低氧預(yù)適應(yīng)對小鼠海馬HT22細胞線粒體能量代謝的影響

齊瑞芳，李 娜，王立軍，呂 軍，石瑞麗，馬寶慧，時靜華，郝肖瓊，邵 國

氧氣作為線粒體電子傳遞鏈的最終電子受體，在有氧呼吸和新陳代謝中起著關(guān)鍵作用。正常情況下，真核細胞需要足夠濃度的氧氣來維持各種生物活動并確保存活。當需氧量超過其供應(yīng)量時，全身或局部組織中的氧含量降低(稱為低氧)，導(dǎo)致代謝危機，威脅生理功能和生存能力[1]。主要涉及的疾病包括腦卒中、新生兒缺氧性疾病和各種神經(jīng)退行性疾病等[2]。

缺血/低氧預(yù)適應(yīng)(ischemic/hypoxia preconditioning， I/HPC)通過預(yù)先暴露于亞致死性的缺血/低氧，增加對隨后嚴重缺血/低氧的耐受，它是一種內(nèi)源性細胞保護機制[3-4]。該研究通過體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)細胞HT22，檢測HPC對HT22細胞中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和活性氧 (reactive oxygen species，ROS)水平的影響，驗證HPC對細胞能量代謝的影響，并檢測可能涉及的機制—雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mTOR) /自噬通路，為HPC對缺血/低氧等疾病的診療提供有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞 小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞系購自北京協(xié)和細胞所。

1.1.2試劑與儀器 RIPA裂解液、ATP和ROS檢測試劑盒購自杭州碧云天生物技術(shù)公司，兔抗mTOR、磷酸化mTOR (Ser2448)多克隆抗體購自美國CST公司；驢抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Alexa FluorTM594山羊抗兔IgG購自美國Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司， LysoTrackerTM探針購自美國Invitrogen公司。蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜設(shè)備購自美國Bio Rad公司，化學(xué)發(fā)光儀購自上海天能科技有限公司，激光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 實驗方法

1.2.1HT22細胞培養(yǎng) 使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HT22細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.2.2細胞誘導(dǎo)分化及分組 培養(yǎng)HT22細胞，鏡下觀察細胞長至40%～50%的融合度后對細胞進行誘導(dǎo)分化。用含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化培養(yǎng)24 h。誘導(dǎo)劑的成分有：100×N2-添加劑、50 ng/ml β神經(jīng)生長因子、0.1 mol/L D0627和0.1 mol/L P1269四種成分，7 ml培養(yǎng)基中各成分的體積分別為：400、10、4、40 μl。完成后的HT22細胞分為對照組、低氧組和HPC組。

1.2.3低氧預(yù)適應(yīng)細胞模型建立方法 對照組細胞是21% O2常氧環(huán)境下培養(yǎng)。低氧組細胞先在1% O2的低氧環(huán)境下培養(yǎng)13 h，接著常氧環(huán)境下培養(yǎng)6 h。而HPC組細胞是低氧環(huán)境下培養(yǎng)30 min，后換至常氧環(huán)境培養(yǎng)30 min，如此交替進行4個循環(huán)，接著在低氧環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)13 h，復(fù)氧6 h，完成模型制備[5]。

1.2.4ATP檢測 按照1.2.2項和1.2.3項方法對細胞進行處理。采用ATP試劑盒檢測HT22細胞的ATP水平。冰上每孔加入裂解緩沖液200 μl，待細胞充分裂解后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；ATP檢測試劑用ATP檢測試劑稀釋劑按1 ∶100的比例稀釋，將100 μl ATP檢測試劑滴入檢測孔中；靜置3～5 min后，滴加待測試劑20 μl；混合液體，間隔2 s后進行測試。根據(jù)標準曲線計算樣品中ATP的濃度。最后，ATP濃度除以BCA法檢測到的樣品蛋白濃度即可。

1.2.5ROS水平檢測 采用ROS試劑盒檢測各組HT22細胞ROS水平。細胞誘導(dǎo)分化生長24 h后，HT22細胞密度長至70 %左右時，將細胞收集在EP管中，DCFH-DA孵育20 min，用不含血清的DMEM洗滌細胞3次。用細胞計數(shù)器計數(shù)，用200 μl PBS懸浮，最后用熒光酶標儀測定DCF，使用488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長檢測。

1.2.6Western blot 將模型制備完畢的樣品中加入100 μl RIPA裂解液，并分別加入1 μl蛋白酶及磷酸酶抑制劑常規(guī)進行超聲輔助裂解，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液采用BCA法進行蛋白定量。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣濃度：每孔15 μg蛋白。電泳條件：上層濃縮膠10 mA，恒流，下層分離膠15 mA，恒流；接著恒流400 mA轉(zhuǎn)膜過夜，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，使用TBST漂洗3次，每次10 min；4 ℃孵育一抗(1 ∶1 000)過夜。TBST漂洗3次，每次10 min，室溫孵育二抗(1 ∶1 000)1 h；TBST漂洗3次，每次10 min，ECL發(fā)光，采用Image J進行圖像灰度值測定[6]。

1.2.7細胞免疫熒光 將HT22細胞按照每孔5×103個種至24孔板中，每孔中放置1個玻片，按照1.2.2項和1.2.3項方法對細胞進行處理；24 h后，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定。室溫PBS洗3次，每次5 min；用0.2% Triton X-100進行細胞通透，室溫孵育15 min；10%山羊血清室溫封閉30 min；孵育P-mTOR抗體(1 ∶300)，4 ℃過夜；用1%BSA-PBS洗滌，60 r/min漂洗3次，每次5 min；孵育二抗(1 ∶500)，室溫孵育2 h，注意避光；用1%BSA-PBS清洗，60 r/min漂洗2次，每次5 min，去離子水再清洗1次；取出玻片，并將有細胞的一面扣在滴有DAPI(含防淬滅劑)的載玻片上，中性樹膠封片，激光共聚焦顯微鏡掃描拍照，NIS-Elements AR Analysis軟件檢測并分析數(shù)據(jù)。

1.2.8LysoTrackerTM探針檢測溶酶體 按照5×103/孔的密度將HT22細胞接種至24孔板中，每孔中放置一個玻片，培養(yǎng)24 h，細胞生長密度至60%左右，然后按照1.2.3項方法進行HPC和低氧實驗?zāi)Ｐ?。模型制備結(jié)束后，吸出培養(yǎng)基，用終濃度50 nmol/L的LysoTrackerTM試劑孵育細胞2 h，加入培養(yǎng)基，激光共聚焦掃描拍照，NIS-Elements AR Analysis軟件檢測并分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 HPC上調(diào)ATP水平ATP檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，低氧組ATP水平明顯降低，而HPC組與對照組相比有所下降但要高于低氧組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，n=6)，見圖1。

圖1 HPC增加HT22細胞中ATP濃度與對照組比較：*P<0.05, **P<0.01；與低氧組比較: #P<0.05

2.2 HPC降低ROS水平通過檢測不同組別中ROS水平發(fā)現(xiàn)，低氧組ROS水平高于對照組和HPC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，n=6)，見圖2。提示HT22細胞在急性低氧復(fù)氧刺激后，ROS水平明顯升高，而HPC可以降低ROS的水平。

圖2 HPC可下調(diào)ROS的水平與對照組比較：*P<0.05；與低氧組比較: #P<0.05

2.3 HPC降低磷酸化mTOR蛋白表達Western blot法檢測HT22細胞中總mTOR和P-mTOR蛋白的表達，結(jié)果顯示，HPC對總mTOR蛋白表達沒有明顯的影響，但可下調(diào)P-mTOR蛋白的表達(P<0.01，n=6)，HPC組比低氧組稍有增加(P<0.05，n=6)，見圖3A、3B。P62蛋白作為自噬底物，HPC組明顯少于對照組(P<0.01，n=6)，見圖3A、3B。細胞免疫熒光染色法檢測P-mTOR蛋白的結(jié)果與Western blot的結(jié)果一致，見圖3C、3D。

圖3 HPC可下調(diào)P-mTOR蛋白的表達A：不同組別中各蛋白的Western blot典型圖片；B：不同組別中P-mTOR和P62蛋白相對表達量；C：不同組別中P-mTOR蛋白免疫熒光染色 ×400；D：不同組別中P-mTOR蛋白相對熒光強度；a:對照組; b:低氧組; c:HPC組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與低氧組比較: #P<0.05

2.4 HPC增加HT22細胞溶酶體染色與對照組相比，HT22細胞暴露于低氧及HPC后溶酶體染色明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，n=6)，而與低氧組相比，HPC組溶酶體染色有所增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，n=6)。見圖4。

圖4 HPC增加溶酶體染色 ×400a:對照組; b:低氧組; c:HPC組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與低氧組比較: #P<0.05

3 討論

哺乳動物對缺氧的反應(yīng)有多種機制。急性低氧刺激頸動脈體化學(xué)感受器引發(fā)呼吸急劇增加，以及慢性一系列的變化，例如通過靶向促紅細胞生成素和血管內(nèi)皮生長的缺氧誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)紅細胞增殖和血管生成因子[7]。線粒體占細胞耗氧量的大部分，產(chǎn)生ATP是需氧過程。低氧時，線粒體中的電子傳遞鏈和氧化磷酸化首先受到影響，從而破壞細胞呼吸的完整性。除此之外，線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物是ROS產(chǎn)生的主要場所。線粒體可以通過產(chǎn)生ROS和代謝物來影響細胞信號傳導(dǎo)[8]。而HPC作為一種內(nèi)源性神經(jīng)保護機制可能涉及多個過程，如低氧信號通路的激活、抗炎、抗氧化應(yīng)激和自噬誘導(dǎo)等[9]。

本研究通過體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)細胞HT22，檢測HPC對HT22細胞ATP和ROS水平的影響，觀察HPC對HT22細胞能量代謝的影響。結(jié)果顯示，HPC可上調(diào)HT22細胞ATP含量，降低ROS水平，并且可下調(diào)磷酸化mTOR蛋白表達，激活自噬，從而發(fā)揮保護作用。本課題組前期研究[6]結(jié)果顯示HPC可增加LC3Ⅱ/Ⅰ的表達，為HPC可能通過激活自噬提供進一步實驗數(shù)據(jù)。此外，本研究顯示，HPC組磷酸化mTOR的表達高于低氧組，而P62在低氧組表達較低，提示自噬的增加除了mTOR參與之外可能還涉及了其他分子機制，需要進一步研究。

在正常情況下，人體具有有效的內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化失衡的一種狀態(tài)，可由ROS產(chǎn)生過多或清除ROS的能力下降引起。I/HPC可以降低 ROS 的水平并增加抗氧化酶的水平，以防止神經(jīng)元損傷[9]。Tan et al[10]報道HPC 可防止 SH-SY5Y 細胞中的氧化應(yīng)激，其保護機制可能涉及由 HPC 產(chǎn)生的 ROS 誘導(dǎo)的自噬激活引起的。Wu et al[11]報道HPC改善了星形膠質(zhì)細胞線粒體功能并減少了氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation，OGD) 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，是通過下調(diào)神經(jīng)元凋亡和ROS水平。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果是一致的，HPC可通過減少ROS的產(chǎn)生從而減輕HT22細胞氧化應(yīng)激損傷。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞生長和代謝的中樞調(diào)節(jié)劑，可整合各種生長抑制信號，如葡萄糖、ATP 和氧氣的消耗[12]。同時，mTOR 信號通路也是蛋白質(zhì)合成和細胞代謝的中央調(diào)節(jié)器，以響應(yīng)能量、營養(yǎng)和自噬的變化[13]。自噬是一種進化上保守且依賴溶酶體的過程，用于降解和回收細胞成分。當自噬激活時，溶酶體活動可能也會加快。Lu et al[14]報道，在SY5Y細胞中，HPC通過Hif-1α/Beclin1通路介導(dǎo)的自噬保護神經(jīng)細胞免受OGD損傷。TSC1(hamartin)通過誘導(dǎo)自噬賦予對缺血的神經(jīng)保護[15]。本研究結(jié)果與上述結(jié)果也一致，說明自噬可能被HPC誘導(dǎo)，發(fā)揮保護作用。但并不是所有的自噬都是保護作用，只有適度的自噬才能發(fā)揮保護作用，而過度的自噬可能促進細胞的死亡。