沉默肌動(dòng)蛋白樣6A對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響

林振宇，董慶泰，張建新，鐘 彬，張 濤，尚作宏，殷 微，李中虎，馬丹丹，金煒東,

胰腺癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率逐年上升，其5年生存率小于8%[1]。2020年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在185個(gè)國(guó)家36種惡性腫瘤中，胰腺癌是腫瘤導(dǎo)致死亡的主要原因之一，排名第7位[2]。其具有早期診斷率低，中晚期時(shí)常伴隨著病灶轉(zhuǎn)移，療效欠佳且預(yù)后差等特點(diǎn)。因此提高胰腺癌的早期診斷率，尋找新的腫瘤基因治療靶點(diǎn)迫在眉睫。

ACTL6A 基因編碼肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白家族成員，并且與傳統(tǒng)的肌動(dòng)蛋白具有顯著的氨基酸序列同源性。ACTL6A是ATP依賴性SWI/SNF樣BRG1/BRM相關(guān)因子復(fù)合體的重要組成部分，參與人體內(nèi)多種生理過(guò)程，包括囊泡運(yùn)輸、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、紡錘體定向、核遷移和染色質(zhì)重塑[3]。ACTL6A與前列腺癌[4]、肝癌[5]、膠質(zhì)瘤[6]、膽管癌[7]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但目前其在胰腺癌中的表達(dá)和作用尚不明確，該研究主要通過(guò)探討沉默ACTL6A對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡的影響，分析ACTL6A在胰腺癌中的細(xì)胞生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)差異分析利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢索ACTL6A在胰腺癌組織及正常胰腺組織中的基因表達(dá)差異。在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)篩選“ACTL6A”基因，設(shè)定條件為：“normalvscancer”、“pancreatic cancer”、“mRNA”，獲得各個(gè)研究中胰腺癌組織與正常胰腺組織中的表達(dá)情況，并行薈萃分析。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染① SW1990細(xì)胞系培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。② 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，待貼壁后，使用陽(yáng)離子脂質(zhì)載體Lipofectamine 2000將沉默ACTL6A質(zhì)粒及siRNA陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞作為siRNA-ACTL6A組與siRNA-NC組。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期siRNA-ACTL6A組與siRNA-NC組細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48 h后加入10% CCK-8試劑，每孔10 μl，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h。最后進(jìn)行檢測(cè)(酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm)，記錄吸光度(absorbance, A)值。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡用胰酶消化siRNA-ACTL6A組與siRNA-NC組細(xì)胞，5 000 r/min離心5 min，重懸后制成細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1.0×105/ml，接種于96孔板中，每孔中加入細(xì)胞懸液0.2 ml，培養(yǎng)48 h后，PBS清洗2次；低溫下加入Binding Buffer重懸細(xì)胞。室溫避光條件下取100 μl細(xì)胞懸液加入5 μl的AnnexinV-FITC和Propidium Iodide，靜置10 min。最后加入400 μl Binding Buffer混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)用胰酶消化siRNA-ACTL6A組與siRNA-NC組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，取沉淀用DMEM重懸，形成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/ml。每孔取100 μl細(xì)胞懸液并接種到含有無(wú)血清培養(yǎng)基的Transwell小室上層中。下室內(nèi)加入500 μl有血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。置入配養(yǎng)箱中培育24 h后，在室溫下每孔加入1 ml 4%多聚甲醛固定15 min，用PBS洗去甲醛，棉簽擦去上室未遷移細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫染液染色15 min，自然風(fēng)干后在顯微鏡下以200倍放大觀察染色細(xì)胞。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)用胰酶消化siRNA-ACTL6A組與siRNA-NC組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，取沉淀用DMEM重懸，形成單細(xì)胞懸液，鋪于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿貼壁，用10 μl消毒槍頭垂直劃痕，PBS洗3次，使用顯微鏡記錄此時(shí)的細(xì)胞圖像并記錄劃痕寬度，記為0 h；加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后再用拍攝顯微鏡記錄此時(shí)的細(xì)胞圖像并記錄劃痕寬度，放大圖片倍數(shù)為200倍。

1.7 GSEA富集分析收集癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中ACTL6A在胰腺癌中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。以胰腺癌患者ACTL6A mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)為分割點(diǎn)將患者劃分ACTL6A高表達(dá)組與ACTL6A低表達(dá)組。基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)是基于JAVA語(yǔ)言的一款基因富集分析軟件，本研究利用GESA軟件進(jìn)行KEGG通路富集分析。每次分析進(jìn)行1 000次基因組排列。校正P值及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)均小于0.05的基因組被認(rèn)為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 ACTL6A mRNA在胰腺癌組織及正常胰腺組織中的基因表達(dá)差異Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中有4項(xiàng)子研究符合篩選條件。4項(xiàng)子研究分別為BadeaPancreas、Lacobuzio-Donahue Pancreas2、Pei Pancreas及Segara Pancreas，共包含117個(gè)胰腺癌組樣本及66個(gè)正常胰腺組織樣本。對(duì)其進(jìn)行薈萃分析，結(jié)果顯示ACTL6A在胰腺癌組織中的表達(dá)水平高于正常胰腺組織(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 ACTL6A在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)差異

2.2 沉默ACTL6A抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖CCK-8法實(shí)驗(yàn)表明，與siRNA-NC組相比，siRNA-ACTL6A組胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖能力明顯下降，在24、48 h吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。表明沉默ACTL6A抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。

表1 CCK-8法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞的增殖

2.3 沉默ACTL6A促進(jìn)了胰腺癌SW1990細(xì)胞的凋亡細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，siRNA-ACTL6A組的凋亡率明顯高于siRNA-NC組(t=12.192,P<0.001)，表明沉默ACTL6A明顯促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的凋亡。

圖2 沉默ACTL6A促進(jìn)SW1990細(xì)胞的凋亡與siRNA-NC組比較：***P<0.001；Q1區(qū)：機(jī)械損傷；Q2區(qū)：晚期凋亡或壞死；Q3區(qū)：早期凋亡細(xì)胞；Q4區(qū)：正常存活

2.4 沉默ACTL6A抑制了胰腺癌SW1990細(xì)胞的侵襲Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，siRNA-ACTL6A組侵襲細(xì)胞數(shù)較siRNA-NC組明顯減少(t=4.464,P<0.05)。表明沉默ACTL6A抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲。

圖3 沉默ACTL6A抑制SW1990細(xì)胞的侵襲 ×200與siRNA-NC組比較：*P<0.05

2.5 沉默ACTL6A抑制了胰腺癌SW1990細(xì)胞的遷移劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，48 h后siRNA-ACTL6A組愈合率較siRNA-NC組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.960,P<0.05)。表明沉默ACTL6A抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移。

圖4 沉默ACTL6A抑制SW1990細(xì)胞的遷移 ×200與siRNA-NC組比較：*P<0.05

2.6 GSEA信號(hào)通路富集分析GSEA研究結(jié)果顯示：ACTL6A mRNA高表達(dá)組在細(xì)胞周期通路、核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)、DNA復(fù)制、癌癥信號(hào)通路、NOTCH信號(hào)通路等相關(guān)基因集出現(xiàn)上調(diào)(P<0.05)。當(dāng)ACTL6A基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，上述通路被激活。結(jié)果如表2和圖5所示。

圖5 基因集GSEA的富集圖

表2 高表達(dá)ACTL6A的GSEA富集結(jié)果

3 討論

胰腺癌因其高侵襲性和轉(zhuǎn)移性，目前治療該疾病仍然面臨諸多困難。隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展，分子靶向治療已成為胰腺癌診療的熱點(diǎn)。由于缺乏胰腺癌特異的分子靶點(diǎn)，不利于胰腺癌的早期診斷、治療及預(yù)后的評(píng)估。因此深入探索胰腺癌發(fā)病潛在的分子靶點(diǎn)對(duì)于疾病的診療至關(guān)重要。

研究表明，ACTL6A在多種癌癥中高度表達(dá)，Jin et al[4]發(fā)現(xiàn)，同正常前列腺組織相比，ACTL6A 在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著升高，并且與雄激素受體的表達(dá)密切相關(guān)。Xiao et al[5]同樣發(fā)現(xiàn)，ACTL6A 于人肝細(xì)胞癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)。在膠質(zhì)瘤組織中的ACTL6A表達(dá)水平高于正常腦組織且ACTL6A的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[6]。本研究中，Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示ACTL6A在胰腺癌組織中的表達(dá)水平高于正常胰腺組織。與相關(guān)文獻(xiàn)[4-6]報(bào)道一致，均有力證實(shí)ACTL6A在胰腺癌中高表達(dá)。

本研究中，體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沉默ACTL6A抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，并促進(jìn)其凋亡。研究[8]顯示ACTL6A在卵巢癌中過(guò)表達(dá)，并且ACTL6A過(guò)表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。體外沉默ACTL6A可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并降低葡萄糖利用、乳酸生成和丙酮酸水平。Shrestha et al[9]發(fā)現(xiàn)ACTL6A可促進(jìn)鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并且ACTL6A基因敲除可顯著抑制其細(xì)胞生物學(xué)功能。在膽管癌組織中，ACTL6A呈現(xiàn)異常表達(dá)，沉默ACTL6A基因后，人膽管癌QBC939細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到明顯抑制[7]。Jian et al[10]研究發(fā)現(xiàn)ACTL6A的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)，而沉默ACTL6A則抑制了乳腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。本研究結(jié)果證實(shí)ACTL6A在胰腺癌中表現(xiàn)為癌基因特性，可能具備作為胰腺癌新治療靶點(diǎn)的潛力。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌相關(guān)基因突變多集中于DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、TGF-β信號(hào)通路、染色質(zhì)調(diào)節(jié)、軸突導(dǎo)向通路等[11]。Zhong et al[12]研究發(fā)現(xiàn)在急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)患者中ACTL6A的表達(dá)異常升高，其體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默ACTL6A基因能夠促進(jìn)NB4和HL-60細(xì)胞的分化，表明ACTL6A在APL分化中具有重要作用，進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，ACTL6A是通過(guò)SOX2和Notch1信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的分化。Xiao et al[5]研究表明ACTL6A通過(guò)激活NOTCH信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，ACTL6A不僅通過(guò)SOX2激活NOTCH1信號(hào)通路，而且還通過(guò)SOX2影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。Zhang et al[8]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織中，ACTL6A和PGK1的表達(dá)呈正相關(guān)，ACTL6A過(guò)表達(dá)增加PGK1表達(dá)，而敲低ACTL6A則相反。ACTL6A表達(dá)改變通過(guò)下調(diào)PGK1抑制卵巢癌細(xì)胞體內(nèi)致瘤性。在喉鱗癌細(xì)胞中，ACTL6A的敲除抑制了Yes相關(guān)蛋白(YAP)介導(dǎo)的信號(hào)通路的激活，而YAP的重新激活顯著逆轉(zhuǎn)了ACTL6A沉默介導(dǎo)的喉鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制[13]。Li et al[14]研究發(fā)現(xiàn)ACTL6A的表達(dá)可能通過(guò)S6K1/pS6通路促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞周期的再分配來(lái)影響細(xì)胞的增殖和DNA合成。本研究中，利用GSEA富集分析預(yù)測(cè)ACTL6A在胰腺癌中發(fā)揮功能的可能信號(hào)通路，結(jié)果顯示ACTL6A在胰腺癌中發(fā)揮功能的可能信號(hào)通路有細(xì)胞周期通路、NOTCH信號(hào)通路等，與文獻(xiàn)[5,14]報(bào)道一致。除此之外，還有核苷酸切除修復(fù)信號(hào)通路、堿基切除修復(fù)信號(hào)通路、DNA復(fù)制信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路等，可為ACTL6A在胰腺癌中的機(jī)制研究提供更多線索和思路。