靶向HER2和CLDN18.2的并聯(lián)嵌合抗原受體T細(xì)胞降低對(duì)胃癌的脫靶效應(yīng)

孟 濤，曾祥岳，金 博

胃癌是世界上第五大常見癌癥[1-2]。目前，手術(shù)切除是胃癌根治的唯一方法[3]，迫切需要開發(fā)新的治療手段以應(yīng)對(duì)這一難題?；谇逗峡乖荏w修飾的T細(xì)胞的免疫治療已經(jīng)被證明是一種很有前景的癌癥治療策略[4-5]。由于在實(shí)體腫瘤中缺乏特異性的腫瘤抗原，嵌合抗原受體T(chimericantigenreceptor T,CAR-T)細(xì)胞有可能造成嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)[6]。因此，發(fā)展限制潛在脫靶毒性的策略是必要的。研究人員利用“與”門邏輯，使得CAR-T細(xì)胞只有在同時(shí)識(shí)別兩種腫瘤相關(guān)抗原時(shí)才可以被充分激活[7]。該研究通過構(gòu)建雙嵌合抗原受體T細(xì)胞，分別靶向在胃癌中高表達(dá)的閉合蛋白18亞型2(claudin-18 isoform 2，CLDN18.2)和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2[8-9])，探討這種CAR-T細(xì)胞是否可以降低脫靶效應(yīng)，并發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞系 胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、MGC803和MKN45購自中科院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基中。

1.1.2主要試劑 Ficoll-Paque試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司；CD3+T細(xì)胞分選磁珠購自德國美天旎生物科技有限公司；人CD3/CD28激活磁珠購自美國Invitrogen公司；Polybrene購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；兔抗人CD3抗體、兔抗人HER2抗體和兔抗人CLDN18.2抗體購自美國Proteintech公司；FITC標(biāo)記的鼠抗人HER2抗體和PE標(biāo)記的鼠抗人CLDN18.2抗體以及FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體和PE標(biāo)記的鼠抗人CD8抗體購自美國ebioscience公司；鼠抗人GAPDH抗體和羊抗兔、羊抗鼠二抗購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司；DAB顯色試劑和蘇木精染色液購自武漢塞維爾生物科技有限公司；過表達(dá)CLDN18.2或HER2的慢病毒及過表達(dá)Cz或Hbb的慢病毒購自上海漢恒生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器 流式細(xì)胞儀(型號(hào)：FACSCanto II)購自 Becton-Dickinson公司；顯微鏡(型號(hào)：BX53)購自奧林巴斯公司。

1.2 Western blot檢測(cè)HER2和CLDN18.2的表達(dá)分別取1×106個(gè)AGS、MGC803和MKN45細(xì)胞，加入300 μl添加有蛋白酶抑制劑的RIPA試劑，冰上裂解30 min，之后12 000 r/min離心取上清液，加入5×loading buffer并煮沸變性，之后以每孔30 μg蛋白量進(jìn)行上樣，SDS-PAGE電泳后，使用200 mA轉(zhuǎn)膜條件轉(zhuǎn)膜90 min，將PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h，加入鼠抗人GAPDH抗體(1 ∶1 000)、兔抗人HER2抗體(1 ∶2 000)和兔抗人CLDN18.2抗體(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜，次日加入羊抗兔(1 ∶10 000)、羊抗鼠(1 ∶10 000)二抗，室溫孵育1 h，之后在曝光液孵育后進(jìn)行曝光。

1.3 慢病毒感染法構(gòu)建過表達(dá)CLDN18.2和HER2的AGS細(xì)胞系在6孔板中接種AGS細(xì)胞系，每孔3×105個(gè)，次日待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，分別加入50 μl過表達(dá)CLDN18.2或(和)HER2的慢病毒，并加入終濃度為6 μg/ml的polybrene，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，更換新鮮的培養(yǎng)基，在感染3 d后加入1.5 μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選培養(yǎng)，篩選5 d后即可得過表達(dá)CLDN18.2、過表達(dá)HER2以及同時(shí)過表達(dá)CLDN18.2和HER2的AGS細(xì)胞系，并分別命為C-AGS、H-AGS及CH-AGS。

1.4 慢病毒感染法構(gòu)建CAR-T細(xì)胞采集健康志愿者的10 ml外周血，采血流程經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：20210375)，且患者簽署知情同意書。按照制造商的說明，使用Ficoll-Paque試劑利用密度梯度離心法獲得外周血單核細(xì)胞，之后按照制造商的說明使用CD3+T細(xì)胞分選磁珠分離得到CD3+T細(xì)胞。取3×106個(gè)T細(xì)胞，加入75 μl人CD3/CD28激活磁珠，培養(yǎng)48 h后，以1×106個(gè)T細(xì)胞為基準(zhǔn)，分別加入Cz或(和)Hbb過表達(dá)慢病毒，并加入終濃度為8 μg/ml的polybrene，4 300 r/min離心60 min，靜置培養(yǎng)24 h后更換新鮮的培養(yǎng)基。培養(yǎng)3 d后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染陽性率，CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)分別命名為Cz、Hbb和CHbbz。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒感染效率和T細(xì)胞亞型的比例分別取6×105個(gè)C-AGS、H-AGS及CH-AGS細(xì)胞，均分為2份，一份加入同型對(duì)照抗體，另一份加入5 μl的FITC-HER2和PE- CLDN18.2抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

分別取3×105個(gè)Cz、Hbb和CHbbz細(xì)胞，PBS清洗3次后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中eGFP和mCherry的表達(dá)情況。

分別取3×105個(gè)Cz、Hbb和CHbbz細(xì)胞，加入5 μl的FITC-CD4和PE- CD8抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。所有數(shù)據(jù)使用Flowjo V10進(jìn)行分析。

1.6 LDH法檢測(cè)CAR-T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性取1×104個(gè)MGC803、MKN45、AGS、C-AGS、H-AGS及CH-AGS細(xì)胞置于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照1 ∶3、1 ∶1及3 ∶1的效靶比分別加入未感染的T細(xì)胞(Untransduced)、Cz、Hbb和CHbbz細(xì)胞，共孵育24 h，2 600 r/min離心10 min，吸取上清液，按照制造商的說明書使用LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清液中LDH的含量。細(xì)胞毒性的計(jì)算公式為：細(xì)胞毒性 (%)=(處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)×100%。

1.7 裸鼠移植瘤模型檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)抑瘤效果6周齡左右的裸鼠(20 g左右)購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：20210397)，動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。

取5×106個(gè)CH-AGS細(xì)胞重懸于100 μl PBS中，接種于裸鼠背部皮下，待腫瘤長(zhǎng)至80 mm3時(shí)，分別通過尾靜脈回輸1×107個(gè)Untransduced、Cz、Hbb和CHbbz細(xì)胞。

分別取5×106個(gè)AGS、C-AGS、H-AGS及CH-AGS細(xì)胞重懸于100 μl PBS中，接種于裸鼠背部皮下，待腫瘤長(zhǎng)至80 mm3時(shí)，分別通過尾靜脈回輸1×107個(gè)CHbbz。回輸后每2 d檢測(cè)一次腫瘤體積，體積計(jì)算公式為：體積=瘤長(zhǎng)(mm)×瘤寬(mm)2/2。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剖出腫瘤，進(jìn)行稱重。

1.8 免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中CD3+T細(xì)胞的含量取50 mg新鮮的腫瘤組織，使用多聚甲醛固定液固定48 h，之后經(jīng)過脫水包埋，將組織切成5 μm的薄片，脫蠟復(fù)水后滴加100 μl兔抗人CD3抗體(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，次日滴加100 μl羊抗兔二抗(1 ∶1 000)，室溫孵育1 h后，使用DAB顯色液進(jìn)行顯色，之后用蘇木精染液復(fù)染，蓋玻片封片后在顯微鏡下進(jìn)行拍照觀察。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞中CLDN18.2和HER2的表達(dá)Western blot(圖1A)以及流式細(xì)胞術(shù)(圖1B)檢測(cè)結(jié)果表明，胃癌細(xì)胞系MKN45和MGC803高表達(dá)CLDN18.2和HER2，然而AGS細(xì)胞系均不表達(dá)這兩種蛋白。此外，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒感染后的AGS細(xì)胞系，證明分別過表達(dá)CLDN18.2或HER2以及同時(shí)過表達(dá)CLDN18.2和HER2的AGS細(xì)胞系構(gòu)建成功(圖1C)。

圖1 CLDN18.2和HER2在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)A：Western blot檢測(cè)MKN45、AGS和MGC803中CLDN18.2和HER2的表達(dá)；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MKN45和MGC803中CLDN18.2和HER2的表達(dá)；C：流式細(xì)胞術(shù)分析工程化的AGS中CLDN18.2和HER2的表達(dá)

2.2 雙受體CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建以及表型分析兩種嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)見圖2A所示。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，Cz的陽性率為 (98±0.5)%，Hbb的陽性率為(79±2.1)%，雙受體的CHbbz的陽性率為(64±1.3)%(圖2B)。同時(shí)檢測(cè)了各類CAR-T細(xì)胞中CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，各類CAR-T細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞占比超過(80±3.8)%，具備良好的腫瘤殺傷潛力(圖2C、2D)。

圖2 不同工程化T細(xì)胞的性質(zhì)A：Cz和Hbb的結(jié)構(gòu)示意圖；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Cz、Hbb和CHbbz的陽性率；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)工程化T細(xì)胞中CD8+的表型；D：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)工程化T細(xì)胞中CD4+的表型

2.3 Cz和CHbbz在體外特異性殺傷CLDN18.2+及CLDN18.2+HER2+的腫瘤細(xì)胞將不同的CAR-T細(xì)胞分別與不同種類的腫瘤細(xì)胞共孵育，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cz和CHbbz對(duì)于靶細(xì)胞為CLDN18.2+的C-AGS及CLDN18.2+HER2+的CH-AGS、MGC803和MKN45均具有劑量依賴的殺傷活性，對(duì)于CLDN18.2-HER2-的AGS及CLDN18.2-HER2+的H-AGS則沒有細(xì)胞毒性，而Hbb對(duì)各種靶細(xì)胞均無細(xì)胞毒性(FC-AGS 1:1=13.72,FC-AGS 3:1=21.83,FCH-AGS 1:1=10.91,FCH-AGS 3:1=30.37,FMGC803 1:1=15.57,FMGC803 3:1=22.71,FMKN45 1:1=10.22,FMKN45 3:1=19.52，P<0.001),見圖3。

圖3 CAR-T細(xì)胞在指定效靶比條件下對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性與Untransduced比較：***P<0.001

2.4 CHbbz可以有效抑制胃癌細(xì)胞CH-AGS的體內(nèi)生長(zhǎng)在接種有CH-AGS的裸鼠移植瘤模型中，只有回輸CHbbz的組別可以有效抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而回輸Cz和Hbb均不能抑制腫瘤生長(zhǎng)(F=29.36,P<0.01；F=44.90，P<0.01)，見圖4A、4B。免疫組化結(jié)果表明，回輸CHbbz的腫瘤組織中CD3+T細(xì)胞產(chǎn)生浸潤，而回輸Cz和Hbb的腫瘤組織中幾乎沒有T細(xì)胞浸潤，見圖4C。

圖4 CAR-T細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性A：治療后CH-AGS腫瘤隨時(shí)間的瘤體積變化；B：治療結(jié)束后CH-AGS腫瘤的腫瘤質(zhì)量；C：免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中CD3的表達(dá) SP ×100；與Untransduced比較：**P<0.01

2.5 CHbbz僅對(duì)CLDN18.2+HER2+的腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用分別建立接種AGS、H-AGS、C-AGS和CH-AGS的裸鼠移植瘤模型，回輸CHbbz后發(fā)現(xiàn)其僅對(duì)CLDN18.2+HER2+的CH-AGS的腫瘤產(chǎn)生抑制活性，而對(duì)其他三種腫瘤均不能抑制其生長(zhǎng)(F=55.09,P<0.01；F=19.38，P<0.001)，見圖5A、5B。免疫組化結(jié)果表明，在接種CH-AGS的腫瘤組織中T細(xì)胞產(chǎn)生浸潤，而對(duì)于其他三種腫瘤組織中幾乎沒有T細(xì)胞浸潤，見圖5C。

圖5 CHbbz對(duì)CLDN18.2+ HER2+ 腫瘤細(xì)胞具有腫瘤抑制活性A：治療后各組腫瘤體積隨時(shí)間的變化；B：治療結(jié)束后各組的腫瘤質(zhì)量；C：免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中CD3的表達(dá) SP×100；與AGS比較：**P<0.01,***P<0.001

3 討論

嵌合抗原受體T細(xì)胞是一種很有前途的癌癥治療方法。然而，CAR-T細(xì)胞可能會(huì)因正常組織表達(dá)靶抗原而造成正常組織受損[10]。有報(bào)道稱，在回輸靶向CAIX的CAR-T細(xì)胞后，由于膽管上皮表達(dá)CAIX，造成了嚴(yán)重的肝臟毒性。更嚴(yán)重的，在靶向ErbB2的CAR-T細(xì)胞回輸后，已經(jīng)觀察到涉及患者死亡的嚴(yán)重不良事件[11]。降低這種嚴(yán)重不良事件的一種方法是將CAR的胞內(nèi)信號(hào)元件中的第一信號(hào)激活域和第二共刺激域物理隔離，將它們置于兩個(gè)不同的CAR中，這些CAR針對(duì)兩種不同的抗原，因此，這種靶向兩個(gè)抗原的CAR-T細(xì)胞與靶向單一抗原的CAR-T細(xì)胞相比脫靶概率會(huì)低得多。

本研究使用了兩種不同的CAR，分別靶向CLDN18.2和HER2，其中CLDN18.2負(fù)責(zé)調(diào)控CD3ζ信號(hào)，HER2負(fù)責(zé)調(diào)控4/1BB信號(hào)。之所以選擇這種組合策略，是由于CLDN18.2相較于HER2，其在胃癌中的表達(dá)特異性更強(qiáng)[8-9]，因此作為第一信號(hào)域的控制因素，可以進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤特異性。在體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)靶細(xì)胞只表達(dá)CLDN18.2或同時(shí)表達(dá)CLDN18.2和HER2時(shí)，Cz和CHbbz都發(fā)揮劑量依賴的細(xì)胞毒作用，且二者之間并無差異。造成這一結(jié)果的原因可能是在體外共孵育條件下，CAR-T細(xì)胞和靶細(xì)胞直接接觸，在較高的抗原密度下，CD3ζ信號(hào)足夠強(qiáng)烈，已經(jīng)可以發(fā)揮較強(qiáng)的腫瘤殺傷效應(yīng)，使得在短期的刺激過程中，Cz和CHbbz沒能表現(xiàn)出差異。但在體內(nèi)研究中，CHbbz具有抗腫瘤活性，而Cz未能表現(xiàn)出足夠的腫瘤抑制活性，這可能是由于在體內(nèi)研究中，沒有共刺激信號(hào)的Cz不能有效擴(kuò)增，因此不能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。同樣的，先前有研究[12]表明，CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的抗腫瘤效果和其在體內(nèi)的擴(kuò)增以及持續(xù)時(shí)間相關(guān)。除此之外，體內(nèi)研究顯示，CHbbz只有在腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CLDN18.2和HER2時(shí)才可以發(fā)揮腫瘤抑制活性，表明其發(fā)生脫靶的概率降低。

約50%的胃癌患者高表達(dá)HER2，是一個(gè)非常明確的胃癌靶標(biāo)，已經(jīng)有靶向HER2的ADC藥物獲FDA突破性藥物資格，用于治療胃癌[13]。CLDN18.2是CLDN-18的胃特異性亞型。CLDN18.2特異性人鼠嵌合單克隆抗體IMAB362的臨床數(shù)據(jù)顯示，其對(duì)正常組織無毒性作用，且對(duì)胃癌患者的總體客觀反應(yīng)約為10%[13]。這些數(shù)據(jù)表明，CLDN18.2是一個(gè)非常有希望的治療胃癌的靶點(diǎn)。因此，以CLDN18.2和HER2為靶點(diǎn)的雙受體CAR-T細(xì)胞是一個(gè)非常理想的胃癌治療組合。

雙靶向CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤能力較差，推測(cè)CAR-T細(xì)胞的雙靶向結(jié)構(gòu)不是簡(jiǎn)單地分離兩個(gè)信號(hào)域。一些未知因素也可能影響最終的治療效果。有研究[14]表明，scFv的結(jié)構(gòu)可能影響下游信號(hào)及其最終的抗腫瘤活性。因此后續(xù)仍需要繼續(xù)優(yōu)化雙CAR的結(jié)構(gòu)，如更換scFv，來提高CHbbz的腫瘤抑制能力。此外，由于目前還沒有可以模擬人類CLDN18.2和HER2表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，CHbbz的真實(shí)脫靶情形仍不能過早的下定論。本研究只能表明CLDN18.2和HER2特異性CAR-T細(xì)胞對(duì)單靶點(diǎn)組織的殺傷作用非常輕微，但真正的作用只能在未來的臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)。

總之，本研究表明靶向CLDN18.2和HER2的雙受體CAR-T細(xì)胞可以降低脫靶毒性發(fā)生的概率，并抑制胃癌的生長(zhǎng)，是一種胃癌治療的潛在策略。