NGF中和抗體、DAPT對食管癌Eca109細胞p75NTR核表達及細胞增殖、侵襲能力的影響

鄧江華，李秋實，朱兵兵，陳晶晶，慕曉玲

食管癌(esophageal cancer，EC)一直以來都因其高發(fā)病率和死亡率而備受關(guān)注，據(jù)2020年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率居全球癌癥發(fā)病的第7位，死亡率居第6位[1]。腫瘤干細胞理論的提出以及近年來的研究進展為食管癌的靶向治療提供了新途徑。

p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)可作為食管癌的腫瘤標(biāo)志物，同時也是神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)的受體。本課題組李秋霞 等[2]發(fā)現(xiàn)食管癌Eca109細胞不僅表達且自分泌NGF，并通過對比NGF處理前后p75NTR在Eca109細胞及細胞球中的核表達變化，推斷NGF促進了p75NTR向細胞核轉(zhuǎn)移。本研究將繼續(xù)探討NGF中和抗體、γ-分泌酶抑制劑3,5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸-t-丁酯(3,5-difluorophenylacetyl-L-alanyl-S-ph -enylglycine-t-butyl ester, DAPT)對Eca109細胞p75NTR核表達的影響，用NGF處理所有Eca109細胞，同時單獨或聯(lián)合使用NGF中和抗體、DAPT處理，通過分析p75NTR、Ki67的表達變化，進一步證實NGF和γ-分泌酶對p75NTR向細胞核轉(zhuǎn)移的促進作用，并探究NGF中和抗體、DAPT對Eca109細胞增殖能力和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料人食管鱗癌Eca109細胞(中國科學(xué)院上海細胞庫)；高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serm，F(xiàn)BS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶(美國Gibco公司)；青鏈霉素混合液(雙抗)(上海索萊寶生物科技有限公司)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色液、DAPT(美國Sigma公司)；外源性重組人NGF、小鼠抗人Ki67單克隆抗體、兔抗人NGF單克隆抗體、兔抗人p75NTR單克隆抗體(英國Abcam公司)；山羊抗兔 IgG-FITC二抗、山羊抗鼠IgG-TRITC二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；1.2 μm孔徑Matrigel Matrix基質(zhì)膠(美國BD公司)；24孔Transwell小室(美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞準(zhǔn)備 Eca109細胞接種于含10%FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24～48 h期間，用普通光學(xué)顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，選取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2免疫熒光細胞化學(xué)檢測 取對數(shù)生長期的細胞，以外源性重組人NGF(100 ng/ml)處理細胞6 h，對于使用NGF中和抗體、DAPT單獨或聯(lián)合處理細胞，則是在加入外源性重組人NGF(100 ng/ml)的基礎(chǔ)上分別加入NGF中和抗體(兔抗人NGF單克隆抗體，1 ∶2 500)、DAPT(10 μmol/L)以及聯(lián)合加入NGF中和抗體(1 ∶2 500)和DAPT(10 μmol/L)，均處理24 h。用含EDTA的胰蛋白酶消化，1 000 r/min 離心5 min，再用含10%FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞后進行細胞計數(shù)，細胞以8×103個/ml濃度滴加在放有蓋玻片的6孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行細胞爬片，24 h后取出蓋玻片進行固定以及封閉。用稀釋好的一抗(兔抗人p75NTR單克隆抗體、小鼠抗人Ki67單克隆抗體，均為1 ∶100)充分覆蓋進行孵育，4 ℃過夜。次日復(fù)溫后用PBS泡洗(泡洗3次，每次3 min)，滴加稀釋好的熒光二抗(山羊抗兔IgG-FITC、山羊抗鼠IgG-TRITC，均為1 ∶100)，室溫孵育2 h后再用PBS泡洗(泡洗3次，每次3 min)，DAPI染色10 min，用PBS泡洗(泡洗3次，每次3 min)，封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察著色部位及熒光強度。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖情況 按照CCK-8試劑盒說明書進行操作，將細胞用含EDTA的胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，稀釋成1×105個/ml濃度，按每孔100 μl接種至96孔板，單獨或聯(lián)合加入NGF、NGF中和抗體和DAPT，并設(shè)空白組(未作任何處理)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，分別于24、48、72 h滴加CCK-8工作液(每孔10 μl)，孵育2 h。酶標(biāo)儀450 nm處檢測各孔吸光度(optical density，OD)值，對結(jié)果進行記錄、統(tǒng)計，并描繪細胞增殖曲線。

1.2.4Transwell細胞侵襲實驗 用無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠(基質(zhì)膠 ∶培養(yǎng)基=1 ∶8)，稀釋后的工作液加入上室面，4 ℃條件下晾干。吸棄殘余培養(yǎng)基，各孔均加入60 μl含有10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)基，37℃作用30 min。用無血清培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)為1×105/ml，取100 μl加入上室，下室加入600 μl含有20%FBS的培養(yǎng)基，去除氣泡，放入培養(yǎng)箱，48 h后取出Transwell小室，棄去上室內(nèi)的培養(yǎng)基和基質(zhì)膠，用棉簽拭去上室殘留的細胞，特別是邊緣，將棉簽弄尖沿壁轉(zhuǎn)一圈，4%多聚甲醛固定20 min。0.1%結(jié)晶紫染色后用PBS洗去殘留染液，每個小室在顯微鏡下選取上、下、左、右、中5個200×視野的細胞，對顯色細胞進行計數(shù)。對于單獨或聯(lián)合應(yīng)用NGF、NGF中和抗體和DAPT處理的細胞，則是預(yù)先加入處理劑培養(yǎng)24 h，再進行Transwell細胞侵襲實驗。

2 結(jié)果

2.1 NGF、NGF中和抗體和DAPT對Eca109細胞p75NTR、Ki67表達的影響結(jié)果顯示，兩種蛋白在細胞上均有表達，其中Ki67熒光在NGF處理前后均位于細胞核；p75NTR熒光在NGF處理前，位于細胞核的數(shù)量很少，主要位于細胞質(zhì)，在NGF處理后，p75NTR熒光位于細胞核的數(shù)量增多，見圖1。

圖1 NGF對Eca109細胞p75NTR、Ki67、DAPI表達的影響 ×200

此外，為了進一步觀察NGF中和抗體、DAPT對p75NTR核表達的影響，課題組在用NGF處理所有Eca109細胞的同時，單獨或聯(lián)合加入NGF中和抗體、γ-分泌酶抑制劑DAPT處理后檢測p75NTR、Ki67的表達定位。結(jié)果顯示，NGF中和抗體、γ-分泌酶抑制劑DAPT處理后，p75NTR和Ki67在細胞中均有表達，與NGF中和抗體、DAPT處理前相比，Ki67熒光在Eca109細胞中仍全都位于細胞核，p75NTR熒光位于細胞核的數(shù)量均減少，且NGF中和抗體和DAPT聯(lián)合使用后，p75NTR熒光位于細胞核的數(shù)量最少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=106.074，P<0.001)，見圖2、3。

圖2 NGF聯(lián)合NGF中和抗體、DAPT對Eca109細胞p75NTR、Ki67、DAPI表達的影響 ×200

圖3 p75NTR核定位表達統(tǒng)計結(jié)果A：NGF組；B：NGF+NGF中和抗體組；C：NGF+DAPT組；D：NGF+NGF中和抗體+DAPT組；與NGF組比較：***P<0.001，****P<0.000 1；與NGF+NGF中和抗體+DAPT組比較：##P<0.01

2.2 NGF中和抗體、DAPT對Eca109細胞增殖能力的影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示，NGF中和抗體、DAPT對Eca109細胞的增殖能力均有抑制作用，且使用NGF中和抗體和DAPT聯(lián)合處理細胞，其抑制作用較單獨使用更強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.261，P<0.001)，見圖4。

圖4 NGF中和抗體、DAPT對Eca109細胞增殖能力的影響與空白組比較：***P<0.001；與NGF中和抗體+DAPT組比較：##P<0.01

此外，為了進一步觀察在NGF作用下，NGF中和抗體、DAPT對Eca109細胞增殖能力的影響，用NGF處理所有Eca109細胞，同時單獨或聯(lián)合使用NGF中和抗體、DAPT處理細胞，結(jié)果顯示，Eca109細胞的增殖能力同樣被抑制，且NGF中和抗體和DAPT聯(lián)合處理的抑制作用較單獨使用也更強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=148.086，P<0.001)，見圖5。

圖5 NGF作用下NGF中和抗體、DAPT對Eca109細胞增殖能力的影響與NGF組比較：***P<0.001；與NGF+NGF中和抗體+DAPT組比較：##P<0.01

2.3 NGF中和抗體、DAPT對Eca109細胞侵襲能力的影響Transwell細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，經(jīng)NGF中和抗體、DAPT處理后，穿膜細胞數(shù)量明顯減少，因細胞侵襲能力的大小與穿膜細胞數(shù)量呈正相關(guān)，即經(jīng)NGF中和抗體、DAPT處理后，Eca109細胞的侵襲能力降低，且使用NGF中和抗體和DAPT聯(lián)合處理細胞，其抑制作用較單獨使用更強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=63.13，P<0.001)，見圖6。

圖6 NGF中和抗體、DAPT對Eca109細胞侵襲能力的影響 ×200A：空白組；B：NGF中和抗體組；C：DAPT組；D：NGF中和抗體+DAPT組；與空白組比較：*P<0.05，***P<0.001，****P<0.000 1；與NGF中和抗體+DAPT組比較：#P<0.05，###P<0.001

同樣地，用NGF處理所有Eca109細胞，同時單獨或聯(lián)合使用NGF中和抗體、DAPT處理細胞，結(jié)果顯示，Eca109細胞的侵襲能力同樣降低，且NGF中和抗體和DAPT聯(lián)合使用的抑制作用較單獨使用也更強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.191，P<0.001)，見圖7。

圖7 NGF作用下NGF中和抗體、DAPT對Eca109細胞侵襲能力的影響 ×200A：NGF組；B：NGF+NGF中和抗體組；C：NGF+DAPT組；D：NGF+NGF中和抗體+DAPT；與NGF組比較：**P<0.01，****P<0.000 1；與NGF+NGF中和抗體+DAPT組比較：#P<0.05

3 討論

NGF發(fā)揮作用的途徑是與其兩種受體結(jié)合，分別是酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TrkA)受體和p75NTR[3]。其中，NGF能誘導(dǎo)p75NTR的裂解，伴隨γ-分泌酶調(diào)控的膜內(nèi)部裂解而釋放p75NTR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，并以γ-分泌酶依賴的方式促進其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核轉(zhuǎn)移[4]。p75NTR目前已被鑒定為食管癌干細胞的標(biāo)志物，在食管癌中，與不表達p75NTR的癌細胞相比，表達p75NTR的癌細胞具有較高的自我更新和增殖能力，且癌癥的存活和維持依賴于p75NTR的表達。表達p75NTR的癌細胞顯示出干細胞相關(guān)基因表達量的增加[5]。本課題組前期研究[6-7]中，以無血清成球培養(yǎng)法富集食管癌Eca109干細胞樣細胞，發(fā)現(xiàn)p75NTR核陽性表達的Eca109細胞球表現(xiàn)出食管癌干細胞的某些特性，且隨著細胞球p75NTR核陽性表達率的增加，其表現(xiàn)的干細胞特性增強，由此建立了p75NTR的核表達情況與食管癌干細胞的聯(lián)系，即p75NTR核表達陽性的食管癌細胞可能為食管癌干細胞。

近年來，NGF在腫瘤領(lǐng)域所發(fā)揮的作用受到越來越多的關(guān)注。在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，NGF可以促進腦腫瘤起始細胞增殖，并且NGF中和抗體可以抑制腦腫瘤起始細胞的增殖[8]；在乳腺癌組織中，NGF及其受體TrkA出現(xiàn)異常的高表達[9]；在胰腺癌組織中，NGF的表達水平遠高于正常組織，且NGF對胰腺癌細胞的生長作用取決于TrkA和p75NTR表達量的水平以及它們之間的比率[10]。腫瘤細胞是通過自分泌和旁分泌NGF，促進自身細胞增殖，在乳腺癌、胰腺癌中已經(jīng)研究確切。本課題組前期已發(fā)現(xiàn)食管癌Eca109細胞表達且自分泌NGF，在使用NGF處理細胞后檢測p75NTR的表達變化，發(fā)現(xiàn)NGF促進了p75NTR的核轉(zhuǎn)移[2]。本研究繼續(xù)探討NGF中和抗體對p75NTR核轉(zhuǎn)移的影響，進一步證實了課題組前期的發(fā)現(xiàn)。

本研究基于前期實驗結(jié)果，應(yīng)用NGF處理食管癌Eca109細胞，同時單獨或聯(lián)合使用NGF中和抗體、DAPT處理細胞，結(jié)果顯示，NGF可以促進p75NTR的核轉(zhuǎn)移，NGF中和抗體、DAPT處理Eca109細胞后，Eca109細胞中p75NTR核陽性率明顯降低，其增殖、侵襲能力也相應(yīng)被抑制，且NGF中和抗體與DAPT聯(lián)合使用較單獨使用的抑制作用更強?？傊?，NGF中和抗體、DAPT均可抑制p75NTR的核轉(zhuǎn)移，降低Eca109細胞的增殖、侵襲能力。

DAPT，γ-分泌酶的小分子抑制劑，因其有效的抗癌作用獲得廣泛關(guān)注。包括DAPT能有效減少乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)誘導(dǎo)的細胞球形成[11]；DAPT可阻斷NGF介導(dǎo)的腦腫瘤起始細胞的增殖[8]。Wang et al[12]發(fā)現(xiàn)，侵襲性腦膠質(zhì)瘤中，p75NTR發(fā)生可調(diào)控的膜內(nèi)蛋白水解，促進腫瘤的遷移和侵襲，而γ-分泌酶抑制劑的使用可明顯抑制該作用。同樣地，在結(jié)腸癌、子宮頸癌中也有相關(guān)報道[13-14]。因此，γ-分泌酶可能是癌癥中潛在的廣泛治療靶標(biāo)。然而，目前γ-分泌酶抑制劑對食管癌的影響的相關(guān)報道仍較少。

基于腫瘤干細胞理論，現(xiàn)已初步明確NGF在維持腫瘤干細胞未分化狀態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Tomellini et al[15]在探究NGF及其前體proNGF對乳腺癌干細胞的影響中，發(fā)現(xiàn)NGF或proNGF是以增加靜止/慢增殖的腫瘤干細胞對稱分裂的數(shù)量來富集乳腺癌干細胞，其受體p75NTR通過調(diào)控多能性轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)乳腺癌干細胞的自我更新，證實NGF/proNGF-p75NTR軸在調(diào)控乳腺癌干細胞的自我更新方面起著關(guān)鍵作用。本實驗證實，在食管癌中，NGF-p75NTR軸同樣參與調(diào)控食管癌干細胞的自我更新，但具體NGF-p75NTR軸發(fā)揮作用的機制及p75NTR核轉(zhuǎn)移的方式尚不清楚，有待進一步研究。