RACK1與CLIC1的相互作用鑒定

李彩紅，朱亮亮，王蓓華，周 恒，李 強(qiáng)，朱昉修，范禮斌

細(xì)胞中的氯離子通道在跨膜電位調(diào)節(jié)、跨上皮細(xì)胞運(yùn)輸以及細(xì)胞器的酸化等方面起著重要的作用[1]。胞內(nèi)氯離子通道蛋白1(chloride intracellular channel protein 1，CLIC1)是最先被研究分析的人細(xì)胞內(nèi)氯離子通道蛋白，具有核膜和質(zhì)膜氯離子通道活性[2]。CLIC1在細(xì)胞周期調(diào)控[3]、細(xì)胞器酸化[4]以及細(xì)胞遷移[5]等方面起著重要作用?；罨鞍准っ窩受體1(receptor for activated C kinase 1，RACK1)蛋白在進(jìn)化上非常保守，屬于WD重復(fù)家族的蛋白，含有7個(gè)WD40基序，構(gòu)成一個(gè)β-propeller結(jié)構(gòu)[6]。RACK1可作為支架蛋白參與蛋白質(zhì)的遷移，從而改變蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位來增加或減少蛋白質(zhì)(酶)的活性，也參與調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯和轉(zhuǎn)錄因子等的活性[7]。此外，RACK1還可募集激酶和磷酸酶等參與斑點(diǎn)連接的形成[7]。為了探究CLIC1的功能，課題組先前用酵母雙雜交的方法從HeLa細(xì)胞cDNA文庫中篩選到一個(gè)CLIC1的結(jié)合蛋白，即RACK1。該研究用GST-pulldown、免疫沉淀等方法檢測RACK1與CLIC1在體內(nèi)外的結(jié)合情況，觀察二者結(jié)合情況。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)所用的HEK 293T細(xì)胞和COS7細(xì)胞株、TG1和BL21菌株均為實(shí)驗(yàn)室自存；本實(shí)驗(yàn)所用到的質(zhì)粒pcDNA3.1-CLIC1-FLAG、pGEX-5X-3-RACK1為先前研究[8]所構(gòu)建，pcDNA3.1-RACK1-HA為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建，引物如下：上游CCAAGCTTGGGGCCACCATGACTGAGCAGATGA，下游GATATCCTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGG TAGCGTGTGCCAATGGTCA。

1.2 試劑與設(shè)備DMEM高糖培養(yǎng)基(北京賽默飛世爾科技有限公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(美國OMEGA公司)；胎牛血清(澳洲CLARK公司)；胰酶細(xì)胞消化液(含EDTA)、細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、一抗稀釋液、Lipofectamine 8000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒(上海生工生物有限公司)；質(zhì)粒小抽試劑盒(美國Axygen公司)；Opti-MEM? Medium(美國Invitrogen公司)；抗體：FLAG(F1804)(美國Sigma公司)；HA(sc-7392)、CLIC1(sc-81873)、RACK1 (sc-17754)、Mouse IgG(sc-52336)(美國Santa Cruz公司)；SuperSignal West Pico顯色試劑盒(美國Pierce公司)；IPTG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和AF488標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；谷胱甘肽瓊脂糖球珠(美國GE Healthcare公司)；A/G 瓊脂糖球珠(美國Millipore公司)；熒光封片膠(丹麥DAKO公司)；Gelx-1620凝膠成像分析系統(tǒng)(上海Bioshine科學(xué)儀器有限公司)；激光共聚焦顯微鏡(型號(hào)：LSM880，德國Zeiss公司)； BSC-II級(jí)生物安全柜(美國Thermo公司)；光吸收酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 待HEK 293T或COS7細(xì)胞長滿，PBS清洗，胰酶消化收集細(xì)胞，以1×105～2×105/cm2的密度接種到含5%胎牛血清的DMEM(100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜。

1.3.2質(zhì)粒構(gòu)建 以pcDNA3.1-RACK1-FLAG質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出含有HA標(biāo)簽的RACK1的CDS序列，并用試劑盒純化回收瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物，用HindIII和EcoRV雙限制酶水解pcDNA3.1載體和純化的PCR產(chǎn)物，然后用T4連接酶將兩者的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TG1感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)約10 h后挑取單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)抽提重組的質(zhì)粒，質(zhì)粒用HindIII、EcoRV雙限制酶酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送公司測序(通用生物系統(tǒng)有限公司)。

1.3.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 前1 d將細(xì)胞接種至六孔板中，使得次日HEK 293T或COS7細(xì)胞密度能達(dá)到約90%或50%。轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)有細(xì)胞的六孔板每孔換成2 ml新鮮完全培養(yǎng)液，然后取一個(gè)無菌離心管，于待轉(zhuǎn)染的六孔板中每孔加入所需的Opti-MEM? Medium和目的質(zhì)粒DNA，再加入適量的 Lipofectamine 8000轉(zhuǎn)染試劑，混合液均勻滴加到孔內(nèi)混勻，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用于檢測蛋白表達(dá)或24 h后用于免疫熒光制片。

1.3.4GST、GST-RACK1的表達(dá)及純化 將質(zhì)粒pGEX-5X-3或pGEX-5X-3-RACK1轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌中，挑取單克隆至含有2 ml LB培養(yǎng)基(含氨芐)中37 ℃搖菌過夜。次日取500 μl 菌液到含50 ml LB(含氨芐)擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD600為0.4～0.6；30 ℃下，分別加入適宜濃度的誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，收集細(xì)菌；細(xì)菌裂解液裂解，超聲破碎；4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝，-80 ℃凍存。分別取一管上清液離心并加入谷胱甘肽瓊脂糖球珠，于4 ℃混懸孵育2 h，孵育結(jié)束后離心棄上清液，沉淀用GST結(jié)合緩沖清洗液清洗后備用。

1.3.5GST-pulldown實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞48 h后，離心收集細(xì)胞，然后向細(xì)胞中加入適量裂解液，裂解后的上清液加入到純化好的GST或GST融合蛋白，4 ℃混懸孵育4 h，離心收集谷胱甘肽瓊脂糖珠子，珠子中加入SDS上樣緩沖液，變性后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙酰烯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

1.3.6免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞(內(nèi)源性免疫沉淀中細(xì)胞不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)，48 h后收集細(xì)胞，然后加入適量細(xì)胞裂解液，裂解結(jié)束向裂解液中加入適量的FLAG抗體，4 ℃混懸2 h。結(jié)束后加入20 μl A/G 瓊脂糖球珠，4 ℃混懸4 h。離心并收集珠子。最后加SDS上樣緩沖液變性，對(duì)照樣品(細(xì)胞裂解液)直接用SDS上樣緩沖液變性。

1.3.7免疫熒光實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后約24 h，取出長有COS7細(xì)胞的蓋玻片，用預(yù)冷的甲醇固定，然后用1%脫脂牛奶封閉，室溫一抗孵育2 h、二抗孵育1 h(一抗、二抗均用1%脫脂牛奶稀釋，稀釋比例1 ∶100)，DAPI孵育細(xì)胞3 min，最后用封片膠封片，4 ℃保存，激光共聚焦顯微鏡觀察拍攝。

1.3.8Western blot法檢測蛋白表達(dá) SDS-PAGE后，凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上(PVDF膜臨用前用甲醇活化)。PVDF膜用脫脂牛奶封閉1.5 h，然后用相關(guān)的適量一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，然后再用二抗(1 ∶2 500)室溫孵育1.5 h，最后用ECL試劑盒顯色并在蛋白成像儀上進(jìn)行拍攝。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-RACK1-HA重組質(zhì)粒構(gòu)建以pcDNA3.1-RACK1-FLAG作為模板，用PCR法將RACK1全長cDNA序列構(gòu)建到pcDNA3.1載體中。構(gòu)建的重組質(zhì)粒雙酶切(HindIII、EcoRV)4 h后，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖1A)。圖中酶切后的質(zhì)粒呈現(xiàn)兩條DNA帶，下端的DNA帶分子量與預(yù)測的RACK1全長序列分子量一致。構(gòu)建的質(zhì)粒送公司測序，測定的序列與RACK1全長序列相同(圖1B)。

圖1 pcDNA3.1-RACK1-HA重組質(zhì)粒構(gòu)建A：pcDNA3.1-RACK1-HA重組質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果；M：λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker；1～4：隨機(jī)挑取的細(xì)菌克隆的質(zhì)粒DNA；B：pcDNA3.1-RACK1-HA重組質(zhì)粒中全長RACK1序列測序結(jié)果

2.2 CLIC1與RACK1可在體外結(jié)合轉(zhuǎn)染CLIC1-FLAG的HEK 293T細(xì)胞經(jīng)裂解后，裂解液與預(yù)先純化好的GST和GST-RACK1融合蛋白在4 ℃混懸儀孵育(孵育前取適量裂解液作為對(duì)照)，樣品經(jīng)Western blot檢測后，結(jié)果見圖2，用FLAG抗體印跡后，細(xì)胞裂解液中有較強(qiáng)的CLIC1表達(dá)(27 ku)(圖2A，泳道1)。對(duì)照組(圖2A，泳道2)無蛋白帶，顯示GST不能結(jié)合CLIC1-FLAG；而樣品組中GST-RACK1可以結(jié)合CLIC1-FLAG(圖2A，泳道3)。圖2B顯示共孵育溶液中GST(25 ku)(泳道2)和GST-RACK1(62 ku)(泳道3)。此結(jié)果表明CLIC1可在體外結(jié)合RACK1。

圖2 CLIC1與RACK1的GST-pulldown結(jié)果1：pcDNA3.1-CLIC1-FLAG的細(xì)胞裂解液；2：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CLIC1-FLAG的細(xì)胞裂解液與已純化的GST共孵育；3：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CLIC1-FLAG的細(xì)胞裂解液與已純化的GST-RACK1共孵育

2.3 CLIC1可體內(nèi)結(jié)合RACK1將pcDNA3.1-CLIC1-FLAG與pcDNA3.1-RACK1-HA兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞48 h后，裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液(Lysates)經(jīng)FLAG抗體孵育和A/G瓊脂糖球珠沉淀后，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果見圖3。從圖3中可以看到，F(xiàn)LAG抗體沉淀中存在RACK1(泳道4)，而對(duì)照中(泳道3)不存在。此結(jié)果表明過表達(dá)的CLIC1和RACK1可在HEK 293T細(xì)胞中結(jié)合。

圖3 RACK1與CLIC1的免疫共沉淀結(jié)果1：載體pcDNA3.1和pcDNA3.1-CLIC1-FLAG共轉(zhuǎn)的細(xì)胞裂解液；2：pcDNA3.1-RACK1-HA和pcDNA3.1-CLIC1-FLAG共轉(zhuǎn)的細(xì)胞裂解液；3：載體pcDNA3.1和pcDNA3.1-CLIC1-FLAG共轉(zhuǎn)的細(xì)胞裂解液與FLAG抗體以及A/G瓊脂糖球珠孵育后的沉淀；4： pcDNA3.1-RACK1-HA和pcDNA3.1-CLIC1-FLAG共轉(zhuǎn)的細(xì)胞裂解液與FLAG抗體以及A/G瓊脂糖球珠孵育后的沉淀

為了確定細(xì)胞中內(nèi)源性的CLIC1和RACK1是否可以結(jié)合，本研究直接裂解HEK 293T細(xì)胞，裂解液(Lysate)與RACK1抗體孵育(對(duì)照與鼠IgG孵育)，然后用A/G瓊脂糖球珠沉淀，最后進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果(圖4)表明293T細(xì)胞均含有豐富的CLIC1和RACK1蛋白(泳道1)，RACK1抗體沉淀中含有CLIC1(泳道3)，而對(duì)照抗體沉淀中沒有CLIC1(泳道2)。

圖4 RACK1與CLIC1的內(nèi)源性免疫沉淀結(jié)果1：HEK 293T細(xì)胞裂解液；2：鼠IgG和A/G瓊脂糖球珠與細(xì)胞裂解液孵育后的沉淀；3：RACK1抗體和A/G瓊脂糖球珠與細(xì)胞裂解液孵育后的沉淀

上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在細(xì)胞中CLIC1可與RACK1結(jié)合。

2.4 RACK1與CLIC1在COS7細(xì)胞中的定位蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的共定位可為蛋白質(zhì)之間的結(jié)合提供進(jìn)一步的證據(jù)。為此，本研究在COS7細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pcDNA3.1-RACK1-HA和pcDNA3.1-CLIC1-FLAG，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行免疫熒光制片，并用熒光顯微鏡觀察拍攝。結(jié)果表明，在COS7細(xì)胞中，CLIC1和RACK1在胞質(zhì)中具有明顯的共定位(圖5)。

圖5 RACK1與CLIC1在COS7細(xì)胞中的共定位 ×400A-C：過表達(dá)的pcDNA3.1-RACK1-HA在細(xì)胞中的分布；D-G：過表達(dá)的pcDNA3.1-CLIC1-FLAG和pcDNA3.1-RACK1-HA的共定位；AF488：綠色(pcDNA3.1-RACK1-HA)；DAPI：藍(lán)色(細(xì)胞核)；TRITC：紅色(pcDNA3.1-CLIC1-FLAG)；MERGE：疊加

3 討論

RACK1是一個(gè)進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)，主要由7個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域組成[6]，許多實(shí)驗(yàn)都表明RACK1是一個(gè)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種功能的支架蛋白。例如RACK1可以介導(dǎo)蛋白激酶C β轉(zhuǎn)移到合適的胞內(nèi)部位，并活化PKCβ[6]；已報(bào)道的RACK1結(jié)合蛋白基本上都是與RACK1羧端的WD40結(jié)構(gòu)域結(jié)合，例如β整合素蛋白、Src激酶等[6]。本研究中過表達(dá)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)也表明CLIC1與RACK1的羧端結(jié)合(結(jié)果尚未發(fā)表)。

研究發(fā)現(xiàn)的一類氯離子通道蛋白(chloride intracellular channel，CLIC)家族由7個(gè)成員組成，成員之間的序列相同性介于47%～76%[9]，均具有介導(dǎo)氯離子跨膜運(yùn)輸和谷氧化還原蛋白樣(glutaredoxin-like)活性[10]。不同的CLIC蛋白在細(xì)胞內(nèi)也具有自身特有的功能，例如胞內(nèi)氯離子通道蛋白4(chloride intracellular channel protein 4，CLIC4)在細(xì)胞中過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[11]。CLIC1含有一個(gè)保守的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶折疊并具有該酶活性，受到氧化時(shí)，CLIC1可形成二聚體并與其通道活性密切相關(guān)[12]。CLIC1是作為細(xì)胞內(nèi)的氯離子通道而被分析鑒定的，它可以在人工膜中形成離子通道，其通道活性受到pH的影響。有研究[5]顯示CLIC1可以影響腫瘤細(xì)胞的遷移性，而且對(duì)其機(jī)制有所了解。有研究[13]表明定位于質(zhì)膜的CLIC1可以募集胞質(zhì)中的PIP5K1A和PIP5K1C到質(zhì)膜的前移部位，產(chǎn)生富含PIP2的微結(jié)構(gòu)域以誘導(dǎo)整合素介導(dǎo)的細(xì)胞-基質(zhì)黏附并發(fā)出細(xì)胞骨架延伸的信號(hào)，啟動(dòng)“PIP2-talin-integrin”信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)黏附形成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中對(duì)細(xì)胞的片狀偽足和絲狀偽足進(jìn)行時(shí)空調(diào)控，此結(jié)果初步闡明了CLIC1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的一個(gè)可能的機(jī)制。由于RACK1和CLIC1在細(xì)胞質(zhì)膜上都有分布(本實(shí)驗(yàn)表明CLIC1存在于多種細(xì)胞的質(zhì)膜上)，而且RACK1可以介導(dǎo)蛋白激酶C轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜并活化蛋白激酶C，這些為進(jìn)一步研究RACK1和CLIC1在細(xì)胞質(zhì)膜上的關(guān)系并探討其功能提供了重要線索。

在血清刺激后，細(xì)胞中RACK1表達(dá)明顯上調(diào)，提示RACK1可能參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)[6]，而CLIC1也參與細(xì)胞周期中G2/M期的轉(zhuǎn)變[4]，且在許多腫瘤細(xì)胞中CLIC1都是高表達(dá)的[14]，因此在未來的研究中有必要詳細(xì)解析RACK1和CLIC1的相互作用對(duì)細(xì)胞周期影響的機(jī)制。

本研究利用GST-pulldown、免疫共沉淀以及間接免疫熒光顯微技術(shù)證明RACK1與CLIC1可以在細(xì)胞中相互結(jié)合。