經(jīng)尿道聯(lián)合灌注SCL和Cx43基因慢病毒對(duì)糖尿病膀胱功能的影響

軒留明，馬路平，歐陽(yáng)松，孫 鵬，譚明輝，張永強(qiáng)，王勤章

糖尿病發(fā)展過(guò)程中，可導(dǎo)致多系統(tǒng)并發(fā)癥，其中泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的是糖尿病膀胱病變(diabetic cystopathy, DCP)，發(fā)生率為25%～87%[1]。目前DCP的發(fā)病機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，研究[2]顯示哺乳動(dòng)物膀胱內(nèi)有一種Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal, ICC)，并證實(shí)ICC可能是膀胱逼尿肌興奮的起搏細(xì)胞。有學(xué)者在DCP組織中發(fā)現(xiàn)ICC數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)被破壞，并明確ICC損傷是DCP發(fā)病原因之一[3]。細(xì)胞縫隙鏈接蛋白-43(connexin 43, Cx43)表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)DCP的發(fā)生[4]。前期課題組通過(guò)尿道向豚鼠DCP中灌注干細(xì)胞白血病(stem cell leukemia, SCL)基因慢病毒，恢復(fù)ICC的數(shù)量及功能，但膀胱功能恢復(fù)欠佳[5]。筆者推測(cè)在DCP中，ICC及Cx43都有一定的損害，僅僅恢復(fù)ICC的數(shù)量及結(jié)構(gòu)時(shí)，細(xì)胞間信息傳遞功能尚未恢復(fù)，其膀胱功能恢復(fù)欠佳。該研究通過(guò)制作豚鼠糖尿病膀胱模型，向膀胱內(nèi)聯(lián)合灌注SCL和Cx43基因重組慢病毒，通過(guò)尿流動(dòng)力學(xué)檢查和激光共聚焦顯微鏡評(píng)估膀胱功能及ICC和Cx43變化情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)荷蘭種健康雄性豚鼠90只，2～3月齡，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(新)2020-0003，體質(zhì)量(345±7) g。飼養(yǎng)條件：室溫21～24℃，相對(duì)濕度50%～80%。

1.2 試劑與儀器SCL基因重組慢病毒、Cx43基因重組慢病毒(上海吉?jiǎng)P公司)，鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)(貨號(hào)：S0130，美國(guó)Sigma 公司)，C-kit一抗(貨號(hào)：SNBP1-43359，美國(guó)NOVUS公司)，Cx43一抗(貨號(hào)：ab235585，美國(guó) Abcam公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗小鼠和TRITC標(biāo)記抗兔免疫熒光染色二抗(貨號(hào)：ZF-0311，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。尿流動(dòng)力學(xué)檢查儀(型號(hào)：PRC 026632，加拿大Laborie公司)，激光共聚焦顯微鏡(型號(hào)：LSM510，德國(guó)Carl Zeiss 公司)。

1.3 方法

1.3.1豚鼠DCP模型的制備 90只健康豚鼠正常飼養(yǎng)1周后禁食8 h，根據(jù)體質(zhì)量，一次性腹腔注射STZ(200 mg/kg)制作糖尿病膀胱模型。6 周后檢測(cè)隨機(jī)血糖，連續(xù)監(jiān)測(cè)4周，以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為界線篩選出糖尿病豚鼠[6]。將符合標(biāo)準(zhǔn)的豚鼠分籠繼續(xù)正常飼養(yǎng)2周。有研究[7]顯示2周后糖尿病豚鼠出現(xiàn)尿頻、尿急、尿潴留等糖尿病膀胱的相應(yīng)表現(xiàn)，行尿流動(dòng)力學(xué)檢查，豚鼠出現(xiàn)逼尿肌收縮無(wú)力、借助腹壓排尿等特點(diǎn)，認(rèn)為豚鼠DCP模型建立成功。

1.3.2經(jīng)尿道灌注SCL、Cx43基因重組慢病毒 從糖尿病豚鼠中隨機(jī)挑選40只豚鼠，隨機(jī)分成4組：糖尿病組、SCL組、Cx43組、SCL+Cx43組，禁食8 h，使用七氟烷吸入麻醉，將麻醉好的豚鼠取仰臥位，使用一次性導(dǎo)尿包，將特制導(dǎo)尿管插入膀胱，在豚鼠恥骨聯(lián)合上方膀胱區(qū)輕輕按壓促使排出殘余尿液或?qū)⑵渚徛槌?，使用無(wú)菌生理用水沖洗膀胱3次后灌注病毒。前期課題組研究[8]顯示SCL和Cx43慢病毒的最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicities of infection, MOI)為2×107TU/0.2 ml。SCL組和Cx43組灌注慢病毒液0.2 ml，SCL+Cx43慢病毒組灌注SCL和Cx43基因慢病毒液各0.2 ml，糖尿病組灌注空病毒液0.2 ml。灌注完畢后，使用特制陰莖夾，夾住豚鼠陰莖2 h后將其繼續(xù)放回籠中飼養(yǎng)。

1.3.3膀胱尿流動(dòng)力學(xué)檢查 豚鼠用水合氯醛(300 mg/kg)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后將豚鼠固定于操作臺(tái)上，使用石蠟油潤(rùn)滑特制導(dǎo)尿管，順豚鼠陰莖尿道口緩慢插入膀胱，插入膀胱后使用1 ml注射器將膀胱內(nèi)尿液緩慢抽出，使用三通閥將特制尿道管分別于測(cè)壓管及灌注管相連接，使用特制直腸測(cè)壓管與尿動(dòng)力儀腹壓壓力感受器相連接，每根管連接之前排出空氣。將灌注管排出空氣后與微量注射泵連接，灌注液為無(wú)菌生理用水，設(shè)置灌注泵灌注速度為10 ml/h。開(kāi)啟所有操作后體內(nèi)調(diào)零，當(dāng)有尿液尿出后，記錄此時(shí)的尿流動(dòng)力學(xué)相關(guān)的數(shù)值，包括最大膀胱壓(maximum vesical pressure, Pves Max)、膀胱壓(vesical pressure, Pves)、腹壓(abdominal pressure, Pabd)、逼尿肌壓力(detrosur pressure, Pdet)以及曲線變化，連續(xù)記錄5個(gè)排尿周期。

1.3.4激光共聚焦顯微鏡觀察ICC及Cx43表達(dá) 膀胱組織進(jìn)行冰凍切片，丙酮固定10 min；使用PBS浸洗3次，每次5 min(可放在搖床，調(diào)節(jié)合適速度，充分浸洗)；PBS浸洗后擦去多余液體，每張切片滴加5% BSA+0.5% Triton X-100封閉1 h(放入濕盒內(nèi)，避免干片)；同法PBS浸洗后，滴加一抗，確保組織可以被完全覆蓋，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜； 調(diào)節(jié)恒溫浴箱溫度為37 ℃，切片浸洗后，滴加二抗放入孵育箱2 h(滴加二抗以后全程避光操作)；切片浸洗，DAPI染核1 min；切片滴加抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片；使用激光共聚焦顯微鏡觀察ICC和Cx43的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 DCP模型建立按照豚鼠體質(zhì)量一次性腹腔注射STZ(200 mg/kg) 6周后，有5只豚鼠死亡，考慮與應(yīng)激或STZ的毒性有關(guān)，85只豚鼠存活，均出現(xiàn)“三多一少”等糖尿病臨床表現(xiàn)。在注射6周后，連續(xù)監(jiān)測(cè)4周隨機(jī)血糖，以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為條件篩選出糖尿病豚鼠，造模成功率達(dá)95.3%。行尿流動(dòng)力學(xué)檢查，此時(shí)糖尿病豚鼠出現(xiàn)膀胱容量增加、順應(yīng)性降低、逼尿肌收縮無(wú)力、腹壓排尿等特點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 豚鼠DCP模型造模前后尿動(dòng)力學(xué)檢查對(duì)比A：豚鼠DCP造模前；B：豚鼠DCP造模后

2.2 尿流動(dòng)力學(xué)檢查結(jié)果SCL+Cx43組與糖尿病組、SCL組、Cx43組比較，Pdet增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SCL+Cx43組與糖尿病組、SCL組、Cx43組比較，腹壓下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), SCL+Cx43組與糖尿病組、SCL組、Cx43組比較，Pves增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。糖尿病組、SCL組、Cx43組的Pdet、Pabd、Pves之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、3。

圖2 經(jīng)尿道灌注基因后四組尿流動(dòng)力學(xué)檢查對(duì)比A：糖尿病組；B：SCL組；C：Cx43組；D：SCL+Cx43組

圖3 四組Pdet、Pabd、Pves參數(shù)對(duì)比A：糖尿病組；B：SCL組；C：Cx43組；D：SCL+Cx43組；與SCL+Cx43組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 激光共聚焦顯微鏡檢查結(jié)果糖尿病組可見(jiàn)ICC樣細(xì)胞的數(shù)量減少并且梭形雙極結(jié)構(gòu)明顯被破壞，沿胞體沿伸的突起消失，出現(xiàn)細(xì)胞裂解狀態(tài)。Cx43組與SCL組可見(jiàn)ICC樣細(xì)胞的梭形雙極結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)但數(shù)量上沒(méi)有明顯改變。其中SCL組在細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞突起方面的改善明顯優(yōu)于Cx43組，Cx43組的細(xì)胞結(jié)構(gòu)未呈現(xiàn)明顯的梭形結(jié)構(gòu)，但沿胞體方向沿伸的細(xì)胞突起有一定的改善。SCL組的ICC樣細(xì)胞有明顯的梭形結(jié)構(gòu)，細(xì)胞突起也有明顯的恢復(fù)，但I(xiàn)CC樣細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯增多。SCL+Cx43組的ICC樣細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的梭形雙極結(jié)構(gòu)，數(shù)量明顯增多，ICC樣細(xì)胞之間有細(xì)胞突起連接，相鄰的ICC樣細(xì)胞之間緊密連接，形成ICC二聚體結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖4。

圖4 四組激光共聚焦顯微鏡結(jié)果 ×400

3 討論

研究[2]顯示膀胱逼尿肌中ICC細(xì)胞與腸道ICC相似，具有類(lèi)似的形態(tài)學(xué)和免疫表型，主要分布在膀胱頂部和三角區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)ICC樣細(xì)胞可能是膀胱逼尿肌的起搏細(xì)胞[9]，ICC細(xì)胞表面存在酪氨酸蛋白激酶受體(C-kit蛋白)，C-kit與其配體—干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF) 結(jié)合后啟動(dòng)SCF/C-kit信號(hào)通路，對(duì)ICC細(xì)胞的發(fā)育、分化及表型維持至關(guān)重要。在C-kit基因調(diào)控區(qū)上存在SCL結(jié)合位點(diǎn)，SCL主要是通過(guò)作用于C-kit 基因啟動(dòng)子調(diào)節(jié)C-kit 表達(dá)來(lái)發(fā)揮其“生存基因”的功能，既而影響ICC的結(jié)構(gòu)及功能。

在糖尿病長(zhǎng)期發(fā)展引起的膀胱病變中，ICC樣細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞，數(shù)量減少，從而引起ICC樣細(xì)胞相關(guān)功能減弱，出現(xiàn)DCP。前期課題組成員通過(guò)建立豚鼠DCP模型和體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)ICC等方式，結(jié)果顯示體內(nèi)及體外高糖環(huán)境下ICC樣細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞，膀胱功能出現(xiàn)障礙[10]。前期課題組成員通過(guò)尿道向膀胱灌注SCL基因重組慢病毒并成功轉(zhuǎn)染膀胱，發(fā)現(xiàn)SCL基因可以在Cajal樣細(xì)胞中表達(dá)[11]，使ICC樣細(xì)胞的數(shù)量及結(jié)構(gòu)有一定程度恢復(fù)，但對(duì)膀胱功能只起到部分改善作用，課題組成員推測(cè)在DCP中，受損的不僅僅是ICC樣細(xì)胞，其信號(hào)通路也有一定的損害。ICC細(xì)胞與各細(xì)胞之間以及其他細(xì)胞間依靠豐富的細(xì)胞連接進(jìn)行信號(hào)分子、離子及物質(zhì)交換，有研究[12]表明Cx43是其主要成分，當(dāng)細(xì)胞之間的連接方式被破壞，蛋白表達(dá)異常，則細(xì)胞之間進(jìn)行信息、物質(zhì)傳遞的功能出現(xiàn)障礙，這是導(dǎo)致糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的主要病因之一。Cx43在膀胱逼尿肌中也有分布，在DCP中，ICC及Cx43的數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)及電生理功能等出現(xiàn)一定程度的損害，最終影響膀胱的生理功能。研究[13]表明，在DCP膀胱中，Cx43的結(jié)構(gòu)被破壞，其細(xì)胞間通訊功能降低，電信號(hào)傳輸異常，動(dòng)作電位無(wú)法正常傳導(dǎo)。

通過(guò)上述研究的結(jié)果，筆者對(duì)DCP的發(fā)病機(jī)制有了全新的認(rèn)識(shí)并且有了新的推測(cè)，在DCP中，ICC樣細(xì)胞和Cx43都出現(xiàn)了損害，當(dāng)單獨(dú)恢復(fù)ICC或者Cx43的功能時(shí)，細(xì)胞起搏信號(hào)以及信號(hào)傳導(dǎo)通路都不能恢復(fù)正常，為了驗(yàn)證上述推論，課題組進(jìn)行了初步研究。

通過(guò)一次性腹腔注射1%STZ制作豚鼠糖尿病模型，12周后使用尿流動(dòng)力學(xué)檢查篩選出符合DCP標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病模型，豚鼠出現(xiàn)逼尿肌收縮無(wú)力、腹壓排尿、殘余尿量增加、膀胱順應(yīng)性下降等糖尿病膀胱特點(diǎn)，與前期研究[14]結(jié)果相符。通過(guò)吸入麻醉方式麻醉豚鼠，豚鼠糖尿病膀胱模型成功后，豚鼠機(jī)體應(yīng)激能力降低，采用吸入麻醉可減小對(duì)豚鼠的刺激，保證存活率。麻醉成功后使用特制尿管插入豚鼠膀胱進(jìn)行慢病毒灌注，通過(guò)尿道灌注可貼近臨床實(shí)際情況，避免不必要的損傷。前期課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示病毒灌注最佳MOI濃度為2×107TU/0.2 ml，可滿足大多數(shù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)需求[8]。另外，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在灌注14 d后行qRT-PCR和Western blot檢測(cè)顯示C- kit在mRNA和蛋白水平上的轉(zhuǎn)染效果較轉(zhuǎn)染2、7、28 d更好[15]，這也提示最佳藥物半衰期可能為14 d左右。

通過(guò)灌注慢病毒14 d后行尿流動(dòng)力學(xué)檢查，SCL+Cx43組與糖尿病組、SCL組、Cx43組相比，在Pdet、Pves、Pabd方面的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示在DCP膀胱中，SCL聯(lián)合Cx43可改善ICC細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及數(shù)量，并且使細(xì)胞間的信號(hào)通路也有改善，使ICC細(xì)胞產(chǎn)生的起搏信號(hào)電位變化傳導(dǎo)至效應(yīng)器，最終使膀胱收縮功能有一定程度的改善。SCL組、Cx43組、糖尿病組之間Pves、Pdet、Pabd差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，筆者考慮單一灌注SCL或Cx43，膀胱收縮信號(hào)傳導(dǎo)通路功能恢復(fù)不完全，動(dòng)作電位產(chǎn)生不夠或者下傳受阻，最終導(dǎo)致膀胱功能改善欠佳。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，SCL+Cx43組的ICC樣細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)其梭形雙極結(jié)構(gòu)，數(shù)量也有增多，沿細(xì)胞胞體方向沿伸的細(xì)胞突起將ICC樣細(xì)胞連接在一起形成ICC二聚體結(jié)構(gòu)，有研究[16]通過(guò)膜片鉗技術(shù)檢測(cè)顯示膀胱ICC二聚體的內(nèi)向電流明顯高于單體ICC細(xì)胞，ICC二聚體之間有廣泛的細(xì)胞突起相互連接，提示ICC二聚體是膀胱收縮主要的起搏細(xì)胞，說(shuō)明SCL聯(lián)合Cx43可使ICC樣細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及數(shù)量有所恢復(fù)，并且在功能上也有改善，為膀胱發(fā)揮功能提供基礎(chǔ)。當(dāng)單一灌注SCL或Cx43時(shí)，ICC樣細(xì)胞結(jié)構(gòu)或細(xì)胞突起及細(xì)胞間連接改善不明顯，可能導(dǎo)致膀胱功能恢復(fù)欠佳。