自噬激活在抑制丙泊酚誘導的神經(jīng)元凋亡中的作用

梅 靜，喇宏玲，徐桂萍

隨著醫(yī)療水平的進步，越來越多老齡患者選擇手術治療。雖然不少老人原發(fā)疾病成功治愈，但術后認知功能障礙發(fā)生率正不斷增加[1]。嚴重影響了老年患者生存狀態(tài)和生活質量。丙泊酚是一種臨床常用的鎮(zhèn)靜、麻醉藥物，具有起效快、易于控制劑量、無明顯蓄積等優(yōu)點。但已有不少文獻[2-3]報道丙泊酚在老齡患者的應用中常引起術后認知功能障礙，其涉及機制主要為海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡。

神經(jīng)元凋亡是細胞程序性死亡方式，神經(jīng)元自噬是細胞自我分解代謝過程。凋亡與自噬信號調控之間存在復雜的交織，自噬過度激活或抑制都可能造成細胞凋亡[4]。已有研究[5-6]顯示，神經(jīng)元自噬與凋亡都分別參與了丙泊酚誘導的大鼠術后認知功能障礙的過程。因此，該研究探討自噬的激活與抑制對丙泊酚誘導的神經(jīng)元凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器丙泊酚乳狀注射液(100 mg/10 ml，批號：2019050901，西安立邦制藥有限公司)；丙泊酚原料藥(10 mmol/L，批號：HY-294057，純度≥99.0%，美國MCE公司)；雷帕霉素(10 mmol/L，批號：HY-3501-2196，純度≥99.0%，美國MCE公司)；氯喹(25 g，批號：018J5342，純度≥99.0%，美國Sigma公司)；PI/Annexin V染色試劑盒(美國Thermo公司)；TUNEL染色試劑盒(德國Roche公司)；鼠源單克隆Anti-mTOR抗體、兔源多克隆Anti-Beclin-1、鼠源單克隆Anti-Bcl-2抗體、兔源多克隆Anti-Bax(武漢三鷹生物技術有限公司)；兔源單克隆重組Anti-LC3抗體、兔源單克隆重組Cleaved-caspase-3抗體(美國Abcam公司)；鼠源單克隆Anti-β-actin抗體、HRP標記山羊抗鼠/兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技術有限公司)。流式細胞儀(型號：Cyto Flex，貝克曼庫爾特生命科學公司)；生物顯微鏡(型號：BX53，日本Olympus公司)；電子透射顯微鏡(型號：CX7 Pro，美國Thermo公司)；顯影儀(型號：5100R，上海天能生物技術公司)。

1.2 試驗方案

1.2.1離體試驗 取2×106個原代神經(jīng)元接種于96孔板中，分為對照組、丙泊酚組、雷帕霉素組、氯喹組。二甲氧唑黃比色法[2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide,XTT]檢測不同濃度丙泊酚對細胞活力的影響，流式細胞術檢測100 μmol/L雷帕霉素與20 μmol/L氯喹干預對丙泊酚誘導細胞凋亡的改善作用，Western blot檢測自噬與凋亡蛋白表達。

1.2.2在體試驗 32只老齡大鼠，雄性，SPF級，12月齡，體質量500～600 g，由新疆醫(yī)科大學動物試驗中心提供。適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為對照組、丙泊酚組、雷帕霉素組與氯喹組。取非對照組大鼠，腹腔注射丙泊酚乳狀注射液，劑量100 mg/kg，持續(xù)1周。大鼠麻醉期間，雷帕霉素組大鼠連續(xù)1周注射雷帕霉素，劑量50 mg/kg，氯喹組大鼠連續(xù)1周注射氯喹，劑量10 mg/kg。接下來，Morris水迷宮檢測大鼠認知功能，TUNEL 染色檢測大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，電子透射顯微鏡觀察細胞內自噬小體數(shù)量，Western blot檢測自噬與凋亡相關蛋白表達。

1.3 原代神經(jīng)元提取與給藥取E16～18孕鼠，解剖后獲得胎鼠，解剖出完整大腦，分離去除軟膜、血管。取海馬組織，用眼科剪反復剪切成碎塊，消化，以培養(yǎng)基混懸，取40 μm篩網(wǎng)過濾制成單細胞懸液。離心收集沉淀，加入培養(yǎng)基，取6孔板每孔接種約1×107細胞。培養(yǎng)3～4 d后，0.25%胰酶消化后用于后續(xù)檢測。

1.4 XTT檢測取加藥處理完成的細胞，每孔加入100 μl 含PMS的XTT染色液，37 ℃避光孵育2 h，在酶標儀450 nm波長處測定吸光度值(absorbance value, A)。細胞凋亡比例=(A對照孔-A試驗孔)/(A對照孔-A背景孔)×100%

1.5 流式細胞術取加藥處理完成的細胞，胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌，加入PI與Annexin V染色液，避光孵育5 min。流式細胞儀檢測PI與Annexin V陽性細胞表達比例。

1.6 Morris水迷宮試驗Morris水迷宮試驗分為訓練期與測試期。訓練期將大鼠自各個象限依次放入水中，自由游泳尋找逃生平臺(位于第Ⅲ象限)，共90 s。若大鼠登上站臺，則記錄這段時間為逃避潛伏期。若大鼠90 s內無法登上平臺則引導至平臺，記逃避潛伏期為90 s，連續(xù)訓練4 d。第5天開展測試，撤去逃生平臺，將大鼠放入水中，自由探索90 s，記錄大鼠游泳速率，首次穿越逃生平臺象限時間，穿越逃生平臺次數(shù)及90 s內在第Ⅲ象限中停留時間占比。

1.7 TUNEL 染色取大鼠心臟灌流，取腦組織，4%多聚甲醛固定，4 ℃儲存?zhèn)溆?。取腦組織梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切成厚度3～5 μm切片，PBS清洗，加入含0.5% Triton X-100的PBS孵育5 min。取切片滴加蛋白酶K孵育15 min，PBS清洗。滴加TUNEL反應混合液，37 ℃避光孵育60 min。PBS清洗，滴加streptavidin-HRP工作液，避光孵育30 min。PBS清洗，滴加DAB顯色液，室溫孵育3 min終止。生物顯微鏡下觀察，深棕色染色細胞為TUNEL陽性細胞。

1.8 高爾基染色取大鼠海馬組織，在齒狀回區(qū)截取約1 mm3組織，固定在預冷的2.5%戊二醛中，4 ℃儲存。次日，PBS洗滌，以預冷的1%鋨酸固定2 h，再以PBS洗滌，梯度丙酮脫水。以丙酮/環(huán)氧樹脂復合物浸透包埋組織，37 ℃下過夜。修塊后使用超薄切片機將組織切成60～80 nm超薄切片，最后應用5%醋酸鈾浸潤0.5～1 h，枸櫞酸鉛染色5～10 min，雙蒸水清洗后封片。利用電子透射顯微鏡觀察各組細胞內溶酶體與自噬小體數(shù)量。

1.9 Western blot收集細胞與大鼠腦組織樣本，勻漿后裂解收集蛋白，煮沸變性后冷凍保存。制備SDS-PAGE電泳凝膠，等量樣品上樣。電泳條件設為4 ℃、30 V / 30 min，100 V / 60 min，當上樣緩沖液達到凝膠底部則終止。通過濕法將凝膠上目標蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件設為4 ℃、2 mA / 60 min。取PVDF膜放入封閉液中封閉2 h，4 ℃孵育一抗抗體稀釋液(1 μg/ml)過夜。次日PBST清洗條帶，以二抗稀釋液(0.5 μg/ml)室溫孵育2 h。PBST清洗PVDF膜，PVDF膜上滴加ECL超敏發(fā)光液，通過顯影儀顯影獲得目的蛋白發(fā)光條帶。

2 結果

2.1 自噬激活改善丙泊酚誘導神經(jīng)元凋亡隨著丙泊酚濃度增加，原代神經(jīng)元細胞活力不斷下降。由于丙泊酚濃度為50 μmol/L時，細胞活力降低至(82.85±2.97)%，而當濃度達到100 μmol/L時，細胞活力降低至(65.94±3.36)%。本研究接下來細胞試驗中選擇丙泊酚劑量為50 μmol/L。流式細胞術檢測顯示，對照組神經(jīng)元Annexin V+/ PI+(Q1)區(qū)幾乎沒有凋亡細胞。在丙泊酚干預下，與對照組相比，神經(jīng)元Q1區(qū)凋亡細胞占比增加(P<0.001)。然而，在雷帕霉素干預下，Q1區(qū)凋亡細胞比例降低(P<0.001)。與此同時，氯喹干預雖然提高了丙泊酚誘導原代神經(jīng)元細胞凋亡，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 原代神經(jīng)元中細胞凋亡檢測結果A：XTT檢測不同濃度丙泊酚對原代神經(jīng)元的影響；B：Annexin V+/ PI+(Q1)區(qū)量化統(tǒng)計結果；C：流式細胞術檢測自噬對丙泊酚誘導原代神經(jīng)元的影響；與對照組比較：###P<0.001；與丙泊酚組比較：***P<0.001

2.2 自噬激活減少了原代神經(jīng)元中凋亡相關蛋白表達與對照組相比，丙泊酚干預造成細胞凋亡，適應性調節(jié)了自噬相關蛋白的表達，其中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ與Beclin-1表達增加(P<0.001)。但是，這無法逆轉丙泊酚造成的神經(jīng)元凋亡。因此，丙泊酚組中Cleaved-caspase-3、Bax表達增加(P<0.001)，且Bcl-2表達減少(P<0.001)。此外，與丙泊酚組相比，雷帕霉素干預進一步提高了LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ (P<0.001)與Beclin-1表達(P<0.01)，且凋亡相關蛋白Cleaved-caspase-3、Bax表達減少(P<0.001)，且Bcl-2表達增加(P<0.01)。與此同時，丙泊酚、氯喹對p-mTOR蛋白表達的影響很小，且與丙泊酚組相比，氯喹的干預降低了LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ (P<0.05)與Beclin-1表達(P<0.001)，但對凋亡相關蛋白表達沒有影響。見圖2。

圖2 原代神經(jīng)元中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、p-mTOR、Beclin-1、Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達與對照組比較：##P<0.01, ###P<0.001；與丙泊酚組比較：*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

2.3 自噬激活改善丙泊酚誘導大鼠學習記憶功能障礙Morris水迷宮訓練中，隨著大鼠訓練次數(shù)增加，各組逃避潛伏期都出現(xiàn)了降低。自第3天起，與對照組相比，丙泊酚組大鼠逃避潛伏期增加(P<0.05)，且在第4天，與丙泊酚組相比，雷帕霉素組大鼠逃避潛伏期減少(P<0.05)。然而，與丙泊酚組相比，氯喹組大鼠逃避潛伏期相似。在測試中，各組大鼠游泳速率沒有改變，與對照組相比，丙泊酚組大鼠首次到達平臺時間增加(P<0.01)，在第Ⅲ象限停留時間(P<0.01)與穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)。與丙泊酚組相比，雷帕霉素組大鼠首次到達平臺時間減少(P<0.01)，且第Ⅲ象限停留時間占比增加(P<0.05)。與此同時，氯喹對大鼠水迷宮測試相關指標沒有影響。見表1、2。

表1 各組大鼠水迷宮訓練期間逃避潛伏期時長比較

表2 各組大鼠水迷宮測試期間游泳速率、首次到達平臺時間、第Ⅲ象限停留時間占比與穿越平臺次數(shù)比較

2.4 自噬激活的大鼠神經(jīng)元細胞中自噬小體數(shù)量增加大鼠海馬神經(jīng)元高爾基染色顯示，與對照組相比，丙泊酚組中自噬小體數(shù)量沒有變化。與丙泊酚組相比，雷帕霉素組自噬小體數(shù)量增加，且氯喹組自噬小體數(shù)量減少。見圖3。

圖3 各組大鼠腦組織海馬神經(jīng)元中自噬小體數(shù)量 ×10 000A：對照組；B：丙泊酚組；C：雷帕霉素組；D：氯喹組；紅色箭頭：自噬小體

2.5 自噬激活改善丙泊酚誘導大鼠海馬神經(jīng)元凋亡大鼠海馬神經(jīng)元TUNEL染色顯示，與對照組相比，丙泊酚組與氯喹組中TUNEL染色陽性細胞數(shù)量增加(P<0.001)，與丙泊酚組相比，雷帕霉素組TUNEL染色陽性細胞數(shù)量減少(P<0.01)，且氯喹組陽性細胞數(shù)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元TUNEL染色與量化統(tǒng)計 ×200A：對照組；B：丙泊酚組；C：雷帕霉素組；D：氯喹組；SO：定向層；SP：錐體層；SR：輻射層；與對照組比較：###P<0.001；與丙泊酚組比較：**P<0.01

2.6 自噬激活減少丙泊酚誘導大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關蛋白表達與對照組相比，丙泊酚和氯喹對p-mTOR表達沒有影響，但雷帕霉素降低了p-mTOR表達水平(P<0.001)。與對照組相比，丙泊酚組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ與Beclin-1表達沒有變化，且丙泊酚組中Cleaved-caspase-3、Bax表達增加(P<0.001)，Bcl-2表達減少(P<0.001)。與丙泊酚組相比，雷帕霉素干預提高了LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ (P<0.001)與Beclin-1表達(P<0.01)，而凋亡相關蛋白Cleaved-caspase-3、Bax表達減少(P<0.001)，且Bcl-2表達增加(P<0.001)。此外，與丙泊酚組相比，氯喹干預后的細胞內LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin-1與凋亡相關蛋白表達沒有改變。見圖5。

圖5 各組大鼠腦組織中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、p-mTOR、Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax 表達與對照組比較：###P<0.001；與丙泊酚組比較：**P<0.01, ***P<0.001

3 討論

術后認知功能障礙是一種老齡患者常見的全麻手術并發(fā)癥，老齡患者中，全麻手術后1周內術后認知功能障礙發(fā)生率高達25%，部分患者癥狀會持續(xù)到術后3個月[7]。丙泊酚是一類臨床常用的麻醉誘導劑，具有誘導迅速、蘇醒迅速、劑量易控制且對血液循環(huán)影響低的優(yōu)點[8]。然而，不少研究[2-3]顯示丙泊酚會引起患者或試驗動物認知功能障礙。本研究以丙泊酚多次麻醉大鼠，通過Morris水迷宮分析大鼠認知功能，評價大鼠行為學習與空間記憶能力。結果顯示，訓練期間，丙泊酚組大鼠逃避潛伏期比對照組延長，且在第5天測試中，丙泊酚組大鼠在第Ⅲ象限停留時間占比與穿越平臺次數(shù)減少。因此，本研究中大鼠術后認知功能障礙模型構建成功。與此同時，本研究顯示，自噬激動劑雷帕霉素治療后降低了丙泊酚麻醉小鼠逃避潛伏期。此外，相關研究[9-10]顯示丙泊酚可以通過減少氧化應激反應改善大鼠認知功能，本研究與之相悖，其原因可能是文獻中丙泊酚作為治療藥物使用，劑量較低，發(fā)揮了中樞神經(jīng)保護作用。與本研究中低劑量丙泊酚正向調節(jié)原代海馬神經(jīng)元細胞活力的結果相一致。

海馬是哺乳動物學習與記憶的重要區(qū)域，海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡是大鼠認知功能損傷的主要原因[11]。Li et al[12]研究在20月齡老年大鼠中，以100 mg/kg丙泊酚麻醉誘導，再以50 mg/kg麻醉維持3 h，造成大鼠術后1～2周內出現(xiàn)了明顯的認知功能障礙。屠海軍 等[13]研究也有顯示，在2月齡成年大鼠中，300 mg/kg丙泊酚麻醉會降低大鼠海馬組織內谷氨酸含量，并升高γ-氨基丁酸水平，導致大腦神經(jīng)元正常興奮難以維繼，最終造成神經(jīng)元凋亡，出現(xiàn)認知功能障礙。這些研究證實了丙泊酚會損傷大鼠海馬神經(jīng)元。本研究結果顯示，丙泊酚可使離體原代神經(jīng)元細胞活力降低。大鼠海馬神經(jīng)元中，TUNEL染色結果顯示，丙泊酚組大鼠海馬出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡。在此過程中，無論是離體原代神經(jīng)元還是海馬區(qū)神經(jīng)元，都伴隨著凋亡蛋白Cleaved-caspase-3與Bax表達增加，且抑凋亡蛋白Bcl-2表達減少。然而，在自噬誘導劑雷帕霉素的干預下，凋亡蛋白Cleaved-caspase-3與Bax表達減少，抑凋亡蛋白Bcl-2表達增加。

自噬是通過形成自噬小體將細胞內異常蛋白或受損細胞器包裹，與溶酶體融合，最終通過溶酶體將自噬底物降解，以獲得能量循環(huán)，維持細胞穩(wěn)態(tài)的一種生理活動。LC3本是自由散布于細胞質中，在一系列酶促作用下定位于自噬體膜上，并向LC3 Ⅱ轉變，調節(jié)自噬小體的形成。由于LC3 Ⅱ是特異性分布的自噬體泡膜上的蛋白，所以LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ 比值可作為自噬體形成數(shù)量多少的指標[14]。Beclin-1是自噬的正向調節(jié)因子，與Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)結合后可促進自噬的發(fā)生[15]。雷帕霉素是一種自噬激動劑，通過抑制mTOR蛋白磷酸化誘導自噬的發(fā)生[16]。而自噬抑制劑氯喹則是通過抑制PI3K表達，減少PI3K與Beclin-1形成復合物，從而阻斷自噬的發(fā)生[17]。本研究結果顯示，丙泊酚雖然造成神經(jīng)元凋亡，但自噬相關蛋白表達增加，這可能是機體出現(xiàn)損傷后的適應性保護行為。雷帕霉素治療則誘導自噬相關蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ與Beclin-1表達增加，自噬小體數(shù)量增加，抑制了神經(jīng)元凋亡。然而，氯喹對丙泊酚誘導后神經(jīng)元凋亡沒有影響，甚至存在部分加劇的情況。這提示激活自噬都能夠有效減少神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，丙泊酚不僅誘導了神經(jīng)元凋亡，還啟動了機體代償性的自噬功能。雖然丙泊酚激活自噬的原因仍有待探討，但抑制mTOR信號則是激活自噬的最有效途徑。因此，以mTOR抑制劑雷帕霉素干預抑制了mTOR信號活化，提高了細胞自噬水平，并改善了神經(jīng)元凋亡。