR小鼠，8周齡，26～30 g，SPF級，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)在適宜的環(huán)境中：溫度保持在(25±1)℃，濕度保持在(55±5)%，實(shí)驗(yàn)開始前將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本研究所使用的動物實(shí)驗(yàn)均已通過安徽醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審查并批準(zhǔn)(編號：20200523)。

1.1.2主要試劑 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽汁酸(total bile acid，TBA)試劑盒購于浙江伊利康生物技術(shù)有限公司；DEHP購于美國默克公司；OCA購于美國MedChemExpress公司；FXR抗體購于英國Abcam公司。

1.1.3主要儀器 超純水儀(型號：Cascada TM I)購于美國頗爾公司；多功能酶標(biāo)儀(型號：SENERGY 2)購于美國伯騰儀器公司；熒光定量PCR儀(型號：Light Cycle?480 Ⅱ)購于瑞士羅氏公司；全自動生化分析儀(型號：CS-T300)購于長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司；GSY-8電熱恒溫水浴鍋(型號：ALLEGRA X-15 R)購于北京市醫(yī)療設(shè)備廠；高速冷凍離心機(jī)(型號：5427 R)購于德國艾本德股份公司；正置多功能熒光顯微鏡(型號：BX 53+DP 80+Cellsens)購于日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組與處理 實(shí)驗(yàn)一：將雌性ICR小鼠隨機(jī)分為對照組、DEHP低劑量組[50 mg/(kg·d)]、DEHP高劑量組[200 mg/(kg·d)]，每組10只，共灌胃18 d。所有小鼠在剖殺取材前禁食6 h，收集血液和肝臟組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)二：將雌性ICR小鼠隨機(jī)分為對照組、OCA單獨(dú)干預(yù)組(5 mg/kg)、DEHP模型組[200 mg/(kg·d)]、DEHP+OCA組，每組10只，共灌胃18 d。DEHP灌胃時間為每天早上9點(diǎn)，OCA單獨(dú)干預(yù)組和DEHP+OCA組中OCA灌胃時間為第12～18天每天早上7點(diǎn)，在最后一次DEHP灌胃結(jié)束后禁食6 h剖殺取材，收集血液和肝臟組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2血清生化檢測 使用生化分析儀檢測血清中ALT、AST、TBA含量。

1.2.3肝臟組織TBA測定 準(zhǔn)確稱量100 mg小鼠肝臟組織，加入1 ml 75%乙醇溶液進(jìn)行組織勻漿，之后將組織勻漿液50 ℃水浴2 h，然后用離心機(jī)以9 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用生化分析儀檢測。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達(dá) 稱取小鼠肝臟組織50 mg，加入500 μl 裂解液低溫研磨后放入4 ℃冰箱裂解30 min，離心獲得總蛋白，使用酶標(biāo)儀測定蛋白濃度并進(jìn)行定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜到 PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，室溫孵育一抗[FXR一抗?jié)舛? ∶2 000，2 h；GAPDH一抗?jié)舛? ∶5 000，1 h]，再用相應(yīng)二抗(1 ∶40 000)室溫孵育2 h。使用 ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在顯影儀上顯影，用Image J軟件分析蛋白條帶，計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.2.5RT-PCR檢測相關(guān)基因 采用TRlzol法提取肝臟RNA，將所有提取的RNA樣品的濃度定量在500 ng/μl，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，選取18S作為內(nèi)參基因，計(jì)算FXR、小異二聚體伴侶(small heterodimer partner，SHP)和18S核糖體RNA(18S ribosomal RNA，18S)基因的相對表達(dá)水平?；虻囊镄蛄幸姳?。

表1 基因的引物序列

1.2.6肝臟組織病理學(xué)觀察 將小鼠新鮮肝臟組織放入4%多聚甲醛溶液中浸泡處理，室溫放置搖床固定24 h。進(jìn)行脫水包埋并切片固定后，再用蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 DEHP暴露對小鼠肝臟質(zhì)量及肝重指數(shù)的影響如圖1所示：在實(shí)驗(yàn)一中，與對照組相比，DEHP低劑量組小鼠肝臟質(zhì)量及肝重指數(shù)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，DEHP高劑量組小鼠肝臟質(zhì)量及肝重指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 各組小鼠肝臟質(zhì)量及肝重指數(shù)A：肝臟質(zhì)量；B：肝重指數(shù)；與對照組比較：**P<0.01

2.2 DEHP暴露對各組小鼠血清及肝臟組織生化結(jié)果的影響如表2所示：在實(shí)驗(yàn)一中，與對照組相比，DEHP低劑量組小鼠血清中ALT、AST、TBA和肝臟組織中TBA水平有輕微升高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對照組相比，DEHP高劑量組小鼠血清中ALT、AST水平也輕微增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對照組相比，DEHP高劑量組中小鼠血清與肝臟組織中TBA水平均顯著升高，血清與肝臟組織中TBA分別升高了3倍和2倍左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組小鼠血清及肝臟組織生化指標(biāo)

2.3 DEHP暴露對各組小鼠肝組織病理學(xué)的影響情況如圖2所示：在實(shí)驗(yàn)一中，對照組中小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，DEHP低劑量組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)也無明顯改變，DEHP高劑量組小鼠肝組織中可見匯管區(qū)擴(kuò)大，膽管變形以及膽管增生，膽管周圍并伴有少量炎性細(xì)胞浸潤。

圖2 各組小鼠肝臟組織病理變化 HE×400A: 對照組；B: DEHP 低劑量組；C: DEHP 高劑量組

2.4 OCA后處理對各組小鼠肝臟質(zhì)量及肝重指數(shù)的影響如圖3所示：在實(shí)驗(yàn)二中，與對照組相比,DEHP模型組小鼠肝臟質(zhì)量和肝重指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與DEHP模型組相比，DEHP+OCA組小鼠肝臟質(zhì)量和肝重指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 OCA后處理對各組小鼠肝臟質(zhì)量及肝重指數(shù)A: 肝臟質(zhì)量；B: 肝重指數(shù)；a: 對照組；b: OCA單獨(dú)干預(yù)組；c: DEHP模型組；d: DEHP+OCA組；與對照組比較: **P<0.01；與DEHP模型組比較: #P<0.05

2.5 OCA后處理對各組小鼠血清及肝臟組織生化結(jié)果的影響如表3所示：在實(shí)驗(yàn)二中，與對照組相比，DEHP模型組小鼠血清中ALT、AST水平輕微增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但其血清和肝臟中TBA水平明顯升高，血清與肝臟組織中TBA均升高了2倍多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；與DEHP模型組相比，DEHP+OCA組小鼠血清和肝臟中TBA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

表3 OCA處理后各組小鼠血清及肝臟組織生化指標(biāo)

2.6 OCA后處理對各組小鼠肝組織病理學(xué)的影響情況如圖4所示：在實(shí)驗(yàn)二中，對照組與OCA單獨(dú)干預(yù)組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，DEHP模型組小鼠肝組織中可見匯管區(qū)擴(kuò)大，膽管變形以及膽管增生，膽管周圍伴有少量炎性細(xì)胞浸潤，DEHP+OCA組小鼠肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)顯著改善。

圖4 各組小鼠肝臟組織病理變化 HE×400A: 對照組；B: OCA單獨(dú)干預(yù)組；C: DEHP模型組；D: DEHP+OCA組

2.7 OCA緩解DEHP暴露對肝臟中FXR的抑制作用如圖5所示：在實(shí)驗(yàn)二中，與對照組相比，DEHP[200 mg/(kg·d)]暴露后顯著抑制小鼠肝臟組織FXR蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與DEHP模型組相比，DEHP+OCA組小鼠肝臟組織FXR蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且與對照組相比，DEHP[200 mg/(kg·d)]暴露后小鼠肝臟組織中FXR及其靶基因SHP的mRNA水平均降低；與DEHP模型組相比，DEHP+OCA組小鼠肝臟組織中FXR、SHP的mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 OCA后處理激活FXR/SHP信號軸A:Western blot檢測各組小鼠肝臟組織中FXR蛋白水平；B:FXR蛋白相對表達(dá)水平；C:各組小鼠肝臟組織中FXR mRNA水平；D:各組小鼠肝臟組織中SHP mRNA水平；a:對照組；b:OCA單獨(dú)干預(yù)組；c: DEHP模型組；d: DEHP+OCA組；與對照組比較:*P<0.05，**P<0.01；與DEHP模型組比較:#P<0.05

3 討論

膽汁淤積是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，目前實(shí)驗(yàn)?zāi)懼俜e動物模型的構(gòu)建方法主要有藥物誘導(dǎo)、膽管結(jié)扎手術(shù)和腸外營養(yǎng)法三類[8]。針對膽汁淤積模型并無特別統(tǒng)一的評定標(biāo)準(zhǔn)，主要依據(jù)血清生化結(jié)果和組織形態(tài)學(xué)檢查來判斷是否發(fā)生膽汁淤積，而血清膽汁酸濃度升高是診斷的必要條件之一，其中TBA>10 μmol/L可作為膽汁淤積的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。

DEHP可通過多種暴露途徑進(jìn)入人體中，包括口、靜脈輸液、皮膚吸收等。DEHP經(jīng)口攝入主要是通過食物進(jìn)入人體，其皮膚吸收來自化妝品等個人護(hù)理產(chǎn)品。在一些特殊工作人群中，如塑料廠工人和油漆工人等以及大量使用化妝品的女性朋友中，DEHP 的暴露劑量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了國家規(guī)定的安全劑量。DEHP作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物長期暴露會影響人體內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)發(fā)育、哮喘、自閉癥以及肝、肺、甲狀腺和腎臟等多個器官的毒性[10-11]。在體內(nèi)積累大量DEHP及其代謝產(chǎn)物時，肝臟是最大的解毒器官[12]。因此，建立DEHP誘導(dǎo)膽汁淤積動物模型對于深入研究環(huán)境因素與膽汁淤積性肝病之間的關(guān)系具有重要意義。本研究選擇DEHP暴露于雌性ICR小鼠，發(fā)現(xiàn)DEHP暴露后導(dǎo)致小鼠膽汁淤積的發(fā)生。該研究中首先選擇了DEHP 50、200 mg/(kg·d)兩種暴露劑量[13]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEHP 暴露劑量為200 mg/(kg·d)時，小鼠肝臟質(zhì)量及肝重指數(shù)均升高，以及血清與肝臟組織膽汁酸均顯著升高，其中血清TBA水平相比于對照組升高了3倍左右，結(jié)合病理結(jié)果，提示DEHP[200 mg/(kg·d)]暴露后導(dǎo)致小鼠膽汁淤積的發(fā)生，表明造模成功。

目前OCA主要作為針對單用UDCA效果不佳或不耐受的成年原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)的患者，有臨床研究[14]表明OCA可改善PBC患者的膽汁酸排泄。本研究中再給予OCA處理后，發(fā)現(xiàn)DEHP+OCA組小鼠的肝臟質(zhì)量、肝重指數(shù)、血清與肝臟組織中的TBA水平均顯著降低，包括其肝臟組織病理結(jié)果均明顯好轉(zhuǎn)，表明OCA后處理對DEHP[200 mg/(kg·d)]暴露誘導(dǎo)的膽汁淤積有顯著的保護(hù)作用。而FXR是機(jī)體膽汁酸代謝調(diào)控中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，F(xiàn)XR及其靶基因SHP在膽汁酸的合成、分解以及轉(zhuǎn)運(yùn)過程中均起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，F(xiàn)XR在這些過程中的調(diào)節(jié)缺陷可能會導(dǎo)致膽汁淤積和隨后的病理變化[15]。本研究結(jié)果顯示DEHP[200 mg/(kg·d)]處理后小鼠肝臟組織中FXR蛋白及其mRNA的表達(dá)均降低，且OCA處理后FXR的蛋白表達(dá)水平和FXR及其靶基因SHP的mRNA表達(dá)量均明顯升高，表明DEHP[200 mg/(kg·d)]暴露后導(dǎo)致膽汁淤積的發(fā)生可能與抑制FXR表達(dá)有關(guān)，而OCA的后處理可通過激活FXR及其靶基因SHP的表達(dá)，從而調(diào)控膽汁酸的代謝，對DEHP誘導(dǎo)的膽汁淤積起到保護(hù)作用。

本研究在動物模型中發(fā)現(xiàn)了DEHP暴露后導(dǎo)致小鼠膽汁淤積的發(fā)生，且OCA后處理對DEHP暴露導(dǎo)致膽汁淤積起到治療作用。此研究有助于對日常生活中塑化劑的使用做好預(yù)防工作以及針對膽汁淤積的治療提供新的思路，但DEHP暴露后導(dǎo)致鼠膽汁淤積具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。